БИОЛОГИЧЕСКАЯ ХИМИЯ

ФЕДЕРАЛЬНОЕ АГЕНТСТВО ПО ОБРАЗОВАНИЮ

ТАМБОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

ИМЕНИ Г.Р. ДЕРЖАВИНА

 

 

А.В. Гулин

С.Е. Синютина

А.Г. Шубина

 

БИОЛОГИЧЕСКАЯ ХИМИЯ

(часть 1)

 

Допущено Редакционно-издательским

советом ТГУ имени Г.Р. Державина в качестве

учебного пособия для иностранных студентов,

обучающихся по специальности

060101 – Лечебное дело

 

 

 

Тамбов 2011

УДК ББК Г

 

 

Рецензенты:

Доктор медицинских наук, профессор

Кандидат химических наук, доцент

С	Гулин, А.В. Биологическая химия (часть 1): Учебное пособие для иностранных студентов университетов, обучающихся по специальности «Лечебное дело» / А.В. Гулин, С.Е. Синютина, А.г. Шубина; Федеральное агентство по образованию; Тамб. гос. ун-т им. Г.Р. Державина, Тамбов : Издательский дом ТГУ им. Г.Р. Державина, 2011. - с.
	УДК ББК   © Тамбовский государственный университет им. Г.Р. Державина, 2011

СОдержАНИЕ

	С.
I. ТЕоРЕТИЧЕСКАЯ ЧАСТЬ
Предмет биохимии
1. Химия белков
1.1. Методы выделения и очистки белков
1.2. Функции белков
1.3. Аминокислотный состав белков
1.4. Структурная организация белков
1.5. Физико-химические свойства белков
1.6. Классификация белков
1.6.1. Простые белки
1.6.2. Сложные белки
2. Ферменты
2.1. Химическая природа ферментов
2.2.Механизм действия ферментов
2.3. Кинетика ферментативных реакций
2.4. Свойства ферментов
2.5. Регуляция активности ферментов
2.6. Классификация и номенклатура ферментов
2.7. Ферменты в медицине
3. Витамины
3.1. Жирорастворимые витамины
3.2. Водорастворимые витамины
4. Основные принципы организации биомембран
4.1. Строение и функции мембран
4.2. Транспорт веществ через мембрану
5. Механизмы передачи гормонального сигнала
6. Введение в метаболизм
6.1. Общая схема катаболизма
6.2. Биоэнергетика
6.3. Организация и функционирование дыхательной цепи
6.4. Разобщение дыхания и фосфорилирования
6.5. Генерация свободных радикалов в клетке
6.6. Реакции общего пути катаболизма
6.6.1. Окислительное декарбоксилирование ПВК
6.6.2. Цикл трикарбоновых кислот
7. Обмен углеводов
7.1. Переваривание углеводов
7.2. Обмен гликогена
7.3. Гликолиз
7.4. Включение глюкозы и галактозы в гликолиз
7.5. Челночные механизмы
7.6. Цикл Кори
7.7. Спиртовое брожение
7.8. Пентозофосфатный путь превращения глюкозы
7.9. Глюконеогенез
7.10. Регуляция обмена углеводов
7.11. Нарушения углеводного обмена
II. ЛАБОРАТОРНЫЙ ПРАКТИКУМ
Работа 1. Анализ аминокислот и белков
Работа 2. Сложные белки – фосфопротеины и гликопротеины
Работа 3. Сложные белки – нуклеопротеины и хромопротеины
Работа 4. Ферменты
Работа 5. Определение активности ферментов
Работа 6. Витамины
Работа 7. Оксидоредуктазы
Работа 8. Обмен углеводов
Литература

I. ТЕОРЕТИЧЕСКАЯ ЧАСТЬ

ПРЕДМЕТ БИОХИМИИ

Биохимия– наука о химических основах процессов жизнедеятельности, изучающая химические компоненты живых клеток, а также реакции и процессы, в которых они участвуют. Ее главной задачей является установление связи между молекулярной структурой и биологической функцией химических компонентов живых организмов.

Предметом медицинской биохимии являются химические процессы, происходящие в организме человека в норме и при патологии, диагностика и прогноз на основе биохимических исследований.

ХИМИЯ БЕЛКОВ

Белки составляют основу и структуры, и функций живых организмов. Природные белки построены из 20 различных аминокислот. Эти аминокислоты могут… Содержание белков в различных тканях одного организма неодинаково. Так, в… Элементный состав белков в пересчете на сухое вещество: С - 50-54%; Н - 6,5-7,3%; О - 21-23%; N - 15-17%; S - до…

МЕТОДЫ ВЫДЕЛЕНИЯ И ОЧИСТКИ БЕЛКОВ

Процесс начинают с гомогенизациибиологического материала – измельчения до разрушения клеточных структур. Для этого используют пестиковые или ножевых… Затем проводят экстракцию белков буферными смесями с определенными значениями… Для фракционированияи очистки белков используют следующие методы.

ФУНКЦИИ БЕЛКОВ

Транспортная функция. Дыхательная функция крови, в частности перенос кислорода, осуществляется молекулами гемоглобина-белка эритроцитов. В… Защитная функция. В ответ на поступление в организм бактерий, токсинов,… Гормональная функция. Ряд гормонов представлен белками или полипептидами, например, гормон поджелудочной железы…

АМИНОКИСЛОТНЫЙ СОСТАВ БЕЛКОВ

Аминокислоты, входящие в состав белков, являются a-аминокислотами. Все они принадлежат к L-ряду, а величина и знак оптического вращения зависят от… Аминокислоты отличаются друг от друга химической природой радикала R, который… Выделяют: 1) неполярные (гидрофобные); 2) полярные (гидрофильные); 3) ароматические (главным образом неполярные), 4)…

СТРУКТУРНАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ БЕЛКОВ

Первичная структура белка – последовательность расположения аминокислотных остатков в полипептидной цепи. В белках отдельные аминокислоты связаны…   К настоящему времени расшифрована первичная структура десятков тысяч разных белков. Для определения первичной…

ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА БЕЛКОВ

Наиболее характерными физико-химическими свойствами белков являются высокая вязкость растворов, незначительная диффузия, способность к набуханию в… В изоэлектрической точке (рI) суммарный заряд белков, обладающих амфотерными… Раствор белка называют изоионным, если он не содержит никаких других ионов, кроме ионизированных остатков аминокислот…

КЛАССИФИКАЦИЯ БЕЛКОВ

В зависимости от химического состава белки делят на 2 группы.

Простые белкипостроены из остатков аминокислот и при гидролизе распадаются только на свободные аминокислоты.

Сложные белки -это двухкомпонентные белки, которые состоят из простого белка и небелкового компонента (простетической группы).

ПРОСТЫЕ БЕЛКИ

Альбумины и глобулины.

Глобулины - группа животных и растительных белков, широко распространённых в природе. Относятся к глобулярным белкам. Растворимы в слабых растворах… Отношение альбумин/глобулин имеет диагностическое значение: в норме оно близко…

Протамины и гистоны.

Протамины – низкомолекулярные белки в ядрах сперматозоидов у рыб и птиц. Они обладают содержат 60-85% аргинина и обладают основными свойствами. Хорошо растворяются в воде, кислой и нейтральной среде. Осаждаются щелочами. В ядрах клеток ассоциируются с ДНК.

Гистоны также являются небольшими белками основного характера. В их состав входят лизин и аргинин, содержание которых не превышает 20-30%. Существует пять различных типов гистонов: H1, H2A, H2B, H3 и H4. Эти белки находятся в основном в ядрах клеток. Они принимают участие в структурной организации хроматина.

Проламины и глютелины.

Проламины - белки растительного происхождени. Содержат 20-25% глутаминовой кислоты и 10-15% пролина. Растворимы в 60-80% водном растворе этанола, в то время как все остальные простые белки в этих условиях обычно выпадают в осадок.

Глютелины - простые белки, содержатся в семенах злаков, в зелёных частях растений. Для них характерно высокое содержание глутаминовой кислоты и наличие лизина. Растворимы в разбавленных растворах щелочей. Глютелины - запасные белки.

СЛОЖНЫЕ БЕЛКИ

К группе гемопротеинов относятся гемоглобин, миоглобин, цитохромы, каталаза, пероксидаз. Все они содержат железопорфирины, но различные по составу и… Рассмотрим строение гемоглобина – белка крови. Небелковым компонентом… В крови взрослого человека присутствуют также гемоглобин НbА2 (2α, 2δ цепи, 2,5%) и НbA3 (менее 1%,…

Производные гемоглобина

Карбгемоглобин HbCO2 соединение гемоглобина с углекислым газом. Он нестоек и быстро диссоциирует в легочных капиллярах с отщеплением СО2. Карбоксигемоглобин HbCO - продукт присоединения оксида углерода CO (угарного… Метгемоглобин MtHb -форма гемоглобина, в которой железо гема находится в трёхвалентном состоянии.Не способен…

СТРУКТУРА НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ

Для изучения химического состава НК используют секвенирование – расщепление НК на фрагменты ферментами либо химическими реагентами и анализ… Вторичная структура.ДНК состоит из двух цепей, образующих правовращающую… В молекуле ДНК основания уложены парами: пуриновые из одной цепи и пиримидиновые из другой. Взаимодействие пар А-Т и…

Контрольные вопросы

1. Дайте характеристику аминокислотам как структурным мономерам белков. В чем состоят особенности образования пептидной связи?

2. Дайте определение первичной структуры белка. В чем состоит определяющая роль первичной структуры в формировании более высоких уровней организации белковой молекулы?

3. Какие связи стабилизируют вторичную структуру белка? Укажите виды вторичной структуры белка.

4. Что понимают под третичной структурой белка? Какие связи ее стабилизируют?

5. Охарактеризуйте четвертичную структуру белка. Что такое мономеры и олигомеры?

6. В чем состоит взаимосвязь структуры и функции белков?

7. Перечислите основные функции белков в организме.

8. Какие методы позволяют определить молекулярную массу белка?

9. Зависит ли растворимость белков от их аминокислотного состава?

10. Что понимают под денатурацией и ренатурацией белков? Какие агенты вызывают денатурацию?

11. Что такое изоэлектрическая точка белка?

12. Как используется процесс высаливания белков в медицине?

13. Перечислите функции альбуминов и глобулинов плазмы крови.

14. Приведите примеры фибриллярных белков.

15. Приведите классификацию сложных белков.

16. Рассмотрите структуру и функции гемоглобина А.

 

ФЕРМЕНТЫ

Ферменты, или энзимы - вещества белковой природы, обладающие каталитической активностью. Термин «энзим» - от греч. en zyme- в дрожжах, «фермент» - от лат. fermentatio - брожение.

Учение о ферментах выделено в самостоятельную науку энзимологию.

Хотя уже осуществлен лабораторный синтез ряда ферментов — рибонуклеазы, лизоцима, единственный способ получения ферментов — это выделение их из биологических объектов.

ХИМИЧЕСКАЯ ПРИРОДА ФЕРМЕНТОВ

1. Ферменты при гидролизе распадаются на аминокислоты. 2. Под действием кипячения и др. факторов ферменты подвергаются денатурации и… 3. Осуществлено выделение ферментов в форме кристаллов белка.

МЕХАНИЗМ ДЕЙСТВИЯ ФЕРМЕНТОВ

  Эти представления легли в основу теории «ключ-замок» Э. Фишера (1890).… Д. Кошлендом была разработана теория «индуцированного соответствия» (1958). Пространственное соответствие структуры…

КИНЕТИКА ФЕРМЕНТАТИВНЫХ РЕАКЦИЙ

При ферментном катализе фермент (Е) обратимо соединяется с субстратом (S), образуя нестойкий фермент-субстратный комплекс (ES), который в конце…   Важная особенность ферментативных реакций – насыщение фермента субстратом. При низкой концентрации субстрата скорость…

СВОЙСТВА ФЕРМЕНТОВ

Термолабильность, или чувствительность к повышению температуры (рис. 13).   Рис. 13. Зависимость скорости ферментативной реакции от температуры.

РЕГУЛЯЦИЯ АКТИВНОСТИ ФЕРМЕНТОВ

Активность ферментаопределяют по скорости реакции, катализируемой ферментом, при стандартных условиях измерения(оптимальных условиях температуры, рН среды и полном насыщении фермента субстратом). О скорости ферментативной реакции судят или по скорости убыли субстрата, или по скорости образования продукта реакции.

Одна стандартная единица активности фермента(Е или U) — такое количество фермента, которое катализирует превращение 1 мкмоль вещества за 1мин.

В связи с введением Международной системы единиц (СИ) предложено выражение активности фермента в каталах (кат, kat): 1 кат есть каталитическая активность, способная осуществлять реакцию со скоростью, равной 1 моль/с. 1 U(Е) фермента соответствует 16,67 нкат.

Существует два основных способа контроля скорости ферментативных реакций.

Контроль количества фермента.

Количество фермента в клетке определяется соотношением скоростей его синтеза и распада. На скорость синтеза фермента влияют присутствие субстрата и продуктов реакции.

Контроль активности фермента.

Активаторами ферментов являются ионы многих металлов, например, ионы кальция активируют липазу. Некоторые анионы также способны активировать… Активаторами ферментов могут быть разнообразные вещества: так, желчные кислоты… Ингибиторы тормозят действие ферментов.

Химическая модификация фермента

Регуляция активности ферментов путем фосфорилирования-дефосфорилирования. Протекает при участии протеинкиназ по ОН-группам серина и треонина, а в ряде случаев – тирозина. Активным ферментом может быть или фосфорилированная или дефосфорилированная форма.

Регуляция активности путем ассоциации-диссоциации субъединиц в олигомерном ферменте. Например, фермент протеинкиназа в неактивной форме построена как тетрамер. Для активации протеинкиназы необходима диссоциация субъединиц.

Активация ферментов путем частичного протеолиза. Некоторые ферменты синтезируются неактивными и лишь после секреции из клетки переходят в активную форму путем удаления части белковой молекулы. Так происходит активация протеолитических ферментов.

Аллостерическая регуляция

Во многих случаях основным типом регуляции скорости многоступенчатого ферментативного процесса является ингибирование по принципу обратной связи. Конечный продукт подавляет активность фермента, катализирующего первую стадию синтеза, которая является ключевой для данной цепи реакции. Он связывается с аллостерическим центром молекулы фермента. Это ингибирование по принципу обратной связи, или ретроингибирование.

КЛАССИФИКАЦИЯ И НОМЕНКЛАТУРА ФЕРМЕНТОВ

Современные классификация и номенклатура ферментов разработаны Комиссией по ферментам Международного биохимического союза и утверждены на V Международном биохимическом конгрессе в 1961 г. в Москве.

В основу классификации легли 3 принципа:

1. Химическая природа фермента.

2. Химическая природа субстрата, на который действует фермент.

3. Тип катализируемой реакции.

Ферменты делят на шесть классов.

1. Оксидоредуктазы- ферменты, катализирующие реакции окисления—восстановления:

 

пируват лактат

- аэробные дегидрогеназы, или оксидазы, катализируют перенос протонов (электронов) непосредственно на кислород;

- анаэробные дегидрогеназы ускоряют перенос протонов (электронов) на промежуточный субстрат, но не на кислород.

Наиболее распространены оксидоредуктазы, содержащие в качестве активной группы никотинамидадениндинуклеотид,или НАД⁺. Кроме НАД⁺ пиридинферменты содержат в качестве кофермента никотинамидадениндинуклеотидфосфат(НАДФ⁺). Коферментами оксидоредуктаз являются также флавопротеины (ФП) - флавинмононуклеотид, ФМН, и флавинадениндинуклеотид, ФАД.

2. Трансферазы - ферменты, катализирующие реакции межмолекулярного переноса различных атомов, групп атомов и радикалов.

Фосфотрансферазы-перенос остатка фосфорной кислоты. Фосфорные эфиры органических соединений обладают повышенной химической активностью. Донором фосфатных остатков в большинстве случаев является АТФ.

 

Аминотрансферазыускоряют реакцию переноса аминогруппы от аминокислоты на a-кетокислоту.

 

Протеинкиназыускоряют перенос остатка фосфата с АТФ на белки,изменяя их биологическую активность.

Гликозилтрансферазыускоряют реакции переноса гликозильных остатков.

Ацилтрансферазыкатализируют перенос ацилов (остатков карбоновых кислот).

3. Гидролазыкатализируют расщепление внутримолекулярных связей органических веществ при участии молекулы воды.

Эстеразыкатализируют гидролиз сложных эфиров спиртов с органическими и неорганическими кислотами. Например, липазаускоряет гидролиз триацилглицеринов (жиров):

 

Фосфатазыкатализируют гидролиз фосфорных эфиров:

глюкозо-6-фосфат + Н₂О®глюкоза + Н₃РО₄

Гликозидазыкатализируют гидролиз гликозидов. Из гликозидаз, действующих на полисахариды, наиболее известны амилазы.

Пептидгидролазыускоряют гидролиз пептидных связей в белках и пептидах.

4. Лиазы- ферменты, катализирующие разрыв связей С—О, С—С, С—N и других, а также обратимые реакции отщепления различных групп от субстратов негидролитическим путем. Эти реакции сопровождаются образованием двойной связи и выделением таких простейших продуктов, как СО₂, H₂O, NH₃ и т. д..

Углерод-углерод-лиазы – декарбоксилазы:

 

5. Изомеразы- ферменты, катализирующие взаимопревращения структурных, оптических и геометрических изомеров. Мутаротазаускоряет реакцию превращения α-D-глюкопиранозы в β-D-глюкопиранозу:

 

6. Лигазы (синтетазы) - ферменты, катализирующие синтез органических веществ из двух исходных молекул с использованием энергии распада АТФ либо других веществ.

Одной из важнейших карбоксилаз является пируваткарбоксилаза:

СН₃-СО-СООН + СО₂ ® НООС-СН₂-СО-ООН

Международная комиссия подготовила Классификацию ферментов (КФ).Код каждого фермента содержит четыре цифры, разделенные точками. Первая цифра указывает номер класса, вторая означает подкласс и характеризует вид субстрата. Например, у трансфераз указывает на природу переносимой группы, у гидролаз - на тип гидролизуемой связи. 3 цифра – уточняет природу участвующих в реакции соединений или групп. Четвертая цифра – номер фермента в данном подподклассе.

Пепсин – пептид-пептидогидролаза; КФ 3.4.4.1.

ФЕРМЕНТЫ В МЕДИЦИНЕ

- при их отсутствии или недостатке (наследственном или приобретенном); - для специфического разрушения некоторых продуктов обмена. …  

Приобретенные энзимопатии.

Токсические энзимопатии - следствие токсического воздействия ксенобиотиков и мутагенов внешней среды. Например, свинец, содержащийся в выхлопных газах транспорта, вызывает угнетение фермента аминолевулинатдегидразы, участвующей в синтезе порфобилиногена и гема, что проявляется развитием анемии у детей городов.

Алиментарные энзимопатии могут быть обусловлены длительным дефицитом белка в питании, витаминной недостаточностью, несбалансированным питанием.

Контрольные вопросы

1. Охарактеризуйте химическую природу и строение ферментов.

2. Каково строение активного центра фермент? Что такое аллостерический центр?

3. Приведите примеры изоферментов; мультимолекулярных ферментных систем.

4. По какому признаку классифицируют ферменты?

5. Опишите механизм действия ферментов.

6. В чем различие теорий Фишера и Кошланда?

7. Как влияют изменение рН и температуры на скорость ферментативных реакций?

9. Что понимают под специфичностью действия ферментов?

9. Как осуществляется регуляция активности ферментов?

10. Какие Вам известны типы ингибирования ферментов?

11. Как на практике можно осуществить определение активности ферментов?

12. Приведите примеры использования ферментов в медицине.

ВИТАМИНЫ

Витамины представляют сборную в химическом и физическом отношении группу органических соединений. Физиологическое действие витаминов также весьма… Еще 100 лет назад считали, что для нормальной жизнедеятельности организма… В количественном отношении потребность в витаминах ничтожна: человек в среднем должен потреблять ежедневно 0,1 - 0,2 г…

ЖИРОРАСТВОРИМЫЕ ВИТАМИНЫ

Витамеры– вещества, сходные по химическому строению и обладающие физиологическим действием, характерным для того или иного витамина. Окисляясь в организме при участии биокатализатора, ретинол превращается в… Витамин А влияет на барьерную функцию кожи, слизистых, проницаемость клеточных мембран и биосинтез гликопротеинов,…

Витамин К (филлохинон).

Регулирует процесс свертывания крови. При недостатке его могут возникать самопроизвольные носовые кровотечения, кровавая рвота, внутренние кровоизлияния. Авитаминоз К встречается редко – смешанная пища достаточно богата им; кишечная микрофлора способна синтезировать витамин К.

Препарат «викасол» является производным витамина К₃.

ВОДОРАСТВОРИМЫЕ ВИТАМИНЫ

Аскорбиновая кислота является участником окислительно-восстановительных процессов. Участвует в синтезе коллагена, гормонов коры надпочечников,… При недостаточном поступлении витамина С с пищей отмечается снижение массы… Источником витамина С для человека служат плоды шиповника, черная смородина, облепиха, рябина, красный перец, лимоны,…

Витаминоподобные вещества

Антивитамины- это соединения, похожие по структуре на витамины, конкурирующие с витаминами в соответствующих биохимических процессах или выключающие… Примером конкурирующих антивитаминовмогут служить структурные аналоги… Примером выключающих антивитаминов является авидин — яичный белок, образующий с витамином Н нерастворимый биологически…

Контрольные вопросы

1. Приведите известные Вам классификации витаминов.

2. Охарактеризуйте биологическую роль витаминов.

3. Дайте определение авитаминозам, гиповитаминозам, гипервитаминозам.

4. Каковы причины авитаминозных и гиповитаминозных состояний организма человека?

5. Какие вещества называют антивитаминами? Каков механизм их действия?

6. Перечислите жирорасторимые витамины. Охарактеризуйте их биохимические функции.

7. Перечислите водорастворимые витамины. Производные каких витаминов являются коферментами, переносящими метильные и аминогруппы?

8. Объясните, почему сульфаниламидные препараты вызывают гибель бактерий и могут использоваться в качестве лекарств?

9. Какие витамины можно использовать в терапии кожных болезней?

ОСНОВНЫЕ ПРИНЦИПЫ ОРГАНИЗАЦИИ БИОМЕМБРАН

СТРОЕНИЕ И ФУНКЦИИ МЕМБРАН

Функции мембран: барьерная; контроль транспорта метаболитов; рецепция сигналов и их передача; ферментативная; контакт с другими клетками; якорь для… Каждая из мембран имеет структурные особенности и выполняет специфические… Липидампринадлежит главная роль в образовании мембран как клеточных структур: пластинчатая, «мембранная» форма и…

Фосфатидилхолин

2. Сфинголипиды (сфингомиелины) -липиды, содержащие аминоспирт сфингозин.

Церамид

3. Гликолипиды- углеводсодержащие соединения, в которых углеводная часть ковалентно связана с липидной.

Галактозилцерамид

4. Стероиды представлены холестерином:   Белкимогут быть частично или полностью погружены в мембрану (интегральные белки) либо располагаться на ее поверхности…

ТРАНСПОРТ ВЕЩЕСТВ ЧЕРЕЗ МЕМБРАНУ

Унипорт - транспорт одного вещества в одном направлении в зависимости от градиента.

Симпорт - транспорт двух веществ в одном направлении через один переносчик.

Антипорт - перемещение двух веществ в разных направлениях через один переносчик (рис. 16а).

Пассивный транспорт:

1. Простая диффузия.Небольшие нейтральные молекулы типа Н₂О, СО₂, О₂, NH₃, мочевина, этанол, гидрофобные низкомолекулярные органические вещества (стероидные гормоны, бензол) диффундируют через мембрану без участия специальных механизмов. Перенос веществ осуществляется по градиенту концентрации и с низкой скоростью (рис. 16б).

Облегченная диффузия

2а. Перенос с участием ионных каналов. Трансмембранный перенос ряда ионов (Са2+, Na+, K+, C1−) происходит через ионные каналы - белковые… 2б. Перенос с помощью трансмембранных белков-переносчиков (транслоказ).Для… Активный транспортвеществ протекает против концентрационного градиента и связан с расходованием энергии. Таким…

Контрольные вопросы

1. Перечислите основные мембранные структуры клетки.

2. Каков качественный и количественный состав мембран?

3. Какие липиды входят в состав биологических мембран? Каковы их свойства и функции?

4. В чем различие между периферическими и интегральными белками биологических мембран?

5. Какие факторы могут вызвать изменение структуры и проницаемости мембраны?

6. Перечислите виды транспорта веществ через мембраны. Какие из них требуют энергетических затрат?

7. Какую роль играют АТФ-азы в функционировании биологических мембран?

МЕХАНИЗМЫ ПЕРЕДАЧИ ГОРМОНАЛЬНОГО СИГНАЛА

Специфические особенности биологического действия гормонов: а) гормоны проявляют свое биологическое действие в ничтожно малых… б) гормональный эффект реализуется через белковые рецепторы и внутриклеточные вторичные посредники (мессенджеры);

Трансмембранная передача гормонального сигнала

Наиболее изученной является аденилатциклазная мессенджерная система(рис. 17).В ней задействованы: 1) рецептор гормона; 2) фермент аденилатциклаза;… Молекулы белковых гормонов(инсулин), гидрофильные молекулы (адреналин) не… Аденилатциклаза- интегральный белок плазматических мембран, его активный центр ориентирован в сторону цитоплазмы.…

Контрольные вопросы

1. Как происходит трансмембранная передача сигналов?

2. Какие соединения могут выступать в роли первичных мессенджеров, вторичных мессенджеров?

3. Охарактеризуйте основных участников и механизм действия аденилатциклазной мессенджерной системы.

4. Перечислите основные виды регуляции активности ферментов в клетке.

ВВЕДЕНИЕ В МЕТАБОЛИЗМ

Метаболизм (от греч. «превращение, изменение») или обмен веществ - совокупность химических реакций, протекающих в живом организме, обеспечивающих его жизнедеятельность.

Обмен веществ состоит из двух противоположных, одновременно протекающих процессов.

Катаболизм - органические вещества превращаются в конечные продукты (СО₂, Н₂О, мочевина), при этом выделяется энергия (экзергонические реакции).

Органоиды катаболической системы – митохондрии, лизосомы, пероксисомы.

Анаболизм - реакции синтеза сложных полимеров, при которых, как правило, используется энергия (эндергонические реакции).

Органоиды анаболической системы – эндоплазматический ретикулум, рибосомы.

Метаболиты - продукты метаболизма каких-либо соединений.

Метаболические пути - последовательное превращений одних веществ в другие, одного метаболита - в другой.

В метаболическом пути обычно есть реакция, протекающая с меньшей скоростью, чем все остальные - это лимитирующая стадия (реакция). Она определяет общую скорость превращения исходного вещества в конечный продукт метаболической цепи.

Фермент, катализирующий лимитирующую реакцию, называется регуляторным.

Реакции метаболизма, в основном, обратимы - их направление определяется расходом или удалением продукта.

При неизменных условиях концентрация ряда метаболитов в клетках и внеклеточных жидкостях постоянна. При заболеваниях стационарные концентрации метаболитов специфически меняются. На этом основаны биохимические методы лабораторной диагностики болезней.

ОБЩАЯ СХЕМА КАТАБОЛИЗМА

I этап – гидролитический. Под воздействием гидролаз в пищеварительном тракте белки, жиры, углеводы распадаются на соответствующие мономеры.

II этап – специфические пути. Мономеры основных пищевых веществ при участии ферментов, специфичных для каждого класса веществ, превращаются в два метаболита - пировиноградную кислоту (ПВК) и ацетил-КоА. На этом этапе высвобождается 1/3 энергии питательных веществ.

Ацетил-КоА (ацетилкоэнзим А) - макроэргический продукт конденсации коэнзима А с уксусной кислотой. Коэнзим А находится в клетке в свободном состоянии и взаимодействует с ферментом в момент реакции вместе с субстратом.

После образования ПВК дальнейший путь распада веществ до СО₂ и Н₂О происходит одинаково в общем пути катаболизма.

III этап - общий путь катаболизма. Он включает два процесса:

1) окислительное декарбоксилирование ПВК;

2) цикл Кребса (цикл трикарбоновых кислот (ЦТК), цитратный цикл).

В общем пути катаболизма образуются первичные доноры водорода для цепи переноса электронов, которые окисляются НАД⁺- или ФАД-зависимыми дегидрогеназами, передающими водород в дыхательную цепь.

Реакции общего пути катаболизма происходят в матриксе митохондрий, и восстановленные коферменты передают водород непосредственно на компоненты дыхательной цепи, расположенные во внутренней мембране митохондрий, где образуется АТФ.

На этом этапе высвобождается 2/3 энергии питательных веществ.

 

 

БИОЭНЕРГЕТИКА

Энергетическое обеспечение клетки может происходить в бескислородных условиях:   Энергия окисляющихся веществ используется для синтеза АТФ из АДФ. АТФ – универсальный источник энергии в организме. …

ОРГАНИЗАЦИЯ И ФУНКЦИОНИРОВАНИЕ

ДЫХАТЕЛЬНОЙ ЦЕПИ

Дыхательная цепь (электронотранспортная цепь, цепь переноса электронов) - система трансмембранных белков и переносчиков электронов, которые передают… Восстановленный НАД служит универсальным донором атомов водорода для…  

РАЗОБЩЕНИЕ ОКИСЛЕНИЯ И ФОСФОРИЛИРОВАНИЯ

Разобщители бывают: - естественные – продукты перекисного окисления липидов, жирных кислот с… - искусственные - динитрофенол, эфир, производные витамина К, анестетики, антибиотики (грамицидин, валиномицин)

ГЕНЕРАЦИЯ СВОБОДНЫХ РАДИКАЛОВ В КЛЕТКЕ

АФК образуются при изменении условий функционирования дыхательной цепи (например, при гипоксии), под действием УФ-лучей, при взаимодействии… Инактивация активных форм кислорода в клетках происходит под действием… Супероксиддисмутаза(СОД) превращает супероксид-анион кислорода в пероксид водорода Н2О2:

РЕАКЦИИ ОБЩЕГО ПУТИ КАТАБОЛИЗМА

ОКИСЛИТЕЛЬНОЕ ДЕКАРБОКСИЛИРОВАНИЕ ПВК

Пируватдегидрогеназный комплекс включает три фермента (пируватдекарбоксилаза (Е1), ацетилтрансфераза (Е2), дегидрогеназа дигидролипоевой кислоты… В состав пируватдегидрогеназного комплекса входит примерно по три десятка… По механизму «обратной связи» работу пируватдегидрогеназного комплекса ингибируют конечные продукты окислительного…

ЦИКЛ ТРИКАРБОНОВЫХ КИСЛОТ

Цикл Кребса - путь окисления молекул ацетил-KoA, в которые превращается в процессе катаболизма большая часть углеводов, жирных кислот и… Цикл трикарбоновых кислот проходит в матриксе митохондрий. Его стадии: 1. Реакция конденсации ацетил-KoA с оксалоацетатом при участии цитрат-синтазы с образованием лимонной кислоты:

Регуляция общего пути катаболизма

Окислительное декарбоксилирование ПВК. По механизму «обратной связи» работу пируватдегидрогеназного комплекса ингибируют конечные продукты окислительного декарбоксилирования - ацетил-KоА, НАДН + Н⁺, а также АТФ. Увеличивает активность комплекса пировиноградная кислота.

Также имеется регуляция со стороны гормонов: инсулин увеличивает активность комплекса, глюкагон - снижает.

Цикл Кребса регулируется по механизму «отрицательной обратной связи» с участием аллостерических ферментов.

НАДН ингибируют НАД-зависимые дегидрогеназы цикла. При уменьшении расхода АТФ активность дыхательной цепи снижается (дыхательный контроль), концентрация НАДН в клетке повышается, и ингибирование реакций 3, 4 и 8 ЦТК снижает активность цикла Кребса в целом.

Контрольные вопросы

1. Дайте определение понятиям "метаболизм", "катаболизм", "анаболизм".

2. Перечислите органоиды катаболической и анаболической систем.

3. Какие основные этапы включает катаболизм?

4. Приведите схему окислительного декарбоксилирования пировиноградной кислоты.

5. Охарактеризуйте строение пируватдегидрогеназного комплекса.

6. Приведите общую схему цитратного цикла. Какие ферменты катализируют превращения субстратов в этом цикле?

7. Как происходит регуляция окислительного декарбоксилирования пирувата и цикла Кребса?

8. Какова роль и энергетическая ценность общего пути катаболизма?

9. Что понимают под энергетическим зарядом клетки?

10. Какие вам известны пути ресинтеза АТФ?

11. Поясните механизм действия дыхательной цепи.

12. Перечислите формы гипоэнергетических состояний и их причины.

13. Что такое разобщение дыхания и фосфорилирования, в чем его биологическая роль?

14. Приведите примеры свободнорадикальных процессов в клетке, охарактеризуйте их значение для организма.

ОБМЕН УГЛЕВОДОВ

ПЕРЕВАРИВАНИЕ углеводов

Крахмал - форма накопления глюкозы растениями; лактоза содержится в грудном молоке; глюкоза и фруктоза - в меде и фруктах; мальтоза поступает с… Норма потребления углеводов - 400-500 г/сутки, с ними поступает основное… Пищевые поли- и дисахариды подвергаются ферментативному перевариванию в пищеварительном тракте, где происходит…

ОБМЕН ГЛИКОГЕНА

Синтез гликогена (гликогенез) происходит в течение 1-2 часа после приема углеводной пищи и требует затрат АТФ. 1). Фосфорилирование глюкозы при участии гексокиназы (в печени – глюкокиназы)…  

ГЛИКОЛИЗ

Аэробный гликолиз: образуется ПВК, поступающая в митохондрии, и далее, в общем пути катаболизма, распадающаяся до СО2 и Н2О. Аэробный гликолиз –… Анаэробный гликолиз: образуется ПВК, которая затем превращается в лактат.… Реакции гликолиза:

Включение фруктозы и галактозы в гликолиз

  Фруктозо-1-фосфат расщепляется альдолазой на глицеральдегид и… Глицеральдегид может включаться в гликолиз после его фосфорилирования с участием АТФ. Образовавшийся…

ЧЕЛНОЧНЫЕ МЕХАНИЗМЫ

Глицеролфосфатная челночная системаработает в клетках белых мышц, печени, мозге. Водород от НАДH в цитозоле передаётся на диоксиацетонфосфат…  

ЦИКЛ КОРИ

  При интенсивной мышечной работе и в условиях отсутствия или недостаточного… Лактат переносится кровью в печень и превращается в пируват, а затем в глюкозу (глюконеогенез), которая с током крови…

СПИРТОВОЕ БРОЖЕНИЕ

Спиртовое брожение осуществляется дрожжеподобными организмами, а также некоторыми плесневыми грибками:

 

Механизм реакции близок к гликолизу. Расхождение начинается после этапа образования пирувата. При гликолизе пируват при участии фермента ЛДГ и кофермента НАДН восстанавливается в лактат. При спиртовом брожении пируват подвергается декарбоксилированию, в результате образуется ацетальдегид, а затем при восстановлении его - этанол:

 

 

При молочнокислом брожении ПВК не декарбоксилируется, а, как и при гликолизе в животных тканях, восстанавливается при участии ЛДГ за счет водорода НАДН.

 

Пентозофосфатный путь превращения глюкозы

- поставляет клеткам кофермент НАДФН, использующийся как донор водорода в реакциях восстановления; - обеспечивает клетки пентозофосфатами для синтеза нуклеотидов и нуклеиновых… Пентозофосфатный путь не приводит к синтезу АТФ.

ГЛЮКОНЕОГЕНЕЗ

Функция глюконеогенеза – поддержание уровня глюкозы в крови при длительном голодании и интенсивных физических нагрузках. Постоянное поступление… Субстраты глюконеогенеза – ПВК, молочная кислота, глицерин, аминокислоты. Их… Большинство реакций глюконеогенеза являются обратными гликолизу. Они катализируются теми же ферментами, что и…

РЕГУЛЯЦИЯ ОБМЕНА УГЛЕВОДОВ

Направление метаболизма глюкозы в печени связано с ритмом питания. Переключение процессов синтеза и мобилизации гликогена в печени происходит при… Инсулин и глюкагон постоянно присутствуют в крови, но при переходе из абсорбтивного состояния в постабсорбтивное…

Нарушения углеводного обмена

Нарушение гидролиза и всасывания углеводов.

Всасывание углеводов нарушается при недостаточности амилолитических ферментов желудочно-кишечного тракта (амилаза панкреатического сока и др.). При этом поступающие с пищей углеводы не расщепляются до моносахаридов и не всасываются. Развивается углеводное голодание.

Всасывание углеводов страдает также при нарушении фосфорилирования глюкозы в кишечной стенке, возникающем при воспалении кишечника, при отравлении ядами, блокирующими фермент гексокиназу.

Гликогенозы

Гликогеноз О типа (агликеноз)развивается при недостаточности гликогенсинтазы. Характеризуется резким снижением запасов гликогена в печени,… Недостаточность ферментов, участвующих в распаде гликогена, приводит к его… Таблица 1. Болезни, связанные с нарушением обмена гликогена. Название болезни Причины …

Нарушения промежуточного обмена углеводов

2. Расстройства функции печени, где в норме часть молочной кислоты ресинтезируется в глюкозу и гликоген. При поражении печени ресинтез нарушается.… 3. Гиповитаминоз В1. Нарушается окисление ПВК, т. к. витамин B1 входит в… При гиповитаминозе B1 нарушается пентозофосфатный путь обмена углеводов, в частности, образование рибозы.

Гипер- и гипогликемия

Для диагностики гипергликемий исследуются изменения во времени уровня глюкозы в крови, обычно после приема 50 г или 100 г глюкозы, растворенной в… У здорового человека после приема глюкозы содержание ее в крови нарастает,… Для оценки гликемических кривых введено несколько показателей, из которых наиболее важное значение имеет коэффициент…

Глюкозурия

При тяжелых формах сахарного диабета содержание глюкозы в моче может достигать 8-10%. Осмотическое давление мочи повышается. Суточный диурез… Реже встречается глюкозурия почечного происхождения, связанная с… Как временное явление глюкозурия может возникнуть при некоторых острых инфекционных и нервных заболеваниях, после…

Контрольные вопросы

1. Перечислите основные пищевые источники углеводов. Какова суточная потребность в углеводах у взрослого человека?

2. Охарактеризуйте процесс переваривания и всасывания углеводов в пищеварительном тракте.

3. Приведите схему синтеза гликогена из глюкозы, перечислите ферменты, участвующие в этом процессе.

4. Рассмотрите механизм фосфоролитического расщепления гликогена. Какова роль гликогена в поддержании гомеостаза глюкозы?

5. Каковы основные этапы гликолиза? В чем сходство и различие между аэробным и анаэробным гликолизом?

6. Какова энергетическая ценность распада глюкозы в аэробных условиях?

7. Какие реакции включает цикл Кори? В чем его биохимическая функция?

8. В чем сходство и различие гликолиза и брожения?

9. Что понимают под гликонеогенезом? Каковы основные стадии этого процесса?

10. Как функционируют глицеролфосфатный челночный механизм и малат-аспартатная челночная система?

11. Каковы особенности обмена фруктозы и галактозы?

12. Какие гормоны участвуют в регуляции гомеостаза глюкозы?

13. Каков химизм пентозофосфатного пути обмена глюкозы?

14. Какова биологическая роль образующихся восстановленных форм НАДФ?

15. Перечислите известные Вам нарушения обмена углеводов.

16. В чем могут быть причины возникновения гипергликемии и гипогликемии?

II. ЛАБОРАТОРНЫЙ ПРАКТИКУМ

Работа 1. Анализ аминокислот и белков

Качественный анализ аминокислотных смесей методом бумажной хроматографии.

Для проявления хроматограмму помещают в хроматографический сосуд, на дно которого налита смесь бутанола, уксусной кислоты и воды (15:3:7) так, чтобы… Рассчитывают Rf (коэффициенты распределения) по формуле: Rf = Хi / Х0,

Цветные реакции на белки.

Реакция Миллона.

Реактив Миллона состоит из нитратов ртути (I) и (II) в HNO₃ с примесью HNO₂. Реакция реактива Милона с белками обусловлена присутствием в них остатка тирозина.

 

В пробирку наливают 0,5 мл раствора белка и 0,5 мл реактива Миллона. Образуется белый осадок под действием соли ртути и азотной кислоты, входящих в состав реактива Миллона. При нагревании осадок окрашивается сначала в розовый, а затем в коричнево-красный цвет.

 

Реакция Адамкевича.

Реакция обусловлена присутствием в белке остатков аминокислоты триптофана.

К 1 мл сыворотки добавляют 0,5 мл ледяной уксусной кислоты (содержит примесь глиоксилевой кислоты) и нагревают до растворения белка. Содержимое пробирки охлаждают и, наклонив пробирку, осторожно по стенке наслаивают 1 мл концентрированной серной кислоты. На границе двух слоев жидкости возникает красно-фиолетовое окрашивание. При нагревании окрашивание появляется быстрее.

Нингидриновая реакция.

Реакция обусловлена наличием в белке остатков α-аминокислот.

 

+ R-СОН + СО₂ + NН₃

 

В пробирку наливают 1 мл раствора белка, добавляют 5 капель 0,2% раствора нингидрина и нагревают. Через несколько минут наблюдают появление сине-фиолетового окрашивания.

2.4. Реакция Шульце – Распайля.

Реакция Шульце - Распайля обусловлена наличием в белке остатков триптофана. Они, взаимодействуя с оксиметилфурфуролом, дают продукты конденсации, окрашенные в вишнево-красный цвет. Оксиметилфурфурол образуется из фруктозы в присутствии концентрированной серной кислоты:

К 0,5 мл сыворотки добавляют 1-2 капли 10% раствора сахарозы и по стенке пробирки наслаивают 1 мл конц. серной кислоты. Слегка встряхивают пробирку. На месте соприкосновения воды и кислоты появляется вишнево-красное окрашивание.

Реакции осаждения белков.

Осаждение белков при нагревании.

В пробирку наливают 0,5 мл раствора белка и нагревают. Наблюдают появление опалесценции. При кипячении может выпасть осадок.

Осаждение белков солями тяжелых металлов.

Белки при взаимодействии с солями тяжелых металлов (медь, ртуть, свинец и др.) денатурируют и образуют нерастворимые в воде комплексные соединения вследствие адсорбции тяжелого металла на поверхности белковой молекулы. На этом основано использование белков в качестве противоядия при отравлении тяжелыми металлами.

В две пробирки наливают по 0,5 мл раствора белка. В первую добавляют 2 капли 5% раствора сульфата меди, во вторую – 2 капли 5% раствора ацетата свинца. В обеих пробирках выпадает осадок белка.

Осаждение белков концентрированными минеральными кислотами.

Выпадение белка в осадок при взаимодействии с концентрированными минеральными кислотами обусловлено дегидратацией белковых молекул, образованием нерастворимых комплексных солей белка и кислот. В избытке серной и соляной кислот осадок белка растворяется. Избыток азотной кислоты не растворяет осажденный белок. Реакция с азотной кислотой используется при клинических исследованиях мочи на присутствие в ней белка (проба Геллера).

В пробирку наливают 1 мл концентрированной азотной кислоты и затем, наклонив пробирку, осторожно приливают по стенке равный объем раствора белка. На границе двух жидкостей появляется белый осадок белка. Встряхивают пробирку и добавляют избыток азотной кислоты. Осадок не исчезает. Повторяют опыт с концентрированными соляной и серной кислотами.

Осаждение белков органическими кислотами.

Реакции с трихлоруксусной и сульфосалициловой (2-гидрокси-5-сульфобензойной) кислотами являются специфическими и чувствительными. Их используют в клинических лабораториях при обнаружении белка в моче и других биологических жидкостях. Сульфосалициловая кислота способна осаждать продукты распада белков - пептиды. Трихлоруксусная кислота осаждает только белки. Ее используют при определении небелкового (остаточного) азота крови, в состав которого входят продукты распада и обмена белков.

В две пробирки наливают по 1 мл раствора белка. В одну пробирку добавляют 1-2 капли сульфосалициловой кислоты, а в другую - трихлоруксусной кислоты. Выпадает осадок белка.

Контрольные вопросы

1. Как можно разделить смесь аминокислот в гидролизате белка?

2. Какие цветные реакции на белки знакомы Вам из курса биоорганической химии?

3. Какая аминокислота, содержащаяся в белках, обнаруживается реакцией Миллона? Приведите ее формулу.

4. Какая аминокислота, содержащаяся в белках, обнаруживается реакциями Адамкевича и Шульце - Распайля? Приведите ее формулу.

5. Чем обусловлено осаждение белков при действии солей тяжелых металлов?

6. Что понимают под денатурацией белка?

7. Какое практическое применение находят реакции осаждения белков органическими кислотами?

8. Почему в клинической практике для осаждения белков используют азотную, а не серную или соляную кислоты?

 

Работа 2. Сложные белки – фосфопротеины и гликопротеины

Фосфопротеины.

Типичным представителем фосфопротеинов является казеин молока. При щелочном гидролизе казеин распадается на белок и фосфорную кислоту.

Открытие в гидролизате казеина белкового компонента.

К 0,5 мл гидролизата казеина прибавляют 5 капель 10% раствора гидроксида натрия и по каплям 1% раствор сульфата меди до появления сине-фиолетового окрашивания. Положительная биуретовая реакция доказывает белковую природу казеина.

Открытие в гидролизате фосфорной кислоты.

1 мл гидролизата нейтрализуют 25% азотной кислотой (контроль по индикаторной бумаге) и добавляют 0,5 мл раствора молибдата аммония в азотной кислоте. Через 5 минут осадок белка и продуктов неполного гидролиза белков отфильтровывают. К фильтрату добавляют 0,5 мл 2% раствора гидрохинона и оставляют на 5 минут. Затем добавляют по каплям добавляют 1 мл раствора карбонат-сульфита натрия. Появляется синее окрашивание раствора, обусловленное образованием молибденовой сини.

Определение изоэлектрической точки казеина.

В пять пробирок приливают из бюретки следующие количества 0,1 н. раствора уксусной кислоты: в первую —0,25 мл; во вторую — 0,5 мл; в третью — 1,0 мл; в четвертую — 2,0 мл и в пятую — 4,0 мл. Из другой бюретки в той же последовательности в каждую пробирку прибавляют 8,75 мл, 8,5 мл, 8,0 мл, 7,0 мл и 5,0 мл воды. После добавления 0,1% раствора казеина в ацетате натрия значения рН в полученных смесях будут равны 5,3; 5,0; 4,7; 4,4 и 4,1 соответственно.

В каждую из пробирок приливают пипеткой по 1 мл раствора казеина и наблюдают за степенью помутнения раствора в них. Там, где помутнение максимально, рН раствора соответствует изоэлектрической точке белка (рН 4,7).

 

Гликопротеины.

Муцины пищеварительного тракта – гликопротеины, углеводная часть которых представлена мукополисахаридами. Они предохраняют слизистые оболочки от химических, механических, термических воздействий и переваривания протеолитическими ферментами.

Выделение муцина из слюны.

В две пробирки собирают по 1 мл слюны и добавляют в каждую по каплям 1% раствор уксусной кислоты до появления сгустков муцина. Осадок муцина в пробирках осторожно промывают водой, придерживая сгусток палочкой.

Реакции на белковую часть (биуретовая реакция).

Для открытия белка в пробирку с осадком муцина добавляют при помешивании 10% раствор гидроксида натрия до растворения сгустка и производят биуретовую реакцию. Положительный результат реакции доказывает белковую природу муцина.

Реакция на углеводную группировку (нафтоловая проба).

Углеводы муцина обнаруживают нафтоловой пробой (реакция Подобедова - Молиша). Из гексоз под действием серной кислоты образуется оксиметилфурфурол. При взаимодействии его с α-нафтолом образуется окрашенный продукт конденсации.

Во вторую пробирку с осадком муцина добавляют 0,5 мл 1% спиртового раствора α-нафтола, перемешивают и по стенке осторожно наслаивают 0,5мл конц. серной кислоты. На границе раздела жидкостей постепенно появляется фиолетово-красное кольцо.

Доказательство наличия углевода в яичном альбумине.

В пробирку наливают 4 мл разбавленного раствора яичного альбумина, прибавляют 0,5 мл 0,1%-ного раствора α-нафтола, хорошо перемешивают. По стенке осторожно наслаивают конц. серную кислоту. При стоянии на границе раствора наблюдают фиолетовое кольцо.

 

Контрольные вопросы

1. Какие белки называются сложными

2. Как образуется связь между полипептидной цепью и фосфорной кислотой в фосфопротеинах?

3. Почему для плода, зародыша, новорожденного особую роль играют фосфопротеины?

4. В чем различие между гликопротеинами и протеогликанами?

5. Какие типы связей существуют между углеводными компонентами и белками?

6. Почему гликопротеины менее чувствительны к действию денатурирующих факторов, чем простые белки?

Работа 3. Сложные белки – нуклеопротеины и хромопротеины

Нуклеопротеины

Дезоксирибонуклеопротеины (ДНП) выделяют из тканей, богатых клеточными ядрами (зобная железа, селезенка, сперматозоиды). ДНП растворяются в растворах солей средней концентрации, например в хлориде натрия (1 М), и снова осаждаются при разведении последних (до 0,15 М) в виде волокнистого нуклеопротеина.

Выделение дезоксирибонуклеопротеинов из селезенки.

В ступке растирают 5 г селезенки с равным количеством песка, добавляют 5 мл охлажденного 2 М раствора хлорида натрия, а затем постепенно небольшими порциями 25 мл охлажденного 1 М раствора хлорида натрия. Растирание продолжают 10-15 мин в ступке, охлаждаемой льдом. Полученную массу переносят в центрифужные пробирки и центрифугируют 15 мин. Измеряют объем центрифугата и вливают его в шестикратный объем воды тонкой струей, медленно размешивая жидкость деревянной палочкой. Нуклеопротеин в виде нитей наматывается на палочку.

Если выделился хлопьевидный осадок, то ему дают отстояться, а остаток жидкости подвергают центрифугированию.

Реакция с дифениламином.

Дезоксирибонуклеиновую кислоту обнаруживают по ее реакции с дифениламином. В пробирку переносят немного осадка ДНК и растворяют его в 1-2 мл 0,4%-ного раствора гидроксида натрия. К раствору добавляют равный объем раствора дифениламина и смесь нагревают в кипящей водяной бане около 10-15 мин. Появляется синее окрашивание раствора.

Хромопротеины.

Представителем хромопротеинов является белок эритроцитов крови млекопитающих гемоглобин. Его белковой частью глобин, а небелковой – гем (протопорфирин, пиррольные кольца которого связаны с атомом железа).

Бензидиновая проба на геминовую группировку гемоглобина.

В пробирку наливают 0,5 мл сильно разведенной крови и кипятят несколько минут, затем охлаждют. Добавляют 0,5 мл раствора бензидина и несколько капель 3% раствора пероксида водорода. Появляется зеленая, переходящая в синюю окраска. При действии на гемоглобин концентрированной уксусной кислоты гем переходит в гемин, который и катализирует окисление бензидина пероксидом водорода.

Бензидиновая проба применяется при клинических и судебно-медицинских исследованиях для обнаружения минимальных количеств крови в биологических объектах.

Контрольные вопросы

1. Перечислите функции хромопротеинов в организме.

2. Укажите строение белковой части гемоглобина.

3. Почему гемоглобин зародыша и ребенка обладает разным сродством к кислороду?

4. После пожара обнаружен труп. Каким простым способом можно определить, погиб ли человек во время пожара или он умер до пожара?

5. Охарактеризуйте химический состав нуклеопротеинов и их функции в организме.

6. Что лучше растворяется в воде: нуклеиновые кислоты или нуклеопротеины? Почему?

Работа 4. Ферменты

Открытие пероксидазы в картофеле.

Картофель натирают на терке. Небольшое его количество переносят в пробирку, добавляют 1 мл 1%-ного раствора пирогаллола и 2 капли 2%-ного раствора пероксида водорода. При стоянии выпадает желто-бурый осадок пурпурогаллина:

 

 

Многократное дегидрирование (окисление) пирогаллола и ряда промежуточных продуктов до образования пурпурогаллина происходит с участием пероксидазы, передающей атомы водорода с субстрата на пероксид водорода.

Открытие пепсина в желудочном соке.

3. Гидролиз крахмала α-амилазой слюны Рот ополаскивают 2—3 раза водой для удаления остатков пищи. Отмеряют 50 мл… Готовят 2 водяные бани с температурой 37-40 и 100°С. В пробирки наливают растворы в соответствии с таблицей. Помещают…

Специфичность действия ферментов амилазы и сахаразы.

Специфическими субстратами для амилазы являются полисахариды крахмал и гликоген. Субстратом для фермента сахаразы служит дисахарид сахароза. Протекание гидролиза в присутствии ферментов можно обнаружить по пробе Троммера, которую не дают исходные углеводы.

Нумеруют четыре пробирки. В пробирки 1 и 2 наливают по 2 мл раствора крахмала; в пробирки 3 и 4 - по 2 мл раствора сахарозы. В пробирки 1 и 3 вносят по 0,5 мл раствора слюны, а в пробирки 2 и 4 - по 0,5 мл 1% раствора дрожжевой сахаразы. Перемешивают и ставят на 10 мин в водяную баню с температурой 38-40°С. После охлаждения проводят реакции с йодом на присутствие крахмала в пробах 1 и 2 и пробу Троммера на наличие глюкозы - в пробах 3 и 4. Делают заключение о специфичности изученных ферментов.

 

Контрольные вопросы

1. Какова роль ферментов в организме?

2. К какому классу химических соединений можно отнести ферменты?

3. К каким классам относятся ферменты, использованные в лабораторной работе?

4. Почему при кипячении растворов ферментов происходит их инактивация?

5. В чем проявляется специфичность ферментов сахаразы и амилазы? Как ее можно доказать?

6. Какое влияние оказывает понижение рН среды и на активность α-амилазы слюны и почему?

7. Какой принцип лежит в основе качественного определения ферментов?

Работа 5. Определение активности ферментов

В первую пробирку наливают 0,5 мл 1% раствора хлорида натрия, во вторую — 0,5 мл 1% раствора сульфата меди, в третью — 0,5 мл дистиллированной воды.… 2. Определение активности α-амилазы слюны по Вольгемуту. Метод основан на установлении предельного разведения раствора α-амилазы, при котором еще происходит в…

Контрольные вопросы

1. Что такое активаторы и ингибиторы ферментов?

2. Как можно исследовать влияние активаторов и ингибиторов на действие фермента?

3. Фермент ацетилхолинэстераза катализирует гидролиз ацетилхолина – нейромедиатора, выделяющегося в синапсах холинэргических нервов. Продукты его распада – ацетат и холин – не способны действовать как нейромедиаторы. Гидролиз ацетилхолина прерывается калимином – лечебным препаратом, используемым при двигательных нарушениях после травм, параличей, в восстановительном периоде после перенесенного полиомиелита, энцефалита и т.п. Ингибирование ацетилхолинэстеразы отражает следующая схема:

 

Сравните структурные формулы ингибитора и субстрата. Почему можно предположить, что ингибитор связывается в активном центре фермента? Как при действии калимина изменится проведение нервного импульса (увеличится, уменьшится, не изменится)?

Работа 6. Витамины

Опыт 1. Качественные реакции на витамин А.

Реакция с хлоридом сурьмы (III).

1-2 капли рыбьего жира или раствора витамина А в масле помещают в сухую пробирку, добавляют 5-6 капель раствора хлорида сурьмы (III) в хлороформе и 2-3 капли уксусного ангидрида. Появляется синее окрашивание, постепенно переходящее в розово-фиолетовое. Реакция неспецифична, так как ее могут давать, кроме витамина А, и некоторые другие соединения, содержащие сопряженные двойные связи.

Реакция с серной кислотой (реакция Друммонда).

1 каплю рыбьего жира (или препарата витамина А) растворяют в 4 каплях хлороформа и добавляют 1-2 капли концентрированной серной кислоты. Появляется голубое окрашивание, быстро переходящее в буро-красное.

В основе приведенных реакций лежит дегидратирующее действие хлорида сурьмы (III) и серной кислоты на витамин А.

 

Опыт 2. Качественные реакции на витамин D (кальциферол).

Реакция с раствором брома в хлороформе.

В сухой пробирке смешивают 0,5 мл рыбьего жира и 0,5 мл раствора брома в хлороформе. В присутствии витамина D появляется зеленовато-голубое окрашивание. Реакция неспецифична.

Реакция с анилином.

В сухую пробирку наливают 0,5 мл рыбьего жира и 0,5 мл смеси анилина с концентрированной соляной кислотой (15:1), хорошо перемешивают, осторожно нагревают до кипения и кипятят 1 минуту. При наличии витамина D появляется зеленая, а затем красная окраска образовавшейся эмульсии. Пробирку оставляют при комнатной температуре. Эмульсия расслаивается, нижний слой окрашивается в ярко-красный цвет.

 

Витамин D (кальциферол)

Опыт 3. Качественная реакция на витамин Е (токоферол).

Реакция с концентрированной серной кислотой.

К 5-6 каплям 0,1%-ного спиртового раствора токоферола в сухой пробирке прибавляют 0,5 мл концентрированной азотной кислоты и встряхивают. Образуется эмульсия, которая постепенно расслаивается, и ее верхний слой приобретает красную окраску. Окрашивание вызвано окислением токоферола.

 

Реакция с хлоридом железа (III).

В сухую пробирку берут 4-5 капель 0,1%-ного спиртового раствора α-токоферола, прибавляют 0,5 мл хлорида железа (III) и тщательно перемешивают. Раствор окрашивается при нагревании в красный цвет в результате окисления токоферола хлоридом железа (III).

Опыт 4. Качественная реакция на витамин К (викасол).

Опыт 5. Реакция окисления витамина В1 (тиамина) в тиохром. К 0,5 мл раствора тиамина, приливают 5-6 капель 5%-ного раствора К3[Fe(CN)6] и…  

Опыт 8. Качественная реакции на витамин РР (никотинамид, никотиновая кислота).

5-10 мг никотиновой кислоты растворяют при нагревании в 10-20 каплях 10% раствора уксусной кислоты. К нагретому до кипения раствору добавляют равный объем 5% раствора ацетата меди. Жидкость окрашивается в голубой цвет, а при стоянии выпадает осадок синего цвета медной соли никотиновой кислоты.

Опыт 9. Качественные реакции на витамин С (аскорбиновую кислоту).

9.1. Взаимодействие витамина С с К₃[Fe(CN)₆].

К 5 мл 0,02%-ного раствора витамина С прибавляют по несколько капель 5%-ного раствора гидроксида калия и 10%-ного раствора К₃[Fe(CN)₆], перемешивают, затем добавляют 2-3 капли 10%-ного раствора соляной кислоты и 1-2 капли 10%-ного раствора хлорида железа (III). Появляется сине-зеленое окрашивание и постепенно образуется синий осадок берлинской лазури - Fe₄ [Fe(CN)₆]₃.

 

L-аскорбиновая L-дегидроаскорбиновая

кислота кислота

3K₄[Fe(CN)₆] + 4FeCl₃ → Fe₄[Fe(CN)₆]₃ ↓ + 12KCl

Реакция с метиленовой синью.

В пробирку наливают 2 капли 10% раствора метиленовой сини, 2 капли 10% раствора гидрокарбоната натрия, 10 капель раствора витамина С и нагревают. Жидкость обесцвечивается.

 

Опыт 10. Количественное определение аскорбиновой кислоты в моче методом Тильманса.

Метод основан на окислении аскорбиновой кислоты в дегидроаскорбиновую кислоту 2,6-дихлорфенолиндофенолом, который в кислой среде восстанавливается в… Наливают в коническую колбочку 10 мл мочи, добавляют 10 мл дистиллированной… Содержание витамина С в суточном количестве мочи вычисляют по формуле:

Контрольные вопросы

1. Какие вещества относятся к витаминам? Какова их общая функция в организме?

2. Перечислите биохимические функции витаминов, определение которых проводилось в лабораторной работе.

3. Дайте определение авитаминозам, гипо- и гипервитаминозам.

4. Какие методы, кроме титриметрического, могут использоваться для количественного определения витаминов?

Работа 7. Оксидоредуктазы

Обнаружение дегидрогеназы (ксантиноксидаза, альдегиддегидрогеназа, КФ 1.1.3.22) в молоке (реакция Шардингера).

В три пробирки наливают по 2 мл свежего коровьего молока. Одну пробу кипятят в течение 2 - 3 мин и охлаждают. В прокипяченную пробу и в одну из некипяченых проб добавляют по 0,5 мл 0,4%-ного раствора формальдегида, а в другую некипяченую - 0,5 мл воды. Затем во все три пробирки приливают по 2 капли 0,01%-ного раствора метиленового синего. Содержимое пробирок перемешивают и заливают в каждую по 3-4 капли вазелинового масла. Все пробы помещают в водяную баню при 40°С. Через некоторое время жидкость в некипяченой пробе, содержащей субстрат, обесцвечивается за счет образования восстановленной формы метиленового синего:

 

 

Если бесцветный раствор метиленового синего встряхнуть на воздухе, то он вновь приобретает синий цвет:

 

Эту реакцию можно использовать для отличия сырого молока от кипяченого.

Сопоставление редокс-потенциалов рибовлавина и метиленового синего.

В пробирку наливают 5 - 6 капель воды, 1 каплю раствора рибофлавина и добавляют по каплям раствор метиленового синего до появления зеленовато-синего…

Определение каталазы по А.Н. Баху и А.И. Опарину.

Одновременно ставят контроль с инактивированным нагреванием в кипящей водяной бане в течение 5 мин ферментным раствором (20 мл). К этому раствору… По разности между опытным и контрольным титрованием находят количество… Расчет количества пероксида водорода, разложенного ферментом, ведут в соответствии с уравнением реакции:

Контрольные вопросы

1. Какие реакции катализируют ферменты класса оксидоредуктаз?

2. Рассмотрите роль дегидрогеназ в процессах биологического окисления.

3. Для опыта 3 составьте схему переноса водорода (электронов и ионов водорода) с учетом стандартных окислительно-восстановительных потенциалов использованных компонентов.

 

Работа 8. Обмен углеводов

Опыт 1. Количественное определение активности амилазы в сыворотке крови.

Фермент амилаза катализирует гидролиз α-1,4-гликозидной связи крахмала и гликогена. Метод основан на колориметрическом определении концентрации…    

Опыт 2. Количественное определение пировиноградной кислоты в моче.

Наиболее резкое увеличение концентрации пирувата (ПВК) в крови и, как следствие, в моче, отмечается при мышечной работе и В1- витаминной… Принцип метода: пируват с 2,4-динитрофенилгидразином образует окрашенное…  

Опыт 3. Экспресс-диагностика патологий углеводного обмена.

Реакция Троммера с гидроксидом меди.

К 1 мл мочи приливают равный объем 10%-ного раствора гидроксида натрия и по каплям 1% раствор сульфата меди до появления неисчезающего осадка гидроксида меди (II). Появление при нагревании красного окрашивания свидетельствует о присутствии в моче глюкозы.

Выявление фруктозурии пробой Селиванова.

В 2 пробирки наливают по 1 мл раствора резорцина и добавляют в одну из них 2 мл нормальной, а в другую - патологической мочи. Обе пробирки нагревают… 3.3. Энзиматический метод полуколичественного определения глюкозы в моче с… Полоски "GLUCOPHAN" имеют поперечную полосу светло-желтого цвета, пропитанную растворами ферментов…

Контрольные вопросы

1. Каковы оптимальные условия функционирования панкреатической амилазы?

2. Как можно определить наличие продуктов гидролиза крахмала в пробе?

3. К каким классам относятся ферменты, расщепляющие гликоген до глюкозы?

4. Какие соединения являются продуктами аэробного и анаэробного гликолиза?

5. Почему в организме сохраняется энергетически невыгодный анаэробный гликолиз?

6. Какая функциональная группа молекулы глюкозы обусловливает положительную пробу Троммера?

7. При каких заболеваниях или физиологических состояниях наблюдается глюкозурия?

8. Укажите причины развития фруктозурии.

9. Как объяснить снижение сахара в крови после введения инсулина?

Литература

1. Березов, Т.Т. Биологическая химия. / Т.Т. Березов, Б.Ф. Коровкин. - М.: ОАО "Издательство "Медицина"", 2007. - 704 с.

2. Биохимия. / Под ред. Е.С. Северина. - М.: ГЭОТАР-Медиа, 2003. - 779 с.

3. Биохимия. Краткий курс с упражнениями и задачами. / Под ред. Е.С. Северина, А.Я. Николаева. - М.: ГЭОТАР-МЕД, 2001. - 448 с.

4. Зубаиров, Д.М. Руководство к лабораторным занятиям по биологической химии. / Д.М. Зубаиров, В.Н. Тимербаев, В.С. Давыдов. - М.: ГЭОТАР-Медиа, 2005. - 392 с.

5. Кушманова, О.Б. Руководство к лабораторным занятиям по биологической химии. / О.Б. Кушманова, Г.И. Ивченко. - М. - 1983.

6. Ленинджер, А. Основы биохимии / А. Ленинджер. - М., «Мир». - 1985.

7. Марри, Р. Биохимия человека. / Р. Марри, Д. Греннер, П. Мейес, В. Родуэлл. - Т. 1. - М.: Мир, 1993. - 384 с.

8. Марри, Р. Биохимия человека. / Р. Марри, Д. Греннер, П. Мейес, В. Родуэлл. - Т. 2. - М.: Мир, 1993. - 415 с.

9. Николаев, А.Я. Биологическая химия. / А.Я. Николаев. - М.: Медицинское информационное агентство, 2004. - 566 с.

10. Основы аналитической химии. / Под ред. Ю.А. Золотова. - Кн. 2. - М.: Высшая школа, 1996. - 461 с.

11. Справочник. Лабораторные методы исследования в клинике. / Под редакцией проф. В.В. Меньшикова. - М. Медицина. - 1987.

12. Филиппович, Ю.Б. Основы биохимии. / Ю.Б. Филиппович. - М.: Высшая школа, 1993. - 496 с.

13. Филиппович, Ю.Б. Упражнения и задачи по биологической химии. / Ю.Б. Филиппович, Г.А. Севастьянова, Л.И. Щеголева. - М.: Просвещение, 1986. - 144 с.

14. Филиппович, Ю.Б. Практикум по общей биохимии / Ю.Б. Филиппович и др. - Учеб. пособие. - М.: Просвещение, 1982.

15. Эллиот В, Эллиот Д. Биохимия и молекулярная биология. / В. Эллиот, Д. Эллиот. - М. - 1999.