Седиментация в поле переменной гравитации

В стандартных экспериментах по скоростной седиментации используется только одна заранее выбранная скорость ротора. Это сразу ограничивает область исследуемых молекул по константам седиментации. Так, при скорости вращения ротора 50 000 об·мин^-1 и обычном значении ускорения ротора, 400 об·сек^-1, частица, которая пройдет путь равный половине длины ячейки, будет иметь константу седиментации 280S. Тем самым выбор одной угловой скорости сильно ограничивает интервал доступных наблюдению констант седиментации. Этот интервал может быть существенно расширен варьированием скорости ротора – от относительно маленькой скорости, позволяющей вести наблюдение за самыми большими частицами, и до самой большой скорости – для выявления самых маленьких частиц.

Техника седиментация с переменной скоростью ротора была впервые предложена Д. Ифантисом (D. Ifantes) для биологических макромолекул и В. Мачтле (W. Mächtle) для полимерных молекул. Последний ввел термин «гравитационное качание» для описания экспериментов с переменной угловой скоростью. Один из первых вариантов реализации этих экспериментов состоял в постепенном экспоненциальном увеличения скорости ротора от 0 до 40 000 об·мин^-1 в течение 1 часа. Однако позже был разработан другой протокол для анализа гетерогенных систем, в котором скорость увеличивается ступенчато. Такой подход позволяет наблюдать частицы в интервале значений s от 200000S до 2.0S.

Протокол такого эксперимента приведен в таблице на рисунке 24.15. При каждом разгоне на установление скорости уходит до 600 секунд. На конечной скорости 50 000 об·мин^-1, центрифугирование продолжается до тех пор, пока наименьшие частицы не достигнут середины пути до дна кюветы.

На рисунке 24.15 (слева) показано применение этого протокола к раствору гемоцианина. В соответствии с методом Стаффорда построены графики значений от .

Рис. 24.15. Зависимость от для раствора гемоцианина Limulus polyphemus в концентрации 2 мг·см^-3. Логарифмическая шкала по оси абсцисс выбрана ввиду большого интервала значений s. Выбранные скорости: 12000, 18000, 25000, 35000 и 50000 об·мин^-1. От 50 до 90 сканов выполнены при каждом значении скорости ротора в течение 20 мин за исключением самой высокой скорости. На ней вращение продолжалось в течение 3-х часов. Точки, полученные при каждой скорости, обозначены различными цветами. Площади под пиками равны концентрациям молекул в зоне границы и соответствуют распределению каждого пика

Как видно из этого рисунка, в образце гемоцианина выявляются четыре компонента со значениями констант седиментации s: 5, 16, 40 и 60S, соответствующими мономерам, гексамерам, 24-мерам и 36-мерам. Этот результат показывает, что при использовании вышеописанного протокола, можно исследовать очень гетерогенные системы.