Системы оптического детектирования

В зависимости от типа используемой оптической системы, различают два способа для определения седиментационных свойств молекул: наблюдение за изменением концентрации вещества или за изменением его градиента вдоль ячейки. Три типа оптических систем используются для этих целей. Шлиреновская оптическая система выявляет движение границы в виде зависимости градиента показателя преломления от радиуса, релеевская – в виде зависимость показателя преломления от радиуса, абсорбционная оптическая система – в виде зависимости поглощения от радиуса.

Изобретение первой системы Филпотом и Свенсоном было главным достижением в разработке метода аналитического центрифугирования, без которого этот метод, возможно, никогда не стал бы таким полезным. Система иногда именуется шлиреновской оптической системой (от немецкого слова schlieren, означающего «полоса или щель»). Если на пути пучка света есть вещество с градиентом показателя преломления, которое как призма отклоняет проходящие через него лучи света, то в этом месте изображение горизонтальной щели сместится и через наклонную щель пройдет выше или ниже оптической оси, получив при этом смещение вправо или влево на расстояние, определяемое углом наклона щели. Чем резче граница и чем больше наклон щели, тем более острый максимум получается на градиентной кривой. Высота максимума пропорциональна величине dn/dr и тангенсу угла наклона щели. Таким образом, шлиреновская оптика обеспечивает измерение градиента показателя преломления, dn/dr, как функцию радиального расстояния, r, непосредственно в кювете. Заметим, что если бы не было наклонной щели, то изображение кюветы не зависело бы от наличия градиента

Однако, шлиреновская оптическая система, доминировавшая над другими в течение 70 лет, по-видимому ушла в историю, в основном из-за необходимости большой концентрации образца (3-5 мг·мл^-1). Многие блестящие работы, включая открытие рибосом, были сделаны при использовании этой оптики (рис. 24.4).

Рис. 24.4 Профили седиментации a) 70S рибосом E. coli и б) 30S и 50S рибосомных субчастиц, полученные в растворе с помощью шлиреновской оптической системы.

Современные ультрацентрифуги, такие как Beckman XL содержит только две оптические детекторные системы: оптику для поглощения в ультрафиолетовой (UV) области и реллеевскую интерференционную оптику. Шлиреновский профиль седиментации (зависимость градиента показателя преломления от радиуса ячейки) может быть получен прямым дифференцированием зависимости показателя преломления, либо оптической плотности от радиуса.

Абсорбционные оптические системы основаны на пропорциональности, существующей между концентрацией растворенного вещества и его оптической плотностью. Большинство биологических макромолекул поглощают свет в ближней UV области. Нуклеиновые кислоты имеют пик поглощения в области спектра 258 - 260 нм, в то время как белки характеризуются поглощением около 280 нм. На рисунке 24.5 показан типичный профиль седиментации, измеренный с помощью абсорбционной оптической системы. Его принципиальное отличие от ранних центрифуг – возможность получения большого числа сканов (несколько десятков).

Рис. 24.5. Типичный профиль седиментации молекулы, полученный с помощью абсорбционной оптической системыультрацентрифуги Beckman XL

Интерференционная оптическая система базируется на релеевском интерферометре. Интерференция света в интерферометре Релея происходит при расщеплении луча когерентного света (на практике от одного источника) на два, каждый из которых проходит оба сектора двухсекторной ячейки. После прохождения ячейки два луча смешиваются, образуя интерференционную картину. Если оба сектора содержат идентичные растворы, интерференционная картина представляет собой прямые полосы. Однако, когда один сектор содержит растворитель, а другой ‒ раствор макромолекул, полосы искривляются пропорционально разности концентраций между образцом и растворителем. Образуется интерференционная картина, каждая интерференционная полоса которой является кривой зависимости показателя преломления от расстояния

Система может быть использована для макромолекул, которые слабо поглощают в UV и в видимой областях. На рисунке 24.6 a показан ход лучей от образца, полученный с помощью этой оптики, а на рисунке 24.6 б – зависимость показателя преломления как функция радиуса, вычисленная с помощью программного обеспечения ультрацентрифуги XL.

Рис. 24.6. Типичный профиль седиментации, измеренный интерференционной оптикой. a) Интерференционная картина получена при помощи интерферометра Релея. Различие в показателе преломления (Δn) для двух точек ячейки может быть вычислено исходя из числа полос, N, пересекающих эти точки зависимости N = a(Δn)/λ, где a ‒ это толщина ячейки, а λ ‒ длина волны используемого света. Поскольку показатель преломления пропорционален концентрации вещества, то число полос может быть использовано для определения концентрации как функции радиуса в ячейке; б) Графическое представление интерференционных полос как функции радиуса, полученное при помощи программного обеспечения XL-I центрифуги

Значительно более высокую чувствительность можно получить при использовании флуоресцентнго детектора (FDS, от английского fluorescence detected sedimentation), так как необходимая в этом случае концентрация вещества на несколько порядков ниже, чем при использовании UV-абсорбционной оптики. Более того, молекулы с различными флуорофорами могут быть зарегистрированы селективно, даже если они присутствуют как минорные компоненты в смеси соединений. Пример работы центрифуги с флуоресцирующей оптикой дан на следующем рисунке, где показан профиль седиментации зеленого флуоресцирующего белка при концентрации 40 нМ (молекулярная масса белка 30.840 Дa). На этом же рисунке показан седиментационный профиль этого же белка, полученный с использованием оптики поглощения при концентрации 16 μМ. Следует заметить, что два этих эксперимента приводят к несколько разным значениям вычисляемой молекулярной массы. Так эксперименты по поглощению дают М=29.520 Да (s = 2.83S), тогда как использование флуоресценции приводит к несколько заниженным величинам (М =27.297 Да и s = 2.71S). Причины такого расхождения пока не известны, однако из общих соображений следует, что все они связаны с неоднозначной зависимостью между концентрацией и флуоресценцией (фотобличинг, вариации квантового выхода, выделение флуоресцентного сигнала, гашение флуоресцентного сигнала некоторыми атомами, например О₂).

Рис. Raw absorbance data at 280 nm for 16 μM GFP, one out of every 10 scans is displayed (panel A). c(M) of absorbance data (panel B), 100 scans were used for the c(M) analysis. Raw AU-FDS data for 40 nM GFP (panel C). One out of every 50 scans is (more ...)

Rachel R. Kroe¹ and Thomas M. Laue² Anal Biochem. 2009 July 1; 390(1): 1–13.

В заключение этого параграфа укажем на простую возможность введения флуоресцентных меток в рекомбинантные белки, которые на одном из своих концов содержит олигогистидин, на который можно методами координационной химии посадить флуоресцентную метку.