ТЕМА 2. СОРТИРОВКА И МОДИФИКАЦИЯ БЕЛКОВ

Рассмотрим особенности синтеза тех белков, которые образуются мембраносвязанными рибосомами. Как уже отмечалось это «экспортные», мембранные и лизосомальные белки. Сюда также входят белки пероксисом.

В формировании всех этих белков ключевую роль играют:

- во-первых, гранулярная, или шероховатая ЭПС (эндоплазматическая сеть),

- во-вторых, комплекс Гольджи.

Благодаря этим структурам, происходят два дополнительных (помимо трансляции и фолдинга) процесса:

- специфическая сортировка (вместе с направленным транспортом) и

- модификация новообразованных белков.

 

2.1. Процессы в гранулярной ЭПС

2.1.1. Структура гранулярной ЭПС

Как известно, ЭПС (эндоплазматическая сеть), или ЭР (эндоплазматический ретикулум), на электронных микрофотографиях выглядит в виде множествамембранных цистерн (мешочков), трубочек и пузырьков.

На самом же деле практически все эти структуры представляют собой единый непрерывныйкомпартмент (отсек), отграниченный мембраной от гиалоплазмы. Этот компартмент образует всевозможные инвагинации и складки, которые и воспринимаются на срезе как отдельные трубочки, пузырьки и расположенные параллельно друг другу плоские цистерны.

Лишь некоторые пузырьки могут быть действительно отшнурованными от данного компартмента. Это «транспортные средства», направляющиеся с порцией новосинтезированных белков к комплексу Гольджи для дальнейших процессов сортировки и модификации.

ЭПС подразделяется на гладкую и гранулярную(шероховатую). Особенность последней состоит в том, что со стороны гиалоплазмы она покрыта рибосомами,что и придает ей характерный шероховатый вид. Эти рибосомы и называются мембраносвязанными— в отличие от свободных, находящихся в гиалоплазме.

Таким образом, при образовании «экспортных» и других рассматриваемых белков (мембранных, лизосомальных, пероксисомальных) трансляцияпроисходит на гранулярной ЭПС.

По некоторым данным, имеет значение и локализация этой ЭПС: «экспортные» белки синтезируются в одних областях гранулярной ЭПС, мембранные белки — в других, лизосомальные — в третьих.

В то же время используемые при этом рибосомы ничем не отличаются от свободных рибосом. Мембранносвязанными они становятся только в процессе трансляции. Вне данного процесса рибосомы находятся в виде отдельных субъединиц. А объединение последних происходит только при инициации трансляции, т. е. при образовании комплекса с мРНК и инициирующей аа-тРНК.

Поэтому, говоря как о свободных, так и о мембраносвязанных рибосомах, подразумевается, что те и другие находятся в состоянии трансляции, и, следовательно, связаны с мРНК и синтезируемым пептидом. При этом нередко рибосомы входят в состав полисом — также свободных или мембраносвязанных.

Отдельные же субъединицы рибосом с ЭПС никогда не связаны.

Рассмотрим особенности трансляции на гранулярной ЭПС с учетом этих замечаний.

2.1.2. Особенности трансляции

При трансляции «экспортных» и других подобных (по механизму синтеза) белков встают две проблемы:

- связывание начавшей трансляцию свободной рибосомы с мембраной ЭПС (причем, видимо, в определенной области ЭПС);

- проникновение синтезируемого пептида во внутреннее пространство ЭПС.

В решении обеих этих проблем ключевую роль играет т. н. сигнальная последовательность (СП) (рис.2.1), с которой всегда начинается первичная полипептидная цепь любого рассматриваемого здесь белка.

	Рис. 2.1. Структура сигнальной последовательности аминокислот

 

 

СП находится с N-конца пептидной цепи и включает 15-35 аминокислотных остатков. В начале и в конце СП расположены остатки с полярными радикалами, в середине же — с неполярными, а значит гидрофобными. Это обеспечивает взаимодействие СП с соответствующими слоями мембраны ЭПС. В частности, гидрофобные радикалы СП оказываются «как дома» в липидном бислое, составляющем основу данной мембраны.

В окончательной же структуре белка СП отсутствует. Она отщепляется специальной пептидазой после проникновения всей полипептидной последовательности белка во внутреннее пространство ЭПС.

Последовательность событий при трансляции показана на рис. 2.2.

а) Вначале в гиалоплазме собирается инициаторный комплекс, включающий мРНК одного из рассматриваемых белков, рибосому и инициирующую аа-тРНК.

Начинается трансляция, и рибосома, оставаясь свободной, синтезирует СП.

б) В гиалоплазме имеются специальные СП-узнающие частицы (SPR — signal recognition particles). Они представляют собой комплексы РНК-белок.

Когда на свободной рибосоме появляется СП, одна из таких частиц связывается с рибосомой и останавливает трансляцию.

В свою очередь, образующийся комплекс мРНК-рибосома-СП-SRР становится способным (благодаря двойной «валентности» SRР) связываться с т. н. докинг-белками, которые находятся на цитоплазматической поверхности мембраны ЭПС.

Так решается первая из указанных выше проблем — связывание рибосомы с ЭПС. При этом СП играют роль «меток», которые определяют, какие именно из транслирующих свободных рибосом должны быть прикреплены к ЭПС.

Возможно, одновременно узнается (с помощью РНК, входящей в SRР), и какой-то локус транслируемой мРНК. Это могло бы объяснить то отмеченное выше обстоятельство, что синтез белков разного назначения происходит в разных областях ЭПС.

В результате на данном этапе происходит первый этап сортировки будущих белков:

- с помощью прикрепления части рибосом к ЭПС и,

- возможно, путем распределения прикрепляющихся рибосом по разным областям ЭПС.

в) Затем СП, видимо, проникает (за счет своих гидрофобных радикалов) в липидную фазу мембраны ЭПС на всю ее глубину. И после этого начинает служить организатором, вокруг которого особым способом группируются мембранные белки. В ходе этого взаимодействия происходит гидролиз ГТФ, а SRР возвращается в гиалоплазму.

В результате в месте нахождения СП мембранные белки образуют канал — т.н. полипептид-транслоцирующую пору (или транслокон).

г) Трансляция возобновляется (из-за диссоциации SRР), и все удлиняющаяся полипептидная цепь начинает протягиваться через пору во внутреннее пространство ЭПС.

При этом СП остается фиксированной в области поры (что, вероятно, сохраняет структуру канала). Так что в этом месте проникающая пептидная цепь образует петлю.

Из сказанного вытекает, что при данном механизме трансляции не рибосомы движутся по мРНК (как нередко бывает в случае свободных полисом), а, наоборот, мРНК перемещается относительно «заякоренных» на ЭПС рибосом. А синтезируемая полипептидная цепь вообще имеет двойную фиксацию: к поре (через СП, с N-конца) и к рибосоме (с С-конца).

д) По окончании трансляции цепь теряет фиксацию с обеих сторон: с С-конца — за счет отделения от рибосомы, а с N-конца — за счет сигнальной пептидазы, отщепляющей СП.

Таким образом, она высвобождается в пространство ЭПС, где происходит ее фолдинг. В этом, как обычно, принимают участие фолдазы и шапероны. Те и другие должны находиться внутри ЭПС. Что касается одной из фолдаз — протеиндисульфидизомеразы, то хорошо известно, что она связана, в основном, с ЭПС.

2.1.3. Модификация белков в ЭПС

Многие из белков, чей синтез здесь рассматривается, в зрелом состоянии являются гликопротеинами, т. е. содержат углеводный компонент. Последний обычно представлен одной или несколькими разветвленными олигосахаридными цепочками.

Примерами таких гликопротеинов среди «экспортных» белков являются некоторые белки плазмы (напр. кислый a₁-гликопротеин); среди мембранных белков — гликофорин (содержится в мембране эритроцитов), многие антигенные детерминанты, транслоказы (белки-переносчики), рецепторы к гормонам и т. д.; а также почти все лизосомальные ферменты.

Как оказалось, углеводные компоненты подобных белков имеют сходный план строения. Cходной является и последовательность событий, ведущих к образованию этих компонентов.

Эти события начинаются в гиалоплазме, продолжаются во внутреннем пространстве ЭПС и завершаются в аппарате Гольджи. Рассмотрим начальные cтадии гликозилирования.

а) В гиалоплазме образуется одинаковая для всех белков «заготовка» - раз-ветвленное олигосахаридное ядро из 14 мономеров (рис. 2.3.). В него входят 2 остатка N-ацетилглюкозамина, 9 остатков маннозы и 3 остатка глюкозы.

 

 

 

Рис. 2.3. Гликозилирование белков в ЭПС

 

 

Синтез происходит путем последовательного присоединения моносахаридных остатков к специальному липидоподобному веществу - долихолфосфату, которое представляет собой длинную углеводородную цепочку (включающую около 100 С-атомов), поэтому является гидрофобным и легко проходит через мембраны.

б) С помощью долихолфосфата олигосахаридные ядра транспортируются из гиалоплазмы во внутреннее пространство ЭПС.

Здесь специальная трансфераза переносит эти ядра от долихолфосфата на вновь синтезированные белки — после завершения их трансляции и фолдинга.

Связывание олигосахарида с пептидной цепью происходит через амидную (NН₂—СО-) группу остатка аспарагина. Поэтому такой процесс обозначается как N-гликозилирование.

Еще известно О-гликозилирование: при этом олигосахарид связывается через гидроксигруппу (ОН-) серина или треонина. Но О-гликозилирование осуществляется лишь в аппарате Гольджи.

В результате же N-гликозилирования соответствующие белки приобретают одно или несколько стандартных олигосахаридных ядер.

в) В ЭПС могут происходить и другие виды модификации белков. Так, очень важная модификация (особенно при образовании коллагена) — гидроксилированиеостатков пролина и лизина. Оно осуществляется специальным ферментным комплексом, для функционирования которого требуется аскорбиновая кислота.

г) Последнее, что происходит с формирующимися белками в ЭПС, — «упаковка» их в транспортные пузырьки(рис. 2.4).

 

 

 

Рис. 2.4. Выведение новосинтезированных белков из ЭПС

 

Эти пузырьки, видимо, образуются в местах высокой концентрации гликозилированных белков внутри ЭПС. Мембрана ЭПС здесь начинает все больше и больше выгибаться во внешнюю сторону и, наконец, отшнуровывается в виде пузырька. В последнем оказывается высококонцентрированный раствор белков.

С внешней (цитоплазматической) поверхности пузырьки покрыты особым белком -клатрином - и потому иногда называются окаймленными. Клатрин образует как бы дополнительную оболочку, но она имеет не сплошную, а решетчатую структуру. Данный белок всегда оказывается на внешней поверхности тех участков мембраны (в т. ч. плазматической), которые способны к инвагинации и отшнуровыванию. Видимо, клатрин и придает данным участкам мембраны эти свойства.

Транспортные пузырьки, отпочковавшиеся от ЭПС, диффундируют к комплексу Гольджи и сливаются с его мембранами. В итоге первично гликозилированные белки оказываются во внутреннем пространстве этого комплекса.

2.2. Процессы в комплексе Гольджи

2.2.1. Структура и функции комплекса Гольджи

Основная часть комплекса Гольджи (рис. 2.5) - это скопление плоских мембранных цистерн, лежащих параллельно друг другу. Каждое такое скопление называется диктиосомой. В клетке может быть много диктиосом, соединенных друг с другом цистернами и трубочками.

В непосредственной близости от диктиосомы обычно находится множество мембранных пузырьков.

Одни из них перемещаются от ЭПС к комплексу Гольджи.

При этом обращенная сюда (к ЭПС) сторона диктиосомы называется проксимальной, или цис-полюсом.

 

 

Рис. 2.5. Комплекс Гольджи и его связь с ЭПС

 

От противоположной же стороны диктиосомы отшнуровываются другие пузырьки. Одни из них содержат гидролитические ферменты и представляют собой первичные лизосомы. Прочие пузырьки транспортируют «экспортные» и (или) мембранные белки; они перемещаются к плазмолемме и затем сливаются с ней.

Соответствующая сторона диктиосомы (от которой отделяются пузырьки с готовыми белковыми продуктами) называется дистальной, или транс-полюсом.

Таким образом, в диктиосоме созревающие белки постепенно перемещаются от проксимальной части к дистальной.

В комплексе Гольджи с белками продолжаются два уже знакомых процесса: их модификация и сортировка.

Важной составной частью модификации является специфическая для каждого вида белков перестройка углеводного компонента. После того как в ЭПС белки приобретали одинаковое олигосахаридное ядро, в аппарате Гольджи это ядро подвергается различным изменениям.

Так, почти всегда удаляются последний остаток глюкозы и несколько остатков маннозы. Для некоторых белков на этом перестройка и заканчивается.

В других случаях к определенным местам «ядра» присоедняются те или иные дополнительные остатки — галактозы (и ее производных), нейраминовой кислоты (или такой ее производной, как сиаловая кислота) и т. д.

Кроме того, иногда путем О-гликозилирования формируются новые олигосахаридные ветви.

Все это делает еще более индивидуальным и неповторимым «облик» созревающего белка, что имеет важные последствия — в частности, облегчает сортировку белков.

2.2.2. Сортировка белков

Рассмотрим процесс сортировки для различных видов белков:

1. Белки ЭПС. При отшнуровывании пузырька от цистерны ЭПС в нем случайно могут оказаться и такие белки, местом «службы» которых является ЭПС. Это, например, ферменты фолдинга (фолдазы), шапероны, ферменты N-гликозилирования и гидроксилирования.

Очевидно, такие белки должны вернуться из аппарата Гольджи обратно в ЭПС. Оказалось, они имеют сходную последовательность из 4-х аминокислотных остатков:

-Лиз – Асп – Глу – Лей -

По ней белки опознаются и собираются в специальные пузырьки, возвращающиеся в ЭПС.

2. Ферменты лизосом.По какому признаку узнаются в аппарате Гольджи формирующиеся белки лизомом, пока неизвестно. Скорее всего, таким маркером тоже служит какая-нибудь аминокислотная последовательность.

Но после «опознания» этих белков происходит их дополнительное «мечение» — с помощью специфической модификации, олигосахаридного компонента. А именно фосфорилируется один из остатков маннозы.

На внутренней поверхности мембраны аппарата Гольджи в некоторых местах имеются рецепторы к маннозофосфату.Поэтому здесь собираются лизосомальные ферменты, и их взаимодействие с рецепторами, видимо, является стимулом к началу образования и отпочковывания пузырька (рис. 2.6).

В мембране, помимо рецепторов, есть также протонные насосы,создающие внутри будущих лизосом кислую среду. Снижение рН в пузырьках приводит к диссоциации лизосомальных ферментов от рецепторов. После чего рецепторы группируются в кластеры и удаляются из лизосомы в составе мелких пузырьков, чтобы вернуться в аппарат Гольджи для «улавливания» очередных лизосомальных ферментов.

3. Мембранные белки. Будущие инте-гральные белки мембран, видимо, отсортировываются еще в процессе трансляции. Полагают, что они не протягиваются полностью через пору в мембране ЭПС, а так и остаются фиксированными в данной мембране (рис. 2.7).

Это происходит благодаря наличию протяженного гидрофобного участка в средней части полипептидной цепи. По окончании трансляции и отщепления СП (сигнальной последовательности) N-конец такой цепи оказывается в просвете ЭПС, а С-конец — на цитоплазматической поверхности.

В более сложных случаях после отщепления первой СП в белке как с N-, так и с С-конца могут обнаруживаться и другие СП, протягивающие соответствующий конец через мембрану. Тогда пептидная цепь не один, а несколько раз «прошивает» мембрану. И может получиться так, что N-конец находится на ее цитоплазматической поверхности, а С-конец — в просвете ЭПС или что оба конца — на какой-нибудь одной поверхности мембраны.

Затем эти белки (вместе с окружающим участком мембраны) последовательно оказываются:

- в стенке транспортного пузырька, перемещающегося от ЭПС к аппарату Гольджи;

- в мембране цистерн этого аппарата;

 

- в стенке транспортного пузырька, перемещающегося к плазматической (или иной) мембране и сливающегося с ней.

Так, в конце концов, мембранные белки достигают места своего назначения.

При этом все время сохраняется полярность мембран и ориентация в них интегральных белков. Например, внутренняя поверхность мембран ЭПС, аппарата Гольджи, пузырьков и лизосом соответствует по полярности внешнейповерхности плазматической мембраны. С учетом этого и происходит формирование пузырьков из одних мембран и последующее слияние пузырьков с другими мембранами.

Вместе со встраиванием в мембрану ЭПС новых белков происходит включение в нее и новых липидных молекул. Это приводит к увеличению площади мембраны, что и создает ее избыток, необходимый для отшнуровывания части мембраны в вики.