Коэффициенты седиментации биологических макромолекул

Коэффициенты седиментации биологических макромолекул обычно измеряют в буферных растворах, вязкость и плотность которых может отличаться от таковых у воды. Коэффициенты седиментации могут измеряться также при разных температурах. Поэтому принято приводить реальные данные к «стандартным условиям», в качестве которых выбирается чистая вода при 20^оC:

(24.25)

где s_20,w – коэффициент седиментации молекулы в воде при 20^oC, s_экс ‒ экспериментально полученный коэффициент седиментации молекулы, η_экс ‒ вязкость растворителя при заданной температуре T(^oC), η_20,w ‒ вязкость воды при 20^oC, ρ_20,w ‒ плотность воды при 20^oC, ‒ парциальный удельный объем молекулы. Отметим, что величина s_20,w может быть вычислена даже в случае, когда их седиментационные характеристики не могут быть измерены в воде при 20^оC.

Коэффициенты седиментации биологических макромолекул обычно получаются при какой-либо конечной концентрации и поэтому должны быть экстраполированы к нулевой концентрации. Концентрационная зависимость коэффициента седиментации s выражается формулами:

(24.26)

или

(24.27)

где s⁰ – величина при бесконечном разведении, а k' и k'' – эмпирические константы, выраженные в см³·г^-1. Обычно их значения положительны, т.е. s понижается при повышении концентрации. Эти уравнения эквивалентны при малых концентрациях макромолекул, но расходятся при больших концентрациях. Уравнение 24.26 лучше использовать для компактных частиц, а уравнение 24.27 – для синтетических развернутых полимеров и высоко-асимметричных частиц. В некоторых случаях наблюдается увеличение s с возрастанием C. Эмпирические константы k' и k'' зависят от формы молекул. Это означает, что они могут использоваться как гидродинамические параметры для вычисления молекулярной асимметрии частиц.

Коэффициенты седиментации биологических макромолекул охватывают очень широкую область значений. Для малых пептидов, глобулярных белков они лежат в интервале значений от 0.4S до 100S; для рибосомных РНК – от 4S до 30S; для рибосом и полисом – от 20S до 100S; для вирусов – от 40S до 1000S; для лизосом – от 4000S; для мембран от 100 000S; для митохондрий – от 20 000S до 70 000S; и для ядер – от 4 000 000 S до 40 000 000S. Обычно, чем больше частица, тем большим значением s она обладает. Очень большие молекулы могут осаждаться в гравитационном поле Земли. В Таблице 24.2 представлены значения констант седиментации, s_20,w, парциальных удельных объемов, ,и молекулярных масс М некоторых представителей наиболее типичных биологических макромолекул – начиная от самых маленьких синтетических пептидов, (пептида I, молекулярная масса 2 кДа) и заканчивая большими олигомерными белковыми комплексами (гемоцианин улитки, молекулярная масса около 9 MДa).

Таблица 24.2. Молекулярные массы М, константы седиментации , парциальные удельные объемы , пептидов и белков в водных растворителях. Красным цветом отмечены белки, не имеющие в растворе глобулярной конформации.

Пептиды и белкиа)	Молекулярная масса (Да)	Константа седиментации(ед. Сведберга)	Парциальный удельный объем (cм3·г-1)
Синтетический пептид I (H2)		0.37	0.706
Синтетический пептид II (H3)		0.45	0.715
Синтетический пептид III (H4)		0.52	0.720
Липаза		1.14	0.714
Инсулин (димер)		1.60	0.744
Цитохром C		1.80	0.707
Рибонуклеаза A	13.683	1.78	0.696
Лизоцим		1.91	0.702
α-Лактальбумин	14.180	1.92	0.704
Миоглобин	17.836	1.98	0.741
Папаин	23.350	2.42	0.723
α-Химотрипсин	25.000	2.40	0.736
Химотрипсиноген A	25.767	2.58	0.736
Эластаза	25.900	2.60	0.730
Нейтрофный фактор мозга (димер)BDNF		2.51	0.727
Субтилизин	27.537	2.77	0.731
Карбоангидраза	30.000	3.0	0.735
Зеленый флуоресцирующий белок	30.840	2.83	0.738
Рибофлавин-связывающий белок	32.500	2.76	0.720
Карбоксипептидаза	34.472	3.2	0.725
Пепсин	34.160	2.88	0.725
β-лактоглобулин (димер)	36.730	2.87	0.751
Домен кинезина (конструкт) K366	41.404	3.25	0.733
Яичный альбумин	44.000	3.6	0.740
Бычий сывороточный альбумин	66.300	4.50	0.735
Гемоглобин	64.500	4.60	0.749
Антакс (защитный антиген)	85.000	5.01	0.762
Тропомиозин	93.000	2.6	0.710
Лактатдегидрогеназа	138.320	7.54	0.741
β-лактоглобулин A (октамер)	146.940	7.38	0.751
Апо-глицеральфосфатдегидрогеназа	142.870	7.60	0.737
Моноклональное антитело	151.000	6.5	0.740
Альдолаза	156.000	7.40	0.742
Малатсинтетаза	170.000	8.25	0.735
Каталаза-проксидаза из Penicillium simplicissimum	170.000	8.30	-
Каталаза	248.000	11.3	0.730
Глутаматдегидрогеназа	312.000	11.4	0.749
Фибриноген	330.000	7.6	0.706
Фосфофруктокиназа	345.000	12.2
Апоферритин	467.000	17.6	0.750
Уреаза	482.700	18.6	0.742
Миозин	570.000	6.43	0.728
Глутаматдегидрогеназа	1.015.000	26.6	0.730
Гемоглобин улитки	3.500.000	58.9	0.747
Гемоцианин	8.950.000	105.8	0.728

Синтетические пептиды имели первичную последовательность Ac-YS-(AKEAAKE)_nGAR-NH₂, n = 2, 3 или 4 и согласно данным по круговому дихроизму имели в растворе существенную долю остатков в неупорядоченной конформации.

В Таблице 24.3 представлены аналогичные данные для нативных ДНК и её фрагментов.

Таблица 24.3. Молекулярные массы М (в парах оснований) и константы седиментации ДНК в форме двойной спирали

Образец	Длина молекулы (в парах оснований)	Коэффициент седиментации (ед. Сведберга)	Парциальный удельный объем
	10*	1.50	0.575
	12*	1.72.	0.572
	14*	1.85	0.538
Фрагменты, полученные разрезанием ДНК, фага PM2 рестрикционной нуклеазой Hae III		1.86а
16*	2.10	0.563
20*	2.20	0.578
	2.54а
	3.51
	4.58
	4.92
	5.20
	5.41
	6.24
	6.37
	6.70
	7.62
	7.89
	8.03
	8.59
	8.72
	9.99
	10.67
	10.78
		14.3
Нативная ДНК
ØX 174RF ДНК	39.937	32.0
λ ДНК	48.502	34.4
T4 ДНК	168.903	62.1
T2 ДНК	172.000	64.5
ДНК тщательно фракционированная гель-хроматографией; отношение Mw/Mn не более 1.1 (узкое распределение по молекулярной массе)		7.2
	6.3
	5.7
	5.4
	5.4
	4.7
	3.92

В таблице 24.4. приведены коэффициенты седиментации для рибосомных РНК и их фрагментов.

Частица	Число нуклеотидов в цепи	Коэффициент седиментации (ед. Сведберга)
5 S РНК хлоропластов		4.5
5 S РНК E.coli		5.0
5 S РНК крысы		5.8
3´- фрагмент (1000-1542) 16 S РНК E.coli		9.0
5´- фрагмент (1-530) 16 S РНК E.coli		9.5
3´- фрагмент (535-1542) 16 S РНК E.coli		12.0
5´- фрагмент (1-996) РНК E.coli		12.0
16 S РНК E.coli		16.0
16 S РНК хлоропластов		16.0
16 S РНК T. thermophilus		16.0
18 S РНК дрожжей		18.0
23 S РНК E.coli		23.0
28 S РНК крысы		28.0
РНК вируса табачной мозаики		31.0