МЕТОДЫ ВЫДЕЛЕНИЯ И ОЧИСТКИ БЕЛКОВ - раздел Химия, БИОЛОГИЧЕСКАЯ ХИМИЯ Белки Под Действием Различных Факторов (Действие Химических Реагентов, Нагрев...
Белки под действием различных факторов (действие химических реагентов, нагревание и др.) легко подвергаются денатурации - теряют некоторые нативные (природные) свойства, например, растворимость, биологическую активность. Поэтому для выделения белков разработаны специальные «щадящие» методы.
Процесс начинают с гомогенизациибиологического материала – измельчения до разрушения клеточных структур. Для этого используют пестиковые или ножевых гомогенизаторы, шаровые мельницы, ультразвук, метод попеременного замораживания и оттаивания ткани, метод «азотной бомбы».
Затем проводят экстракцию белков буферными смесями с определенными значениями рН, органическими растворителями. Большинство белков хорошо растворимо в 8-10% растворах солей.
Для фракционированияи очистки белков используют следующие методы.
Высаливание – осаждение белков из раствора при добавлении растворов солей щелочных и щелочноземельных металлов. Этот метод используется в клинической практике при анализе белков сыворотки крови, например, для разделения глобулинов (выпадают в осадок при 50% насыщении раствора сульфата аммония) и альбуминов (при 100% насыщении).
Электрофорез основан на различии в скорости движения белков в электрическом поле, которая определяется величиной заряда белка при определенных значениях рН и ионной силы раствора. Применяется в клинической медицине для анализа белковых и пептидных смесей, сыворотки крови.
Ультрацентрифугирование - метод разделения жидких дисперсных сред на компоненты под действием центробежной силы.
Хроматография (от греч. chroma – цвет) - физико-химический метод разделения и анализа смесей веществ, основанный на распределении их компонентов между двумя несмешивающимися фазами – неподвижной (сорбент) и подвижной (элюент).
Различают следующие разновидности хроматографии:
- адсорбционная- разделение компонентов смеси основано на их различной сорбируемости на твердом адсорбенте;
- распределительная - твердая фаза служит опорой для стационарной жидкой фазы. Разновидностью является хроматография на бумаге;
- ионообменная - используют подходящую ионообменную смолу, с функциональными группами которой обменивается и задерживается на колонке часть белков, в то время как другие белки беспрепятственно элюируются с колонки;
- гель-хроматография, или метод молекулярных сит, основан на способности небольших молекул проникать в поры геля, тогда как большие молекулы остаются снаружи, двигаясь вместе с подвижной фазой вниз вдоль колонки. Позволяет разделить белки с разной молекулярной массой.
Перспективными видами хроматографииявляются высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ) и газовая хроматография. Хроматография является одним из основных методов биохимических исследований. В клинических лабораториях ее применяют для разделения и анализа аминокислот, белков, углеводов, фосфолипидов, стероидов в плазме крови, тканевых экстрактах, моче.
Все темы данного раздела:
ХИМИЯ БЕЛКОВ
Белки - высокомолекулярные азотсодержащие органические вещества, молекулы которых построены из остатков аминокислот, соединенных пептидными связями. Белки называют также протеинами
ФУНКЦИИ БЕЛКОВ
Каталитическая функция. Большинство известных в настоящее время ферментов, называемых биологическими катализаторами, является белками. К настоящему времени охарактеризованы несколь
АМИНОКИСЛОТНЫЙ СОСТАВ БЕЛКОВ
Для установления аминокислотного состава белков пользуются сочетанием кислотного (НС1), щелочного (Ва(ОН)2) и, реже, ферментативного гидролиза или одним из них. Установлено, что при гидр
СТРУКТУРНАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ БЕЛКОВ
Доказано существование 4 уровней структурной организации белковой молекулы.
Первичная структура белка – последовательность расположения аминокислотных остатков в полипепти
ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА БЕЛКОВ
Белки относятся к высокомолекулярным соединениям, их относительная молекулярная масса колеблется от 6000 до 1000000 а.е.м. и выше. Для определения молекулярной массы белков используют методы седиме
Альбумины и глобулины.
Альбумины - простые белки; входят в состав животных и растительных тканей; содержатся в белке яиц, сыворотке крови, молоке, в семенах растений. Растворимы в воде, солевых растворах
СЛОЖНЫЕ БЕЛКИ
1. Хромопротеины(от греч. chroma - краска) состоят из простого белка и связанного с ним окрашенного небелкового компонента. Различают гемопротеины и флавопротеины. Они участвуют в
Производные гемоглобина
Оксигемоглобин HbO2.Молекулярный кислород присоединяется к каждому гему Hb при помощи координационных связей железа. Присоединение каждой молекулы кислорода облегчает пр
СТРУКТУРА НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ
Первичная структура-последовательность расположения мононуклеотидов в полинуклеотидной цепи ДНК и РНК. Мономеры в молекулах нуклеиновых кислот соединены сложноэфирной связью, образ
ХИМИЧЕСКАЯ ПРИРОДА ФЕРМЕНТОВ
Доказательства белковой природы ферментов:
1. Ферменты при гидролизе распадаются на аминокислоты.
2. Под действием кипячения и др. факторов ферменты подвергаются денатурации и тер
МЕХАНИЗМ ДЕЙСТВИЯ ФЕРМЕНТОВ
Фермент Е обратимо соединяется с субстратом S, образуя нестойкий промежуточный фермент-субстратный комплекс ES, который в конце реакции распадается с освобождением фермента и продуктов реакции Р.
КИНЕТИКА ФЕРМЕНТАТИВНЫХ РЕАКЦИЙ
Ферментативная кинетика исследует влияние химической природы реагирующих веществ (ферментов, субстратов) и условий их взаимодействия (концентрация, рН среды, температура, присутствие активаторов ил
СВОЙСТВА ФЕРМЕНТОВ
Ферменты отличаются от обычных катализаторов рядом свойств.
Термолабильность, или чувствительность к повышению температуры (рис. 13).
Рис. 13.
Контроль активности фермента.
2.1. Влияние на ферменты активаторов и ингибиторов.
Активаторами ферментов являются ионы многих металлов, например, ионы кальция активируют липазу. Некото
ФЕРМЕНТЫ В МЕДИЦИНЕ
Ферменты применяют как лечебные препараты:
- при их отсутствии или недостатке (наследственном или приобретенном);
- для специфического разрушения некоторых продук
ВИТАМИНЫ
Витамины (от лат. vita-жизнь) – пищевые незаменимые факторы, которые, присутствуя в небольших количествах в пище, обеспечивают нормальное развитие организма человека и животных и а
ЖИРОРАСТВОРИМЫЕ ВИТАМИНЫ
Витамин А (ретинол).Витамин А имеет несколько витамеров.
Витамеры– вещества, сходные по химическому строению и обладающие физиологическим действием, харак
ВОДОРАСТВОРИМЫЕ ВИТАМИНЫ
Витамин С (аскорбиновая кислота) -бесцветные кристаллы, кислые на вкус.
Аскорбиновая кислота является участником окислительно-восстановительных процессов. Участвует в синт
Витаминоподобные вещества
Помимо двух главных групп витаминов, выделяют группу разнообразных химических веществ, из которых часть синтезируется в организме, но обладает витаминными свойствами. К ним относят холин, липоевую
СТРОЕНИЕ И ФУНКЦИИ МЕМБРАН
Основными мембранными структурами клетки являются плазматическая мембрана, эндоплазматический ретикулум, пластинчатый комплекс, митохондриальная и ядерная мембраны.
Функции мембран
Галактозилцерамид
Характерной особенностью молекул фосфолипидов и гликолипидов является их амфифильность: один конец молекулы гидрофобный, другой — гидрофильный.
4. Стероиды представлены хо
Облегченная диффузия
Для более крупных полярных молекул (глюкоза, аминокислоты), а также для ионов липидный бислой практически непроницаем, так как его внутренняя часть гидрофобна. Такие вещества переносятся через мемб
МЕХАНИЗМЫ ПЕРЕДАЧИ ГОРМОНАЛЬНОГО СИГНАЛА
Гормоны - вещества органической природы, вырабатывающиеся в специализированных клетках желез внутренней секреции, поступающие в кровь и оказывающие регулирующее влияние на обмен ве
Трансмембранная передача гормонального сигнала
Клеточные мембраны благодаря наличию специальных рецепторов воспринимают сигналы из внешней среды (например, молекулы гормонов, называемые первичными мессенджерами, или посредникам
БИОЭНЕРГЕТИКА
На предыдущей лекции была рассмотрена общая схема катаболизма. Одна из основных функций катаболизма - извлечение химической энергии из содержащихся в пище веществ и использование этой энергии на об
ДЫХАТЕЛЬНОЙ ЦЕПИ
Окисление субстратов в процессе дыхания можно представить как перенос электронов и протонов (т. е. атомов водорода) от органических веществ на кислород. В этом процессе участвует ряд промежуточных
РАЗОБЩЕНИЕ ОКИСЛЕНИЯ И ФОСФОРИЛИРОВАНИЯ
Разобщители - липофильные вещества, которые способны принимать протоны и переносить их через внутреннюю мембрану митохондрий, минуя его протонный канал.
Разобщители бывают
ГЕНЕРАЦИЯ СВОБОДНЫХ РАДИКАЛОВ В КЛЕТКЕ
Активные формы кислорода (АФК) – соединения, в которых кислород имеет неспаренный электрон.
АФК образуются при изменении условий функционирования дыхательной цепи (наприме
ОКИСЛИТЕЛЬНОЕ ДЕКАРБОКСИЛИРОВАНИЕ ПВК
Это многостадийный процесс, который катализирует пируватдегидрогеназный комплекс - митохондриальный мультиферментный комплекс, соединенный с внутренней мембраной со стороны матрикс
ЦИКЛ ТРИКАРБОНОВЫХ КИСЛОТ
Цикл трикарбоновых кислот (цикл Кребса) открыт английским биохимиком Хансом Кребсом, получившим за это выдающееся открытие в 1953 г. Нобелевскую премию.
Цикл Кребса - путь
ПЕРЕВАРИВАНИЕ углеводов
Углеводы пищи - источник углеводов организма. Норма потребления – 400-500 г в сутки. Углеводы дают основное количество калорий, необходимых человеку. Функции углеводов в организме:
ОБМЕН ГЛИКОГЕНА
Гликоген – главный резервный гомолисахарид человека, мономером которого является глюкоза. Остатки глюкозы соединены в линейных участках a-1,4-гликозидными связями, в местах разветв
ГЛИКОЛИЗ
Гликолиз – последовательность ферментативных реакций, приводящих к расщеплению глюкозы с образованием ПВК, сопровождающихся образованием АТФ (в цитозоле клетки).
Аэробный
Включение фруктозы и галактозы в гликолиз
Включениефруктозыв метаболизмв печени начинается с реакции фосфорилирования, катализируемой фруктокиназой с образованием фруктозо-1-фосфата:
ЧЕЛНОЧНЫЕ МЕХАНИЗМЫ
Цитозольный НАДH (реакция 6 гликолиза) не может передавать водород на дыхательную цепь, потому что митохондриальная мембрана для него непроницаема. Перенос водорода через мембрану происходит с помо
ЦИКЛ КОРИ
Цикл Кори (глюкозо-лактатный цикл) открыла чешская ученая, лауреат Нобелевской премии Тереза Кори. Он представляет собой биохимический транспорт лактата из мышц в печень и дальнейший синтез глюкозы
Пентозофосфатный путь превращения глюкозы
Пентозофосфатный путь – альтернативный путь окисления глюкозы. Его функции:
- поставляет клеткам кофермент НАДФН, использующийся как донор водорода в реакциях восстановлен
ГЛЮКОНЕОГЕНЕЗ
Глюконеогенез – синтез глюкозы из веществ неуглеводной природы, протекающий в основном в печени, и, менее интенсивно, – в корковом веществе почек и слизистой оболочке кишечника.
РЕГУЛЯЦИЯ ОБМЕНА УГЛЕВОДОВ
Печень отличается наиболее сложным обменом глюкозы по сравнению с другими органами. В ней происходят противоположные процессы: синтез/распад гликогена и гликолиз/глюконеогенез.
Направление
Гликогенозы
Гликогенозы - группа наследственных заболеваний, обусловленная недостаточностью ферментов, участвующих в синтезе или распаде гликогена.
Гликогеноз О типа (агликено
Нарушения промежуточного обмена углеводов
1. Гипоксические состояния (при недостаточности дыхания или кровообращения, при анемиях и др.), анаэробная фаза превращения углеводов преобладает над аэробной. Происходит избыточное накопление в тк
Гипер- и гипогликемия
При некоторых состояниях можно наблюдать повышение содержания глюкозы в крови - гипергликемию, а также понижение концентрации глюкозы - гипогликемию.
Для
Глюкозурия
Глюкозурияявляется результатом нарушения углеводного обмена вследствие патологических изменений в поджелудочной железе (сахарный диабет, острый панкреатит и т.д.).
При тяж
Качественный анализ аминокислотных смесей методом бумажной хроматографии.
Разметить хроматографическую пластинку, как показано на рис. 1. В точки 1, 2, 3 наносят капилляром растворы аминокислот, в точку 3 – раствор смеси аминокислот. Хроматограмму подсушивают над теплой
Открытие пепсина в желудочном соке.
В пробирку наливают 5 мл молочноацетатной смеси и помещают ее в термостат при температуре 25°С. После того как пробирка прогреется до указанной температуры, в нее добавляют 0,1 мл желудочного сока
Работа 5. Определение активности ферментов
1. Действие активаторов и ингибиторов на α-амилазу слюны.
В первую пробирку наливают 0,5 мл 1% раствора хлорида натрия, во вторую — 0,5 мл 1% раствора сульфата меди,
Опыт 4. Качественная реакция на витамин К (викасол).
К 0,5 мл 0,2 %-ного раствора викасола в этаноле добавляют 5 капель анилина, перемешивают. Смесь окрашивается в красный цвет.
Опыт 5. Реакция окисления витамина В1 (тиами
Опыт 10. Количественное определение аскорбиновой кислоты в моче методом Тильманса.
Количество витамина С в суточном объеме мочи зависит от содержания его в пище, потребности в нем организма, возраста человека, способности слизистой кишечника к всасыванию. В среднем здоровый челов
Сопоставление редокс-потенциалов рибовлавина и метиленового синего.
Редокс-потенциалы являются мерой способности молекул обмениваться электронами. Вещество с большим окислительно-восстановительным потенциалом окисляет вещество с меньшим окислительно-восстановительн
Определение каталазы по А.Н. Баху и А.И. Опарину.
Для определения берут водную вытяжку из моркови, которая содержит фермент каталазу. В коническую колбу вносят пипеткой 25 мл 0,1 н. раствора пероксида водорода и добавляют туда же пипеткой 20 мл вы
Опыт 1. Количественное определение активности амилазы в сыворотке крови.
Моча и сыворотка крови здоровых людей обладают низкой амилазной активностью по сравнению с амилазой слюны. Определение активности амилазы в моче и сыворотке крови используется в клинической практик
Опыт 2. Количественное определение пировиноградной кислоты в моче.
Пировиноградная кислота (ПВК) является одним из промежуточных продуктов обмена углеводов. В анаэробных условиях (при гипоксии) она восстанавливается в молочную кислоту, а в аэробных – подвергается
Выявление фруктозурии пробой Селиванова.
Метод основан на превращении фруктозы при нагревании и в присутствии соляной кислоты в гидроксиметилфурфурол, который конденсируется с резорцином (0,05% раствор в 20% соляной кислоте, реактив Селив
Новости и инфо для студентов