Аналитические методы определения констант седиментации

В настоящее время современные компьютерные программы позволяют определять константы седиментации и диффузии в условиях приближенных к эксперименту. Для этой цели предложены два метода, каждый из которых дает возможность одновременного определения коэффициентов седиментации и диффузии и, как следствие, молекулярной массы. Выбор метода зависит от соотношения вклада диффузии и седиментации в движущуюся границу. При этом картина седиментации выглядит следующим образом. Как видно из рисунка скорость движения границы определяется константой седиментации вещества, а размывание границы – константой диффузии.

Картина седиментации в общем случае, когда вклады седиментации и диффузии сравнимы по величине

Метод ван Хольде-Вайшетa

Первый метод назван по имени авторов (ван Хольде и Вайшета (van Holde и Weischet)) и базируется на том факте, что седиментация пропорциональна времени, в то время как диффузия пропорциональна корню квадратному из времени. Отсюда следует, что экстраполяция к бесконечному времени должна исключать вклад диффузии в форму границы. Метод состоит из следующих основных шагов.

На первом шаге расстояние между базовой линией и плато для каждого скана подразделяется на N (обычно несколько десятков) горизонтальных сечений N и кажущиеся коэффициенты седиментации, s*, вычисляются как:

s* = ln ((r/r_м)/ω²t) (24.15)

где r, r_м – радиусы сечения и мениска, соответственно. На втором шаге значения s* откладываются как функция корня квадратного из времени для каждого скана. Пересечение с y-осью, которое соответствует бесконечному времени, дает величину s, поправленную на диффузию. Для гомогенных образцов, все линии должны сойтись к одной точке ‒ одному значению константы седиментации s. Для негомогенного образца, линии не сходятся в одной точке и среднее значение при пересечении с y-осью используется для вычисления средне-весового значения коэффициента седиментации, s_w. Затем результаты представляются в виде графика доли общего седиментирующего материала как функции s. Такой график характеризует качество образца. На рисунке 24.8 показаны седиментационные профили (вставки a и г) и анализ методом ван Хольде-Вайшета для гомогенных (вставки a и б) и гетерогенных (вставки г-е) образцов биологических макромолекул.

Рис. 24.8. Анализ скорости перемещения границы седиментации по методу ван Хольде-Вайшета: a-в) данные и анализ для белка капсиды II бактериофага T7 MLD; г-е) данные и анализ для того же препарата, но в котором к белку добавлено некоторое количество субгеномной ДНК. Скорость вращения 10 000 об·мин^-1

При практическом применении метод требует ярко выраженной области плато и симуляции данных, которая должна быть использована для демонстрации достоверности полученных значений. Метод ван Хольде-Вайшета использован в программном обеспечении ULTRASCAN.

Метод Стаффорда или метод временных производных

Второй метод по имени автора носит название метода Стаффорда и иногда называется методом временных производных. В нем распределение коэффициента седиментации вычисляется из производной по времени профиля скорости седиментации. Кажущийся коэффициент седиментации (т. e. не поправленный на диффузию), g*(s)_t может быть вычислен из (dc/dt)_r согласно уравнению:

g*(s)_t=(dC/dt)_испр (1/C₀)×(ω²t²/ln(r_м/r)(r/r_м)²) (24.16)

где s – коэффициент седиментации, ω – угловая скорость ротора, C₀ ‒ исходная концентрация, r и r_м – текущий радиус и радиус мениска, соответственно. В этом методе константы седиментации получаются следующим способом из исходных кривых (рис. 24.9 a).

Рис. 24.9. Иллюстрация метода Стаффорда. а) Исходные кривые; б) Разностные кривые; в) Нормализованные кривые

Близко расположенные две седиментационные кривые вычитаются друг из друга, давая дифференцированную кривую (отсюда название «метод производных») как показано на рисунке 24.9 б. Каждый седиментационный профиль будет иметь гауссову форму, похожую на таковую, получаемую при использовании шлиреновской оптики (dC/dr). Затем кривые нормализуются на время и накладываются друг на друга. На последнем этапе они нормализуются на концентрацию. Результирующий пик имеет гауссову форму, положение и ширина которого связаны с константой седиментации и диффузии, соответственно (рис. 24.9 в). Рисунок 24.10 демонстрирует применение метода Стаффорда для анализа моноклональных антител (иммуноглобулина). Здесь показаны профили поглощения, записанные при длине волны 280 нм (рис. 24.10 а).

Рис. 24.10 а) Профили поглощения для моноклональных антител (иммуноглобулина), записанные при длине волны 280 нм; б) Функция g*(s)

Первый скан (черный) записан через 13 минут после начала центрифугирования при скорости вращения ротора 45000 об/мин. Каждый последующий скан сделан через 12 минут (разные цвета). Резкий вертикальный пик при 6.02 см указывает позицию мениска. Уже первый скан указывает на отрыв молекул антитела от мениска и образование границы. Отметьте, что в последнем скане (зеленый) молекулы проходят расстояние, равное половине длины кюветы. Наклон кривых профиля поглощения каждого скана связан с диффузией движущихся молекул. Построение функции g*(s) для исследованного образца моноклональных антител выявляет один большой четкий пик с коэффициентом седиментации около 6.5 S, который соответствует нативному мономеру (реально ковалентному димеру, состоящему из 2 легких и двух тяжелых цепей). Отметим, что значение коэффициента седиментации 6.5 S моноклонального антитела при молекулярной массе около 150 кДа существенно меньше по сравнению с глобулярными белками близкой массы. Так альдолаза с молекулярной массой 156 кДа имеет константу седиментации 7.4 S (Таблица 24.3). Причина такого несоответствия проста: форма молекулы иммуноглобулина далека от квазисферической. Она имеет Y-образную форму.

При детальном рассмотрении рисунка 24.10 б видно, что исследованный образец не является полностью гомогенным. Интерпретация седиментационного профиля одной компонентой (красный) ясно показывает, что в образце содержится некоторое количество материала с более высокими константами седиментации, лежащими в интервале 8-12 S. Детальный анализ этой области с учетом молекулярной массы и коэффициента диффузии мономера указывает на содержание в образце некоторой доли димеров с константой седиментации 9.4 S. Метод Стаффорда реализован в программном обеспечении DCDTPLUS.

Численные решения

Использование численных решений для прямого анализа данных аналитического ультрацентрифугирования известно уже около 30 лет. Однако относительно недавно, в основном благодаря возросшей мощности компьютеров, они стали использоваться для анализа данных аналитического скоростного ультрацентрифугирования. Главное преимущество численных решений состоит в том, что с их помощью можно учесть многообразие практически всех граничных условий, накладываемых конечной длиной центрифужной ячейки и эффектами диффузии.