Методы повышения разрешения

Aнализ вторичной структуры белков с помощью ИК-спектров далеко не однозначен, поскольку полосы в областях амид-I и амид-III довольно широки и не разрешаются на отдельные компоненты, соответствующие различным элементам вторичной структуры.

Для выявления отдельных компонентов предложено два метода, называемых «улучшением разрешения». Первый метод получил название “второй производной”, а второй – “разложение сложных пиков на составляющие”- типичное для всех методов разложения. Заметим, что их развитие и активное применение в ИК-спектроскопии стало возможным только после внедрения в практику инфракрасных спектрометров с фурье-преобразованием.

Метод второй производной

Высота пика второй производной пропорциональна высоте исходного пика с противоположным знаком и обратно пропорциональна квадрату исходной полуширины.

Рис. З2.8. Исходный спектр поглощения бычьего α-химотрипсина и ИК-спектр второй производной спектра белка в растворе D₂O в диапазоне волновых чисел от 1250 до 1800 см⁻¹ (Suzi and Byeer, 1986)

Как видно из рисунка интенсивная полоса амид-I, неразрешенная в исходном спектре, разделяется на семь компонентов в спектре второй производной. Интерпретация спектров второй производной усложнена в случае перекрывающихся полос. К тому же, всегда надо помнить, что дифференцирование спектральных кривых сильно уменьшает отношение сигнал-фон. Для разложения спектра требуется ввести в компьютер две константы: оценку полуширины неразрешенных полос σ и фактор «эффективности» разрешения к, отражающий эффективное увеличение разрешения. В большинстве случаев удовлетворительные значения σ равны 6-10, а к около 2-2.5. Надо особо подчеркнуть, что неправильный выбор σ и (или) к может привести к серьезным ошибкам. После обратной свертки спектр аппроксимируют с помощью гауссовых компонентов, используя специальные компьютерные программы.

Метод разложения инфракрасных спектров на компоненты

Наблюдаемые ИК-спектры являются результатом свертки спектра поглощения образца и функции разрешения прибора. Один из аналитических подходов в ИК-спектроскопии заключается в разложении сложных кривых амидных полос на составляющие их компоненты с учетом их амплитуды и относительного вклада (отношения площади компонента к площади всей полосы).После такого разложениякомпоненты приписывают различным типам вторичной структуры (α-спиралям, β-слоям, поворотам и нерегулярным петлям), а их площадь – относительному содержанию соответствующей вторичной структуры в белковой молекуле.

(a) (б)

Рис. 57.9Полосы амид-I α-химотрипсина в концентрации 5% вес/объем в D₂O, при длине оптического пути 7.5 мкм: (a) оцифрованный исходный ИК-спектр (крестики); (б) спектр после обратной свертки (крестики) и отдельные гауссовы компоненты (сплошные линии). Константы деконволюции: σ = 6.5 см⁻¹, к = 2.4. Сплошная огибающая кривая получена суммированием всех компонентов (Susi and Byler, 1986)

Рисунок 57.9 показывает, что спектр полосы амид-I α-химотрипсина можно разложить на компоненты с легко измеряемыми площадями. Специалисты, работающие в этой области спектроскопии, часто называют данный процесс деконволюцией, хотя фактически это разложение спектра на спектральные компоненты. Полосы при 1627, 1637 и 1674 см^-1 приписывают β-слоям, полосу вблизи 1653 см^-1 – α-спиралям и полосы около 1687, 1681 и 1665 см^-1 – поворотам.

Спектр полосы амид-III того же белка представлен на рисунке 57.10(а). Полосы при 1323, 1311 и 1304 см^-1 приписывают α-спиралям, полосы вблизи 1248,1234 и 1222 см^-1 – β-слоям, а полосы 1290, 1279 и 1260 см^-1 другим структурам в нативном α-химотрипсине.

(а) (б)

Рис. 57.10. Анализ ИК-спектров α-химотрипсина в районе полосы амид-III: (а) в нативном состоянии при концентрации 1 мг·мл^-1, в буфере с H₂O; (б) белок в развернутом состоянии (в 6 M гуанидингидрохлориде). Константы разложения σ = 20 см^-1, к = 2.0) (Cai and Singh, 1999)

Рисунок 57.10(б) иллюстрирует большие изменения в спектре α-химотрипсина при помещении его в раствор 6 М гуанидингидрохлорида. Так, полосы выше 1300 см^-1 (вероятнее всего, принадлежащие α-спиралям) смещаются в область более низких волновых чисел и их интенсивность падает, тогда как интенсивность полос между 1248 и 1270 см^-1 (принадлежащих, скорее всего, неупорядоченному клубку) резко возрастает. Интенсивность полосы между 1248-1249 см^-1 вырастает от 20% до 38%, что указывает на то, что она является границей раздела между клубком и β-слоем. Интенсивность полос нативного белка при 1290 и 1279 см^-1 падает с 20% до 11% после обработки гуанидингидрохлоридом, а полоса 1279 сдвигается к 1282 см^-1.

В заключение еще раз подчеркнем, что к взятию производных и разложению широкополосных кривых на составляющие как в видимом, так и к инфракрасном диапазоне надо относиться с определенной долей осторожности в силу неоднозначности решения таких задач. Кроме того, очевидно, что принципиальной проблемой интерпретации данных остается соотнесение полученных пиков с частотами колебаний в молекуле.

От амидных полос к вторичной структуре белков