Определение амилолитической способности (АС) ферментных препаратов

 

Необходимые реактивы и посуда:

0,1 М раствор уксусной кислоты, 0,1 М раствор ацетата натрия, ацетатный буферный раствор (смешивают равные объемы 0,1 М растворов уксусной кислоты и ацетата натрия), фосфатный буферные раствор рН 6,0 (смешивают 1⁄15 М раствор натрия фосфорнокислого двухзамещенного и 1⁄15 М раствор калия фосфорнокислого однозамещенного в соотношении 1:90), 0,1 М раствор соляной кислоты, основной раствор йода (0,5 г кристаллического йода и 5 г йодистого калия растворяют в небольшом количестве дистиллированной воды, доводят до 200 см³ в мерной колбе), рабочий раствор йода (2 см³ основного раствора йода разводят 1,0 М раствором соляной кислоты в мерной колбе вместимостью 100 см³), 1% раствор крахмала.

Конические колба вместимостью 250 см³, мерные колбы вместимостью 100 и 200 см³, пипетки вместимостью 1, 5, 50 см³, пробирки диаметром 2 см и высотой 18 см, термостат или водяная баня, фотоэлектроколориметр, кювета шириной 10 мм, аналитические весы, фильтровальная бумага, стеклянные воронки.

Для анализа необходимо 0,1 г ферментного препарата.

 

Техника определения

За единицу амилолитической способности (АС) принимают такое количество фермента, которое катализирует гидролиз 1 г растворимого крахмала до декстринов различной молекулярной массы за 60 минут при температуре 30 ºС и рН 4,7 (для грибных ферментных препаратов) или 6,0 (для бактериальных ферментных препаратов).

Определение амилолитической способности проводится по йодкрахмальной реакции колориметрическим методом.

Приготовление основного раствора фермента. На аналитических весах взвешивают 0,1 г ферментного препарата в стеклянном стакане, размешивают с небольшим количеством дистиллированной воды и количественно переносят в мерную колбу на 100 см³, объем доводят до метки, раствор перемешивают и при необходимости фильтруют.

Из основного раствора ферментного препарата готовят рабочий раствор путем разбавления дистиллированной водой в соответствии с таблицей 6.1.

 

Таблица 6.1

Разбавление основного раствора ферментного препарата для получения рабочего раствора

 

Предполагаемая АС препарата, ед⁄г	Количество препарата в 5 см³ рабочего раствора, мг	Объем основного раствора, необхо–димый для раз–бавления, см³	Общий объем рабочего раствора препарата, см³
От 150 до 300	1,000
От 301 до 700	0,500
От 701 до 1200	0,250
От 1201 до 2500	0,125
От 2501 до 5000	0,050
От 5001 и более	0,025

 

Выбранный объем основного раствора ферментного препарата помешают в мерную колбу вместимостью 200 см³ и доводят объем до метки дистиллированной водой.

Гидролиз крахмала проводят следующим образом. В две пробирки отмеривают по 10 см³ 1 % буферного раствора крахмала (рН 4,7 для анализа грибных ферментных препаратов и рН 6,0 для анализа бактериальных ферментных препаратов). Пробирки помещают в термостат или водяную баню с температурой 30º С на 10 минут. Затем в первую опытную пробирку добавляют 5 см³ рабочего раствора ферментного препарата, во вторую контрольную добавляют 5 см³ дистиллированной воды. Содержимое пробирок сразу перемешивают, пробирки выдерживают в термостате 10 минут для гидролиза крахмала. Затем из каждой пробирки отбирают по 0,5 см³ субстрата и переносят в две конические колбы вместимостью 250 см³ с пердварительно налитыми в колбы 50 см³ рабочего раствора йода в соляной кислоте. Содержимое колб перемешивают. При этом происходит инактивация амилолитических ферментов и йодкрахмальная реакция. Контрольный раствор приобретает синюю окраску, опытный – фиолетово–бурую окраску в зависимости от количества прогидролизованного крахмала. В случае, если окраска опытного раствора останется синей, необходимо увеличить концентрацию ферментного препарата в рабочем растворе. В случае, если окраска опытного раствора станет желтой, необходимо уменьшить количество ферментного препарата в рабочем растворе.

В окрашенных растворах определяют оптическую плотность на ФЭКе при красном светофильтре (λ = 656 нм, кювета с шириной грани 10 мм). В качестве раствора сравнения используют воду.

Разница между показателями оптической плотности контрольного и опытного растворов соответствует количеству прогидролизованного крахмала под действием амилолитических ферментов.

Количество прогидролизованного крахмала субстрата (С, в г) рассчитывают по формуле 6.6:

С = , (6.6)

 

где: 0,1 – количество крахмала, взятое для анализа в качестве

субстрата, г;

D₁ – оптическая плотность контрольного раствора;

D₂ – оптическая плотность опытного раствора.

 

Если количество С прогидролизованного крахмала составит меньше 0,02 г или больше 0,07 г, то испытание повторяют с другим количеством основного раствора фермента.

Аммилолитическую способность (АС, ед/г) ферментных препаратов рассчитывают по формулам 6.7 и 6.8:

Для бактериальных ферментных препаратов:

 

АС = [5, 885 • С – 0,001671] • 1000 ⁄ п (6.7)

 

Для грибных ферментных препаратов:

 

АС = [ 7,264 • С – 0,03766]• 1000 ⁄ п (6.7)

 

где: 1000 – пересчет миллиграммов в граммы;

п – количество ферментного препарата, взятое для анализа,

мг (см. таблицу 6.1.)