Разделы биотехнологии

Разделы биотехнологии. Биоэнергетика как раздел биотехнологии Установление единообразия механизмов энергетических процессов во всем живом мире - от микроорганизмов и растений до человека, и вскрытие механизмов преобразования энергии в живых клетках создало предпосылки управления энергетическими процессами отдельных организмов и их сообществ, а также конструирования биоэнергетических установок различных типов, в том числе биологических генераторов тока. Это позволяет говорить о превращении биоэнергетики в один из разделов биотехнологии и в одно из перспективных направлений НТП, интенсивно развиваемое в настоящее время и обещающее эффективное разрешение энергетической и сырьевой проблем.

Биоэнергетика в широком смысле слова означает совокупную энергетику биологического круговорота биосферы Земли, которая происходит с участием всех населяющих биосферу организмов - микроорганизмов, растений, животных.

Восходящая линия биологического круговорота - накопление химической энергии органических соединений в процессе фотосинтеза - химического процесса связывания воды и углекислого газа за счет энергии солнечного излучения с образованием углеводов и других более сложных соединений. На планете за год воспроизводится около 232.5 млрд. тонн сухого органического вещества, что соответствует примерно 6000.10 2 кдж энергии.

Энерговооруженность жизни в ходе эволюции возрастает. Однако деятельность людей в масштабах биосферы все более оказывается разрушительной, ограничивающей возможности дальнейшего развития биоэнергетики. Происходит не только уничтожение отдельных видов растений и животных, не только нарушение их естественных комплексов - биогеоценозов - разрушается структура биосферы, ее циклическая организация, способность к самоочищению. Но с помощью расширяющегося прогнозно-планового регулирования происходит постепенное превращение биосферы в сферу разума - ноосферу.

Все в более расширяющихся масштабах будет осуществляться экологизация и биологизация производственной деятельности людей, т. е. все большее включение этой деятельности в биологический круговорот биосферы. Соединение в ноосфере двух способов обеспечения устойчивости систем - энергетического отбор и сохранение систем с большей энергией и информационного отбор более сложных систем, т. е. с большим запасом информации - приведет к образованию качественно нового состояния биоэнергетики.

Наступит эпоха сбалансированной энергетики планеты на возобновляемых энергоресурсах. Биологизация и экологизация Еще раз подчеркну, что стратегия преобразования и господства над природой в современном мире уже дискредитировала себя. Мы все больше осознаем необходимость гармоничного, совместного развития природы и человечества.

Именно поэтому в настоящее время приобретают популярность идеи экологизации и в более широком смысле биологизации всей хозяйственной и производственной деятельности. Думается, что под экологизацией, как начальным этапом биологизации, можно понимать сокращение вредных выбросов производства в окружающую среду, создание малоотходных и безотходных промышленных комплексов с замкнутым циклом, скажем, по воде или углеводороду и т. п. Биологизацию же следует, видимо, понимать более широко, как радикальное преобразование производственной деятельности на основе биологических законов биотического круговорота биосферы.

Целью подобного преобразования должно быть встраивание всей хозяйственно-производственной деятельности в биотический круговорот. Особенно наглядно эта необходимость видна на феномене стратегической беспомощности химической защиты растений. Дело в том, что в настоящее время нет в мире ни одного пестицида, к которому бы не приспособились вредители растений.

Более того, теперь отчетливо выявилась закономерность подобного приспособления если в 1917 г. появился один вид насекомых, приспособившихся к ДДТ, то в 1980 г. таких видов стало 432. Применяемые пестициды и гербициды крайне вредны не только для всего животного мира, но и для человека. Точно так же в настоящее время становится понятной и стратегическая бесперспективность применения химических удобрений. В этих условиях совершенно естествен переход к биологической защите растений и биоорганической технологии с минимумом химических удобрений.

Решавшую роль в процессе биологизации сельского хозяйства может сыграть биотехнология. Можно и нужно говорить также и о биологизации техники, промышленного производства и энергетики. Она особенно настоятельна не столько с экономической точки зрения, сколько для судеб человечества и сохранения биосферы. Активно развивающаяся биоэнергетика обещает революционные преобразования, поскольку она ориентирована на возобновляемые источники энергии и сырья. Нефть, уголь, природный газ и даже уран - это не возобновляемые источники, и, как известно, запасы их на Земле крайне ограниченны.

Биологизация энергетики призвана сыграть решающую роль в процессе освобождения человечества от атомной энергетики, поскольку мы теперь уже можем говорить также и о стратегической бесперспективности атомных электростанций. Дело здесь не только в том, что запасы урана также ограниченны, но главным образом в том, что к настоящему времени в мире скопилось уже много десятков тысяч тонн отработавшего топлива, представляющего грозную опасность для всего живого.

Как известно, проблема захоронения отработавшего топлива его радиоактивность после использования в АЭС многократно возрастает до сих пор не решена. Однако, самая главная опасность состоит в возможности серьезных аварий на АЭС. Практические достижения биотехнологииС помощью биотехнологии получено множество продуктов для здравоохранения, сельского хозяйства, продовольственной и химической промышленности. Причем важно то, что многие из них не могли быть получены без применения биотехнологических способов.

Особенно большие надежды связываются с попытками использования микроорганизмов и культур клеток для уменьшения загрязнения среды и производства энергии. Распределение основных продуктов биотехнологии показано в приложении 1. Генная инженерияГенная инженерия За последние 10-15 лет были созданы принципиально новые методы манипулирования с нуклеиновыми кислотами in vitro, на основе которых зародился и бурно развивается новый раздел молекулярной биологии и генетики - генная инженерия.

Принципиальное отличие генной инженерии от использовавшихся ранее традиционных приемов изменения состоит в том, что она дает возможность конструировать функционально активные генетические структуры in vitro в форме рекомбинантных ДНК. Понятия генная и генетическая инженерия часто употребляют как синонимы, хотя последнее является более широким и включает манипулирование не только с отдельными генами, но и с более крупными частями генома.

Работа по переделке генотипа животных или растений с помощью скрещиваний ограничены пределами вида либо близких в видовом отношении форм. Напротив, генная инженерия, как будет показано ниже, стирает межвидовые барьеры, обеспечивая возможность создания организмов с новыми, в том числе и не встречающимися в природе, комбинациями наследственных свойств. Генная инженерия представляет собой совокупность методов, позволяющих не только получать реконбинантные ДНК из фрагментов геномов разных организмов, но и вводить такие рекомбинантные молекулы в клетку, создавая условия для экспрессии в ней введенных, часто совершенно чужеродных генов.

Таким образом, в этом случае исследователь оперирует непосредственно с генами, причем их перенос может не зависеть от таксономического родства используемых организмов. Эта особенность генной инженерии представляет ее главное отличие от ранее использовавшихся приемов изменения генотипа.

Первенствующую роль в формировании генной инженерии сыграла генетика микроорганизмов, идеи и методы, разработанные молекулярной генетикой и химией нуклеиновых кислот. Формальной датой рождения генной инженерии считают 1972 г когда группа П. Берга в США создала первую рекомбинантиую ДНК in vitro, объединившую в своем составе генетический материал из трех источников полный геном онкогенного вируса обезьян SV40, часть генома умеренного бактериофага К и гены галактозного оперона Е. coli. Сконструированная рекомбинантная молекула не была исследована на функциональную активность, поскольку у авторов этой работы возникли опасения, что методы генной инженерии могут привести к появлению микроорганизмов, опасных для здоровья человека, например бактерий Е. coil, способных перенести онкогенные вирусы животных в кишечник человека. Разработанные позднее правила работы с рекомбинантными молекулами позволили практически устранить возможность вредных последствий создания рекомбинантных ДНК, объединяющих в своем составе гены разного происхождения.

Методы генной инженерииВозможность выделения отдельных генов в составе относительно небольших фрагментов ДНК была продемонстрирована незадолго до возникновения генной инженерии в экспериментах in vitro. В 1969 г. Дж. Беквит, Дж. Шапиро и другие опубликовали работу по выделению генов лактозного оперона Е.coli, основанную на сочетании традиционных методов генетики микроорганизмов и физических методов выделения и гибридизации молекул ДНК. Отдельные гены с целью их последующего молекулярного клонирования в составе рекомбинантных ДНК методами генной инженерии могут быть получены следующими способами непосредственным выделением из природных источников путем химического синтеза 3 копированием соответствующей гену и РНК для получения комплиментарной ДНК-вой реплики к ДНК . Первый метод широко использовался на раннем этапе развития генной инженерии.

Тотальную ДНК из разных источников подвергали деградации различными рестриктазами, сшивали с векторными молекулами, вводили в реципиентные клетки и отбирали клоны с гибридными молекулами, включавшими требуемый ген, по появлению соответствующих маркеров донора например, устойчивости к определенному антибиотику либо с помощью специальных иммунологических и гибридизационных методов. Этот метод не утратил своего значения и успешно применяется, например для создания банка генов.

Искусственный синтез гена впервые осуществлен химическим путем в 1969 г. группой Кораны с сотрудниками.

Химическому синтезу генов существенно способствовало совершенствование методов изучения первичной структуры белков или других продуктов, кодируемых синтезируемым геном, а также методов определения первичной структуры секвенирования нуклеиновых кислот. Секвенирование ДНК играет большую роль не только в работах по химическому синтезу генов, но и при изучении их функции, их регуляторных последовательностей, а также целых генетических систем, например мобильных диспергированных генов у эукариот.

Анализ первичной структуры ДНК, т. е. установление последовательности нуклеотидных остатков в ее молекуле, в настоящее время основан на двух методах - методе химической деградации А. Максам и В. Гилберт, 1977 и методе полимеразного копирования с использованием терминирующих аналогов нуклеотидов Ф. Сэнгер, 1977 . В практике генной инженерии широко распространен и третий метод искусственного получения генов, основанный на их ферментативном синтезе с помощью механизма обратной транскрипции.

Этот механизм связан с активностью РНК-зависимой ДНК-полимеразы или обратной транскриптазы - фермента, впервые обнаруженного при исследовании репликации РНК онкогенных вирусов.

Фермент способен строить ДНК-копии на разных РНК, включая синтетические полирибонуклеотиды. С помощью обратной транскриптазы, называемой иногда ревертазой, можно синтезировать практически любой индивидуальный ген в присутствии соответствующих иРНК, методы выделении которых достаточно разработаны.

В 70-е годы появились методы выделения в чистом виде фрагментов ДНК с помощью электрофореза. В руки ученых попали молекулярные ножницы. Транспортным средством переноса генетической информации в клетку стал вирус. Явление трансдукции - переноса генов из одной клетки в другую с помощью вирусов изучали еще с 50-х годов. Но вирус не должен был сразу уничтожать всю клетку, поэтому не все вирусы подходили для этой роли. Известно, что бактериальные клетки могут обмениваться генетическим материалом при помощи плазмид небольших частиц с фрагментами ДНК . Поэтому введение нужного гена в плазмиду позволяет в дальнейшем перенести этот ген в бактерию это еще один из механизмов транспорта в генной инженерии. Появилась возможность изучать распределение нуклеотидов в определенном гене или получать нужный белок.

Для этого создается рекомбинантная ДНК, которая возникает, когда ДНК одного организма внедряется в клетки другого. В качестве последнего используются клетки организма, который размножается много быстрее первого, например, бактерии. Так, в 80-е годы были разработаны интерфероны белки, способные подавлять размножение вирусов.

Были выбраны наиболее подходящие для переноса гены и мобильные участки ДНК. Например, культурным растениям вводят гены, повышающие их иммунитет и устойчивость. В 1983г. Барбара Мак-клинток при изучении генетики кукурузы обнаружила в ее геноме один подвижный ген, отвечающий за цвет початка. Независимо от нес подвижные гены были открыты методами молекулярной генетики советским ученым Г. П. Георгисвым.

В 1981 г. процесс выделения генов и получения из них различных цепей был автоматизирован. При всем разнообразии методов основная схема любой генно-инженерной работы остается неизменной. Она включает обработку кольцевой векторной молекулы рестриктазой с образованием линейной формы ДНК сплавление ее с фрагментом чужеродной ДНК, ведущее к формированию гибридной структуры введение гибрида в клетку реципиента отбор клонов трансформированных клеток на селективных средах доказательство присутствия рекомбинантной ДНК в этих клонах путем ее выделения из клеток, обработки соответствующими рестриктазами и анализа образовавшихся фрагментов методом электрофореза в агарозном геле. Известно несколько методов объединения фрагментов ДНК из разных источников, позволяющих включить клонируемую донорную ДНК в состав вектора.

Один из них основан на соединении фрагментов, каждый из которых несет идентичные хлипкие концы, полученные под действием одной и той же рестриктазы.

При другом методе, ферментативном, используется возможность соединения двухцепочных концов фрагментов ДНК с помощью ДНК-лигазы. Для повышения эффективности лигазы к концам сшиваемых фрагментов ДНК химически присоединяют комплиментарные однонитивые олигонуклеотиды, например поли-А и поли-Т, создавая тем самым искусственные липкие концы. Методы введения рекомбинантных молекул в клетки зависят от особенностей самих клеток и используемых векторов.

В тех случаях, когда векторами служат плазмиды, рекомбинантные ДНК вводят в реципиентные бактерии путем трансформации. Разработаны и методы трансформации клеток животных, а также протопластов растений. Для защиты экзогенного клеточного материала, вводимого в клетки млекопитающих или в протопласты растений, используют липосомы - сферические тельца, оболочка которых состоит из фосфолипидов. В составе липосом в клетки высших эукариот введены крупные вирусные РНК. Во всех случаях липосомы надежно защищали молекулы нуклеиновых кислот от разрушения нуклеазами.

Один из путей передачи генетической информации в культуре клеток человека, животных и растений - гибридизация соматических клеток, разработанная Б. Эфрусси и Г. Барски 1960 . Эффективность этого метода значительно повысилась после того, как было обнаружено, что частицы инактивированного вируса парагриппа типа Сендай увеличивают частоту слияния клеток из самых разных источников.

Показана возможность передачи генов из изолированных хромосом китайского хомячка в клетки соединительной ткани мыши. Описаны гибриды клеток человека и мыши, из которых часть хромосом человека удаляется, а часть остается функционально активной. Для введения ДНК в различные культуры клеток млекопитающих или развивающиеся эмбрионы используют метод микро инъекций ДНК в ядро с помощью микроманипулятора. Развитие методов микрохирургии клеток позволило заменять ядра оплодотворенных яйцеклеток на ядра из соматических клеток и в результате получать абсолютно идентичные организмы.

Создание гибридов высших растений в обход полового скрещивания возможно путем слияния протопластов и соматической гибридизации растительных клеток, в результате чего в ряде случаев появляются целые гибридные растения. Все эти методы могут быть использованы для конструирования новых форм микроорганизмов, животных и растений путем введения и стабильного наследования в них рекомбинантных ДНК, несущих, гены, детерминирующие желаемые признаки. 4 Следует, однако, отметить, что, несмотря на очевидные успехи подобных работ по созданию микроорганизмов, синтезирующих ряд важных продуктов эукариотического происхождения, проблема экспрессии чужеродных генов у прокариот имеет ряд ограничений.

Некоторые из них связаны с тем, что при сверхпродукции полезных для человека и не нужных клетке соединений, кодируемых гибридной плазмидой, усиливается неустойчивость самих гибридов и вероятность элиминации из них встроенных генов.

Стабильность гибридных ДНК снижается и с увеличением размеров вставки в вектор. Поэтому разрабатываются методы, направленные на сохранение целостности гибридной структуры. Использование регулируемых промоторов предохраняет клетку от чрезмерной для нее метаболической активности, связанной с избыточной продукцией чужеродного белка. Вместе с тем проблема стабильности гибридных молекул окончательно не решена. Ограничения возможностей конструирования микроорганизмов - гиперпродуцентов ценных препаратов - распространяются на случаи клонирования и экспрессии любых генов как про так и эукариотического происхождения.

Наряду с этим существуют и ограничения, специфически связанные с выражением эукариотических генов в прокариотах. Первое из них определяется тем, что эукариотические промоторы могут не распознаваться бактериальной РНК - полимеразой. Второе заключается в том, что и РНК транскрибирующаяся с эукариотических генов, не содержит последовательности Шайн-Далгарно, необходимой для ее связывания с рибосомами.

В-третьих, такая иРНК может содержать интроны, которые следует вырезать. Наконец, эукариотические белки часто становятся субстратами для бактериальных протеаз, опознающих такие белки как чужеродные. 4 . Первые два ограничения преодолеваются за счет создания векторов, несущих собственные промоторы и последовательность Шайн-Далгарно, третье можно обойти путем использования кДНК либо химически синтезированных генов. Протеазная активность реципиентных бактерий подавляется мутациями.

Преодоление всех этих ограничений открывает дальнейшие перспективы использования методов генной инженерии при создании микроорганизмов - продуцентов гормонов, вакцин, антисывороток и ферментов, представляющих интерес для медицины, ветеринарии, сельского хозяйства и микробиологической промышленности.