Высокоупорядоченное расположение летальных генов на хромосомах - раздел Медицина, Экспрессия генов Если Гипотеза О Наличии Внутри Ядер Генетически Детерминированных, Пространст...
Если гипотеза о наличии внутри ядер генетически детерминированных, пространственно упорядоченных участков геномной ДНК является верной, то это влечет за собой важное следствие. В этом случае в процессе эволюционных преобразований геномов их участки, максимально защищенные от действия химических мутагенов, в результате транслокаций и других хромосомных перестроек могли быть заняты генами, функциональная целостность которых особенно важна для выживания клеток или организмов. Такими генами являются, прежде всего, жизненно важные (летальные) гены, инактивация которых под действием мутаций приводит к гибели клеток. Действительно, организмы, у которых критические гены максимально защищены от действия мутагенов, должны были бы обладать эволюционным преимуществом перед организмами, геном которых не обладает этими свойствами, и в первую очередь сохраняться естественным отбором. Если это так, то летальные гены маркируют в геноме современных организмов участки, максимально благоприятные для их целостности, т.е. наиболее защищенные от действия мутагенов, наиболее доступные для белков системы репарации и т.п. В этой связи можно предполагать, что линейное расположение жизненно важных генов вдоль ДНК отражает особенности пространственной организации ДНК в ядрах эукариот на высшем уровне.
Используя эти рассуждения в качестве рабочей гипотезы, мы исследовали расположение жизненно важных генов на всех 16 хромосомах дрожжей Saccharomyces cerevisiae, первичная структура которых в настоящее время полностью определена. Для этого объекта точно известно положение на хромосомах многих жизненно важных генов. В ходе исследований было установлено, что на всех хромосомах дрожжей имеются участки, в которых известные на момент исследования летальные гены (или их кластеры) расположены периодически (на равном расстоянии друг от друга). В качестве примера рассмотрим положение жизненно важных генов на одной из хромосом.
Хромосома 2 является одной из пяти наиболее крупных хромосом дрожжей, длина которой составляет ~813 т.п.о. Хромосома содержит 429 открытых рамок считывания (ОРС), среди которых ко времени проведения анализа 57 были определены как жизненно важные гены, 193 – как нелетальные, а указанные свойства остальных 179 ОРС в настоящее время неизвестны. Следовательно, количество известных нежизненно важных генов хромосомы 2 приблизительно в 3 раза превышает число известных жизненно важных, и это соотношение к настоящему времени соблюдается у всех хромосом дрожжей.
Летальные гены расположены на хромосоме неравномерно. Имеются места их скопления, особенно ярко выраженные в центральной части хромосомы, а также участки, в которых они встречаются не так часто (см. рис. I.64,в,1). Даже без предварительной обработки данных можно было видеть дискретность расположения летальных генов и их кластеров, в которые объединяли гены, если расстояние между ними было меньше 10 т.п.о. (подчеркнуты на рисунке). После представления каждой группы генов отдельного кластера в виде одной точки (с доверительными интервалами, расположенными между началами и концами кластеров) и введения в график нескольких свободных мест для гипотетических, пока неизвестных генов (или их кластеров) периодический характер распределения кластеров летальных генов на хромосоме 2 становится очевидным (см. рис. I.64,в,2). Видно, что места предпочтительного расположения летальных генов или их кластеров расположены на хромосоме 2 периодически. При этом период расположения генов или их кластеров (повторяющееся равное расстояние между следующими друг за другом генами) численно равен выраженному в парах оснований угловому коэффициенту линейной функции, которая описывает последовательность координат генов на графиках.
Таким образом, после минимальных преобразований исходных данных, потребовавших введения в общей сложности девяти гипотетических генов или их кластеров (места, в которых отсутствуют точки на графике), а также выделения 14 групп кластеров генов, последовательность координат летальных генов и их кластеров удовлетворительно описывается линейной функцией с угловым коэффициентом 18 807 (R2 = 0,9992). Это указывает на периодический характер расположения летальных генов вдоль всей хромосомы 2 с периодом ~18,8 т.п.о.
Разработанная нами методика анализа летальных генов, кратко рассмотренная на примере хромосомы 2, была использована для исследования остальных хромосом S. cerevisiae. Оказалось, что на каждой из исследованных хромосом можно выделить участки с периодическим расположением летальных генов. По характеру распределения жизненно важных генов исследованные хромосомы разделяются на две группы. В одной из них (хромосомы 1, 2, 5–7, 9, 11, 12 и 16) летальные гены (и их кластеры) образуют непрерывную последовательность и распределены равномерно по всей длине хромосом. При этом у семи из девяти хромосом этой группы периоды расположения генов очень близки и лежат в пределах 22,0–25,8 т.п.о.
Ко второй группе относятся хромосомы, на которых летальные гены образуют несколько участков с разной периодичностью. Для относящихся к этой группе хромосом 2, 10 и 14 характерны два участка периодически расположенных летальных генов. При этом участки хромосомы 3, обладающие очень близкими периодами, локализованы симметрично относительно центра хромосомы, в окрестностях которого летальные гены пока не обнаружены. Равные по своим размерам хромосомы 10 и 14 обладают похожим строением в отношении анализируемого признака: за участком с меньшей периодичностью следует область хромосомы, на которой расстояние между летальными генами или их кластерами больше.
На хромосомах 4, 8 и 13 можно выделить по три области с периодически расположенными летальными генами, структура которых очень похожа. В этом случае области с меньшими периодами фланкируют участки хромосом, на которых расстояния между периодически расположенными летальными генами больше. Интересно, что на хромосоме 8 близкие по периодичности концевые участки (периоды 22,3 и 23,7 т.п.о.) расположены симметрично относительно центральной области хромосомы, для которой характерен приблизительно вдвое больший период чередования жизненно важных генов (40,9 т.п.о.). Не исключено, что по мере открытия новых летальных генов в центральной части этой хромосомы все три участка сольются в единую область, периодичность расположения летальных генов в которой будет близка таковой в отмеченных концевых участках (22–23 т.п.о.).
Для крупной хромосомы 15 характерно наличие пяти участков с периодически расположенными летальными генами. И на этот раз периоды участков 1, 3 и 5 очень близки (20,5; 23,0 и 23,9 т.п.о. соответственно). В то же время расстояния между периодически расположенными жизненно важными генами этой хромосомы на участке 2 приблизительно вдвое больше (46,2 т.п.о.).
Несмотря на то что точные числовые значения периодов в расположении летальных генов различаются как между хромосомами, так и между конкретными участками индивидуальных хромосом дрожжей, складывается впечатление об универсальном характере расположения анализируемых летальных генов. Действительно, среди 29 обнаруженных участков с периодическим расположением летальных генов на 16 исследованных хромосомах у 17 из них значения периодов лежат в пределах 19,7–25,8 т.п.о., а из оставшихся 12, по крайней мере, три значения могут рассматриваться как кратные им, т.е. они подтверждают ту же структурную закономерность. Обнаруженная периодичность в расположении жизненно важных генов хромосом дрожжей может указывать на наличие в интерфазных ядрах дрожжей периодически повторяющихся пространственных структур хроматина высокого порядка, что может создавать особые биохимические условия для находящихся в них генов, например иметь отношение к защите жизненно важных генов от мутаций, как физически, так и обеспечивая эффективное функционирование ферментов системы репарации.
Периодичность расположения жизненно важных генов на хромосомах дрожжей как возможное отражение пространственной структуры хроматина.Существование информационных макромолекул, особенно таких гигантских, как молекулы ДНК, полностью зависит от их упорядоченной пространственной структуры. Последовательные циклы компактизации и декомпактизации хроматина сопровождают каждое деление эукариотических клеток и являются одним из самых универсальных и распространенных генетических процессов в живой природе. Точность и эффективность этого процесса очень высоки. Если исходная пространственная структура хроматина в интерфазных ядрах еще во многом остается непонятной, то структура метафазных хромосом, выявляемая на цитогенетическом уровне, является консервативным видоспецифическим признаком. Последние модели строения метафазных хромосом указывают на наличие у них центрального остова, включающего в себя тандемно повторяющиеся MAR/SAR-последовательности, и упорядоченных боковых петель хроматина. Трудно представить себе, чтобы имеющиеся связи между участками хроматина, сближенными в метафазных хромосомах, полностью утрачивались при его декомпактизации в интерфазе клеточного цикла, поскольку это должно было бы затруднять и замедлять его циклически повторяющуюся сборку в начале каждого митоза. Одним из указаний на сохранение таких связей является наличие в интерфазных ядрах особых хромосомных зон, занимаемых индивидуальными декомпактизованными хромосомами, которые не перемешиваются друг с другом.
Основа пространственной упорядоченности ДНК в составе хроматина заложена в ее первичной структуре. Как известно, монотонно следующие друг за другом четыре азотистых основания ДНК образуют правильную двойную спираль, шаг которой в случае B-формы ДНК составляет 10,5 нуклеотидов на виток двойной спирали. Именно такая монотонная организация молекулы ДНК в конечном итоге дает возможность формироваться на ней, как на матрице и прямом участнике процесса, периодически повторяющихся нуклеосом. На этом первом уровне пространственной организации хроматина так называемые коровые частицы нуклеосом (тетрамер гистонов H3/H4, фланкированный димерами гистонов H2A/H2B, с закрученным вокруг них участком ДНК длиной в 146 п.о.) разделены участками линкерной ДНК длиной ~50 п.о. Особенности пространственной структуры хроматина на более высоких уровнях (соленоид и петельно-доменный уровни компактизации хроматина) до конца не ясны и по-прежнему остаются предметом дискуссий. Имеющиеся экспериментальные данные указывают на существование периодически повторяющихся пространственных структур и на высших уровнях упаковки интерфазного хроматина.
Ограниченная инкубация нативного хроматина животных и растений с нуклеазами позволяет обнаруживать с помощью электрофореза в импульсном электрическом поле образование дискретных фрагментов ДНК двух классов: крупных, длиной ~300 т.п.о. и более коротких – ~50 т.п.о. Использование топоизомеразы для расщепления ДНК в основаниях петель, ассоциированных с ядерным матриксом, приводит к накоплению фрагментов ДНК приблизительно того же размера. Наконец, деградация ДНК на ранних стадиях апоптоза начинается с образования аналогичных по размерам фрагментов геномной ДНК. К сожалению, соответствующие данные относительно пространственной организации хроматина дрожжей мне неизвестны. Помимо выше отмеченных факторов материальной основной формирования периодически организованных пространственных структур хроматина могут быть и повторяющиеся последовательности нуклеотидов, в большом количестве встречающиеся в геноме высших эукариот.
Обнаруженное в ходе нашего исследования периодическое распределение летальных генов вдоль всех 16 хромосом дрожжей по-своему указывает на наличие возможной связи между пространственной структурой их хроматина и функциональной значимостью генетического материала, включенного в соответствующие последовательности. Как уже отмечалось выше, значения большинства периодов между летальными генами и/или их кластерами лежат в пределах 20–26 т.п.о., что представляет собой величину того же порядка, что и размеры фрагментов ДНК, образующихся при ограниченном нуклеазном гидролизе нативного хроматина. На мой взгляд, жизненно важные гены дрожжей маркируют места хромосом, наиболее безопасные для их существования. Поскольку наибольшую опасность для клетки представляют мутации, инактивирующие их летальные гены, места их расположения могут быть в большей степени защищены от действия химических мутагенов, с которыми организм в избытке сталкивается в процессе своей жизнедеятельности. Такую защиту для последовательностей нуклеотидов могли бы обеспечивать, например внутренние части хроматиновых глобул. Действительно, уже сам факт наличия у нативного хроматина упорядоченно расположенных участков ДНК, в большей или меньшей степени защищенных от действия нуклеаз (что и дает возможность образования характерных дискретных фрагментов ДНК), однозначно указывает на существование в хроматине последовательностей нуклеотидов, по-разному защищенных от действия мутагенов. В соответствии с вышеизложенным мы предполагаем наличие вдоль хромосом дрожжей периодически повторяющихся мест с большей или меньшей защищенностью от действия мутагенов. В зависимости от тонкой пространственной структуры хроматина в этих участках уровни защищенности последовательностей нуклеотидов от мутагенов могут варьировать от участка к участку и приводить к генетической детерминированности скоростей спонтанного мутагенеза в конкретных генетических локусах.
Возможное биологическое значение обнаруженной периодичности расположения летальных генов на хромосомах дрожжей.Хроматин всех эукариот построен в общих чертах одинаково, поэтому обнаруженные у дрожжей особенности его строения и вытекающие из этого следствия хотелось бы рассмотреть применительно и к геному высших эукариот. В этой связи необходимо обратить внимание на четыре момента развиваемой концепции, которые могут иметь общебиологическое значение.
1. Значительно большее разнообразие последовательностей нуклеотидов различных типов, присутствующих в геноме высших эукариот, по сравнению с геномом дрожжей, создает условия для формирования более разнообразных и богатых в функциональном отношении пространственных структур хроматина в интерфазных ядрах. Наличие же таких структур, в свою очередь, предполагает существование у высших эукариот и более тонкого контроля скоростей спонтанного мутагенеза в конкретных генетических локусах по обсуждаемому механизму. Такая разная генетическая детерминированность темпов мутационных изменений генетических локусов у биологических видов могла бы контролировать направление их возможных эволюционных преобразований и историческое развитие таксонов.
2. Наличие в интерфазных ядрах эукариот участков ДНК, максимально защищенных от действия мутагенов, предполагает существование в них и генетических локусов с минимальным уровнем защиты. Из этого следует, что делеции или вставки в окрестностях защищенных локусов могут сдвигать генетические локусы в менее благоприятное, с точки зрения защиты, положение на хромосоме. Для менее защищенных локусов могут возникать обратные ситуации. Следовательно, делеции или вставки, а также природный геномный полиморфизм (в частности обнаруживаемый по длинам рестрикционных фрагментов ДНК) могут быть причиной (и новым механизмом) возникновения локального мутаторного фенотипа в соматических клетках высших организмов. Известно, что мутаторный фенотип часто предшествует малигнизации клеток и сопровождает рост опухолей. Если предполагаемый нами механизм функционирует, то возникновение делеции или вставки по соседству с критическим локусом (протоонкогеном или антионкогеном), контролирующим развитие заболевания, должно переводить мутантный организм в группу риска с повышенной вероятностью изменения этого локуса под действием мутаций. Другим примером могла бы быть лейденская мутация в факторе V системы свертывания крови, ассоциированная с развитием тромбозов, которая чрезвычайно широко распространена в европейской популяции и не встречается у ориенталов. Это и другие подобные явления можно объяснить неблагоприятным пространственным расположением соответствующего генетического локуса в интерфазном ядре у индивидуумов европейской популяции, принадлежащих к группе риска, которое делает локус легко доступным для химических мутагенов или препятствует функционированию ферментов системы репарации.
3. Исходя из всего вышеизложенного, можно полагать, что "избыточные" последовательности генома эукариот обеспечивают необходимую пространственную структуру хроматина в интерфазных ядрах, создавая оптимальные условия для генов с точки зрения их экспрессии и защиты от мутационных изменений, что является жизненно важным фактором существования эукариот.
4. Интроны в генах эукариот могут обеспечивать специфическое пространственное расположение экзонов в интерфазных ядрах, оптимальное с точки зрения их защиты от мутаций и эффективности экспрессии генов. Например, делеционное удаление интронов из гена может приводить к тому, что его 5'-концевая регуляторная часть в процессе упаковки ДНК в хроматин попадет внутрь хроматиновой глобулы и станет недоступной РНК-полимеразам, факторам транскрипции и другим регуляторным белкам. В такой ситуации наиболее важными для гена становятся длины его интронов, а не их первичная структура.
Все темы данного раздела:
ЧАСТЬ I. МЕХАНИЗМЫ ХРАНЕНИЯ И РЕАЛИЗАЦИИ ГЕНЕТИЧЕСКОЙ ИНФОРМАЦИИ
ВВЕДЕНИЕ
Организм. Живой организм представляет собой самовоспроизводящуюся, открытую термодинамическую систему, в которой пути превращения вещества и э
Средний размер гаплоидного генома у некоторых групп организмов
Группы организмов
Средний размер генома, п.о.
Мелкие вирусы
1,0·104
Микоплазмы
1,6·1
Гены и хромосомы
Генетическая информация о структуре отдельных белков и нуклеиновых кислот у всех организмов заключена в молекулах ДНК или РНК в виде последовательностей нуклеотидов, называемых генами
Геном прокариот
Как уже было упомянуто выше, основной чертой молекулярной организации прокариот является отсутствие в их клетках (или вирионах – вирусных частицах, в случае вирусов) ядра, отгороженного ядер
Геном вирусов
По определению Х. Френкель-Конрата, "вирусы – это частицы, состоящие из одной или нескольких молекул ДНК или РНК, обычно (но не всегда) окруженных белковой оболочкой; вирусы способны передават
Геном архебактерий
Царство архебактерий представляет собой своеобразную и наименее изученную таксономическую группу прокариот. Хотя по своей морфологии Archeabacteria похожи на привычные эубактерии, на молекулярном у
Минимальный размер генома одноклеточных организмов
Определение минимального размера генома, обеспечивающего все необходимые функции, которые позволяют одноклеточному организму существовать в определенных экологических условиях, не является праздным
Геном эукариот
Как уже упоминалось выше, в отличие от прокариот основная часть генома эукариот находится в специальном клеточном компартменте (органелле), получившем название ядра, а значи
Последовательности нуклеотидов эукариотического генома
Геном эукариот составляют уникальные и повторяющиеся последовательности нуклеотидов. Содержание уникальных последовательностей в геноме, определенное на основании кинетики реассоциации фрагментиров
Хроматин
Хроматином называют сложную смесь веществ, из которых построены хромосомы эукариот. Основными компонентами хроматина являются ДНК, гистоны и негистоновые белки, образующие высо
Свойства гистонов животных
Гистон
Размер полипептида
(число аминокислот)
Локализация и типы посттрансляционных модификаций
Вся мол
Роль ДНК-топоизомераз в обеспечении структуры и функционирования хроматина
Топоизомеразы контролируют в клетках уровень суперскрученности ДНК, который может изменяться в процессе ее репликации, транскрипции, гомологичной рекомбинации, а также во время перестроек хроматина
Транскрипция
В процессе транскрипции генов происходит биосинтез молекул РНК, комплементарных одной из цепей матричной ДНК, сопровождаемый полимеризацией четырех рибонуклеозидтрифосфатов (ATP, GTP, CTP и UTP) с
ДНК-зависимые РНК-полимеразы
В соответствии с субъединичным составом РНК-полимеразы подразделяются на две группы. К первой группе относятся ферменты, состоящие только из одной субъединицы, среди них – РНК-полимеразы митохондри
РНК-полимеразы II дрожжей
Компонент
Характеристика
Pol II
РНК-Полимеразная активность, взаимодействует с множеством общих и тканеспецифических факторов транск
Единицы транскрипции (транскриптоны)
Синтез РНК молекулами РНК-полимераз in vivo начинается в определенных местах ДНК, называемых промоторами, и завершается на особых регуляторных последовательностях – терминаторах. Посл
Этапы транскрипции
Процесс транскрипции в настоящее время принято подразделять на 4 основные стадии: 1) связывание молекул РНК-полимеразы с ДНК и распознавание промотора; 2) инициация; 3) элонгация; 4)
Субъединичный состав и характеристика основных факторов транскрипции (GTF) РНК-полимеразы II человека
Фактор
(GTF)
Молекулярные массы субъединиц (кДа) и их обозначение
Характеристика
TFIIA
37 (a)
19
Основные факторы элонгации РНК-полимеразы II
Фактор
Структура
Молекулярная масса полипептидов, кДа
Функция
P-TEFb
Гетеродимер
124, 43
Хроматин во время транскрипции
В эукариотических клетках матрицей для РНК-полимераз служит ДНК, находящаяся в составе хроматина. Из общих соображений белки нуклеосом и более высокоорганизованного хроматина должны быть препятстви
Котранскрипционные и посттранскрипционные модификации РНК
Транскрипция у любого организма является первым этапом реализации генетической информации – экспрессии генов. Однако первичные транскрипты, как правило, представляют собой лишь предшественники зрел
Процессинг РНК у бактерий
мРНК прокариот обычно являются полицистронными, т.е. включают в себя последовательности нуклеотидов нескольких генов одного оперона (рис. I.10,а). Полицистронные мРНК бактерий при выполнении
Редактирование пре-мРНК
Недавно появились сообщения о новых механизмах изменения кодирующего потенциала мРНК на посттранскрипционном уровне, названных редактированием РНК (editing). Оказалось, что в клетках многих
Различные способы редактирования мРНК
Объект
Модифицированные или добавленные нуклеотиды
Митохондрии трипаносом
AAUUUAUGUUGUCUUU
Митохондрии P. po
Редактирование РНК у животных и их вирусов
Организм, ткань
Локализация
РНК-субстрат
Последствия редактирования
Печень/кишечник крыс
Ядро
Другие модификации эукариотических мРНК
Посттранскрипционные модификации предшественников эукариотических мРНК по сравнению с теми же изменениями первичных транскриптов прокариот более разнообразны и играют большую роль в регуляции экспр
Сравнение полиаденилирования мРНК у эукариот и прокариот
Функции
Млекопитающие
E. coli
Длина поли(А)-последовательностей, нт
80–200
14–60
У
Интронов группы I
Аутосплайсинг
Обратное лигирование
GTPOH
+
[Экзон 1]upA-Интрон-Gpa[Экзон 2]
↓
Кэп-связывающий комплекс в роли фактора, сопрягающего основные реакции метаболизма транскриптов РНК-полимеразы II
РНК не может находиться in vivo в свободном виде. На протяжении всего внутриклеточного существования – от инициации биосинтеза до полной деградации – РНК пребывает в составе рибонуклеопротеиновых к
Функциональная компартментализация ядра
При рассмотрении механизмов реализации генетической информации на уровне транскрипции и посттранскрипционных модификаций РНК чаще всего не принимается во внимание пространственная внутриклеточная о
Интерфазные хромосомы в ядре
В разделе 1.3 уже кратко обсуждался петельно-доменный уровень структурной организации хромосом эукариот, который отражает разделение интерфазных хромосом на дискретные домены по функциональному при
Ядрышко
Структурно-функциональная организация ядрышка (nucleolus) еще более наглядно иллюстрирует концепцию функциональной компартментализации ядра эукариотических клеток. В этой части ядра происход
Пространственная организация синтеза мРНК
Внутриядерный синтез мРНК и доставка зрелых транскриптов к месту их трансляции требуют участия множества тонко сбалансированных во времени, пространственно организованных молекулярных механизмов. В
Ядерные тельца и домены
Исследования структурно-функцональных отношений в ядре в связи с компартментализацией транскрипции, процессинга РНК и репликации продемонстрировали наличие особых функций у многих морфологически ра
Компартментализованное ядро
Два основных структурных образования характерны для ядер всех эукариот. Это, во-первых, оболочка ядра с ядерными порами, связанная с ядерной ламиной (электронно-плотный слой, прилегающий к я
Биосинтез белка рибосомами бактерий
В процесс биосинтеза белка рибосомами, называемого трансляцией, вовлечено множество макромолекул и макромолекулярных комплексов. На этом этапе реализации генетической информации происходит с
Рибосомы
Рибосомы представляют собой крупный рибонуклеопротеидный комплекс с молекулярной массой ~ 2,5 мДа, состоящий из рибосомных белков, молекул рРНК и ассоциированных с ними факторов трансляции. Рибосом
Этапы биосинтеза белка
Хотя построение первых моделей механизмов биосинтеза белка было начато еще в начале 1960-х гг., полное описание процесса трансляции далеко до завершения и в настоящее время. Ниже будут кратко рассм
Антибиотики, действующие на уровне трансляции
На рис. I.21 приведены некоторые широко распространенные антибиотики, являющиеся ингибиторами биосинтеза белка у бактерий. Многие из них находят применение не только как лекарственные средства, но
Трансляция у эукариот
Бактерии обладают единственной универсальной системой трансляции, основные механизмы функционирования которой были кратко рассмотрены выше. В отличие от этого, клетки животных кроме основной систем
Особенности первичной структуры эукариотических мРНК
Зрелая мРНК эукариот наряду с основной последовательностью нуклеотидов, в которой закодирована информация о последовательности аминокислот в соответствующем белке, содержит целый ряд некодирующих п
Инициация биосинтеза белка эукариотическими рибосомами
Как будет видно из дальнейшего изложения, инициация трансляции эукариотических мРНК может осуществляться, по крайней мере, тремя способами. В соответствии с первым наиболее распространенным механиз
Элонгация полипептидных цепей
Элонгация полипептидных цепей в ходе эукариотической трансляции традиционно пользовалась меньшим вниманием исследователей по сравнению с инициацией, поскольку считалось, что ее механизмы в основных
Терминация трансляции
В эукариотических белоксинтезирующих системах терминация трансляции, как и у бактерий, контролируется специфическими рилизинг-факторами. Однако у эукариот эти факторы менее разнообразны. В частност
Трансляция в митохондриях
Митохондрии являются органеллами эукариотических клеток, в которых в результате окислительного фосфорилирования энергия химических связей, освобождающаяся при метаболизме, накапливается в виде энер
Трансляция в хлоропластах.
Хлоропласты являются органеллами клеток растений, осуществляющих процесс фотосинтеза – преобразование энергии квантов света в энергию макроэргических связей ATP. Так же как и митохондрии, хлороплас
Регуляция экспрессии генов на уровне транскрипции у прокариот
Регуляция транскрипции в клетках осуществляется на уровне индивидуальных генов, их блоков и даже целых хромосом. Возможность управления многими генами, как правило, обеспечивается наличием у них об
Регуляция на уровне инициации транскрипции
Активность многих генов прокариот регулируется с помощью белковых факторов, взаимодействующих с регуляторными участками промоторов генов. При этом происходят как активация транскрипции генов, так и
Регуляция синтеза РНК на уровне элонгации и терминации
Выше было отмечено, что РНК-полимераза в процессе элонгации цепей РНК перемещается неравномерно вдоль матричной ДНК и во время ее движения имеют место остановки (паузы). Время задержки молекул РНК-
Регуляция экспрессии генов на уровне транскрипции у эукариот
Несмотря на то что основные принципы регуляции транскрипции генов у прокариотических и эукариотических организмов остаются неизменными – через специфические взаимодействия белков и нуклеиновых кисл
Передача сигнала и вторичные мессенджеры
Жизнь любой клетки, включая глобальные процессы ее роста, деления и даже гибели, зависит от внешних регуляторных сигналов, которые она воспринимает. Такими сигналами могут быть физические воздейств
Рецепторы мембран, осуществляющие трансмембранный перенос сигнала
Класс рецепторов
Четвертичная структура
Система переноса сигнала
Лиганд
1. Олигомеры, окружающие каналы:
а) активируе
Механизмы позитивной регуляции транскрипции
При обсуждении механизмов внутриклеточной передачи сигнала были упомянуты регуляторные белки, взаимодействующие со специфическими последовательностями нуклеотидов генов и получившие название фактор
Функциональные домены факторов транскрипции
Домен
Функция
Факторы, содержащие домен
Примечание
Механизмы негативной регуляции транскрипции
Позитивный контроль транскрипции у эукариот, в котором участвуют многочисленные активаторы транскрипции, играет ключевую роль в регуляции экспрессии их генов на уровне транскрипции. Однако негативн
Импринтинг
Другим характерным примером регуляции экспрессии генов, приводящей к эпигенетическому наследованию признаков, является уже упомянутый выше импринтинг, при котором специфический характер дифференциа
Метилирование ДНК в регуляции транскрипции
Единственной известной генетически запрограммированной ковалентной модификацией ДНК у высших эукариот является метилирование остатков цитозина в положении 5 с образованием 5-метилцитозина (5-mC). Э
Направленный транспорт, внутриклеточная локализация и депонирование мРНК
По завершении регулируемого синтеза РНК в процессе транскрипции она должна быть доставлена к месту трансляции, где сценарий координированной экспрессии генов получает свое дальнейшее развитие. При
Сплайсинг РНК в регуляции экспрессии генов
Разнообразные механизмы процессинга РНК в клетках были уже рассмотрены выше. Как оказалось, созревание мРНК играет важную роль и в регуляции экспрессии тех генов, транскриптами которых эти РНК явля
Избирательная деградация мРНК
Время полужизни мРНК в клетках является важным фактором регуляции экспрессии генов. Феномен деградации мРНК как регуляторного явления впервые обнаружен у бактерий на заре развития молекулярной гене
Регуляция экспрессии генов на уровне трансляции
В процесс биосинтеза белка рибосомами вовлекается большое количество мРНК, экипированных разнообразными регуляторными элементами. Даже в случае клеток дрожжей количество транслируемых видов мРНК пр
Регуляция инициации трансляции
Инициация, т.е. сборка компонентов системы трансляции на 5'-конце мРНК, завершающаяся образованием первой пептидной связи, является важнейшей точкой приложения регуляторных воздействий на уровне тр
Регуляция элонгации синтеза полипептидных цепей
При обсуждении механизмов элонгации цепей РНК в процессе транскрипции была отмечена неравномерность прочитывания матричной ДНК РНК-полимеразами. То же самое наблюдается и во время элонгации растущи
Регуляция терминации трансляции
Альтернативные сайты терминации трансляции могут быть использованы для расширения кодирующего потенциала определенных генов. Выше уже был рассмотрен пример, в котором в результате редактирования РН
Синтез белков, содержащих остатки селеноцистеина
С помощью своеобразного механизма осуществляется передача генетической информации от генов к полипептидным цепям селенопротеинов с необычным аминокислотным остатком – селеноцистеином, входящим в их
Посттрансляционная регуляция экспрессии генов
Синтезом полноценного полипептида в результате трансляции кодирующей его мРНК рибосомами обычно завершается процесс передачи генетической информации от генов к белкам как у бактерий, так и у высших
Последствия фолдинга вновь синтезированных полипептидных цепей
В процессе трансляции растущие полипептидные цепи начинают приобретать высокоспецифическую пространственную структуру, которая формируется полностью вскоре после завершения их биосинтеза. Процесс с
Специфические протеиназы в посттрансляционном процессинге белков
Одним из характерных примеров специфического действия протеиназ является активация предшественников (зимогенов) протеолитических ферментов (трипсина и химотрипсина) после их переноса от места синте
Убиквитин-зависимая система протеолиза в регулируемой деградации белков
Убиквитин-зависимая система протеолиза проводит поиск потенциальной мишени для протеолитической деградации среди огромного числа внутриклеточных белков. Все белки несут в себе специфические сигналы
Сплайсинг белков
Феномен сплайсинга белков, обнаруженный в 1990 г. в группой Т.Стивенса, пошатнул еще один постулат молекулярной биологии, в соответствии с которым последовательности нуклеотидов зрелых мРНК всегда
Другие посттрансляционные модификации белков
Многие белки и секретируемые пептиды претерпевают различные структурные изменения в результате котрансляционных и посттрансляционных модификаций, т.е. во время или после завершения их синтеза рибос
Репликация ДНК
Репликация ДНК происходит в соответствии с правилами Уотсона–Крика и наряду с биосинтезом РНК и белков является еще одним примером матричного синтеза биологических макромолекул. Во время репликации
Белки, входящие в состав репликативных комплексов прокариотических и эукариотических организмов
Белки в организмах
Функции компонентов комплексов
E. coli
Фаг Т4
Вирус SV40 / человек
DnaB
Репликативная вилка E. coli и бактериофага T4
Во время редупликации ДНК ее дочерние синтезирующиеся цепи расходятся из точки репликации, образуя Y-подобную структуру, называемую репликативной вилкой. Именно в окрестностях этой точки раз
Особенности функционирования репликативной вилки эукариот
Механизмы репликации ДНК у высших эукариот менее изучены из-за их большей сложности. Основные результаты получены на модельной системе с ДНК вируса SV40, в которой процесс репликации исследовали в
Эукариотические ДНК-полимеразы и их функциональные гомологи у прокариот
ДНК-полимераза
Ген дрожжей
Гомолог E. coli
Молекулярные массы субъединиц, кДа
Биологические функции
a
Регуляция репликации ДНК
Подробное рассмотрение молекулярных механизмов регуляции репликации ДНК выходит за рамки книги, поэтому ограничимся несколькими замечаниями по данному вопросу и более детально обсудим лишь механизм
Инициация репликации ДНК у E. coli и ее регуляция
Репликация хромосомной ДНК у бактерий играет ключевую роль в их жизненном цикле. В ходе этого процесса микроорганизмы редуплицируют свой геном, а образовавшиеся дочерние геномы далее переходят в до
Регуляция репликации плазмиды ColE1
Многие клетки прокариот в дополнение к основной хромосоме содержат небольшие внехромосомные ДНК, называемые плазмидами. Плазмиды, размеры которых варьируют от нескольких тысяч до сотен тысяч
Особенности репликации линейных геномов
Кольцевые замкнутые геномы характерны для многих бактерий, их плазмид и некоторых вирусов. У подавляющего большинства других организмов геном представлен линейными молекулами ДНК в составе одной ил
Линейные хромосомы бактерий
Афоризм Жака Моно: "То, что верно для E. coli, – верно и для других бактерий (слона)" получил широкое распространение. К счастью, на деле все обстоит не так скучно. До недавнего времени о
Репликаторы эукариот
Хромосомы эукариот содержат линейные молекулы ДНК, а следовательно, остаются все те же проблемы, связанные с их репликацией, которые обсуждались в связи с воспроизводством линейных хромосом бактери
Репликация теломерных участков эукариотических хромосом
Исследование механизмов репликации теломерных участков эукариотических хромосом показало, что они принципиально отличаются от механизмов репликации центральных областей ДНК. Изучение этих механизмо
Пространственная организация синтеза ДНК у эукариот
Пространственная организация репликативного синтеза ДНК у эукариот является одним из наиболее ярких примеров внутриядерной компартментализации генетических процессов. Анализ локализации мест синтез
Мутации
Мутации – это наследуемые изменения структуры генома. Поскольку основу любого генома составляют нуклеиновые кислоты – ДНК или РНК, то под действием мутаций происходит, прежде всего, изменение струк
Основные источники мутаций и методы определения мутагенной активности
В основе мутаций на молекулярном уровне лежат две основные причины: ошибки репликации и мутагенные воздействия различной природы. Ошибки репликации возникают из-за того, что точность функционирован
Метаболиты нормальной микрофлоры человека, обладающие мутагенной и канцерогенной активностями
Соединение
Метаболит
Тип активности
Метионин
Этионин
К
SOS-мутагенез у бактерий
Образование мутаций в клетках организма, подвергнутого мутагенному воздействию, происходит в основном по одному и тому же механизму. При прохождении репликативного комплекса через некодирующий или
Мутаторный фенотип
Несмотря на обилие эндогенных и экзогенных мутагенов, лишь небольшая часть их взаимодействий с ДНК завершается образованием мутаций. Для того чтобы исходное повреждение ДНК в виде аддукта, апуринов
Экспансия ДНК
Под экспансией ДНК понимают увеличение числа копий коротких повторяющихся последовательностей нуклеотидов внутри кластера при передаче генетической информации от родителей потомкам. В настоящее вре
Адаптивные мутации
Проблема, связанная с возможностью возникновения адаптивных мутаций, имеет глубокие корни в биологии. За 50 лет до того как Ч. Дарвин начал свои знаменитые исследования происхождения биологических
Механизмы защиты генома от мутаций
Несмотря на то что иногда мутации помогают организму выжить, подавляющее большинство мутационных изменений генома нежелательно и сопровождается развитием различных патологических состояний мутантно
Репарация ДНК
Большая группа молекулярно-генетических явлений, известная в настоящее время под общим названием "репарация повреждений ДНК", была осознана как отдельный и очень важный биологический фено
Эксцизионная репарация в клетках животных
Эксцизионная репарация ДНК путем удаления поврежденных азотистых оснований (BER). Система BER вызывает защиту геномной ДНК от повреждений, вызываемых главным образом алкилирующими
ДНК-гликозилазы и эндонуклеазы клеток микроорганизмов и человека, участвующие в BER
Фермент
Источник
Ген
Субстрат (см. рис. I.57)
Урацил-ДНК-гликозилаза
E. coli
S. cerevisiae
Человек
Белки животных, участвующие в NER
Белковая система
Белки системы
Ферментативная активность
Функция в репарации
XPA
XPA (p31)
Св
Гомологичная рекомбинация в репарации ДНК
Давно известно, что быстро делящиеся бактериальные клетки, содержащие несколько репликонов, образованных недореплицированными хромосомами (см. введение к разделу 4.2), более устойчивы к действию ио
Репарация ошибочно спаренных нуклеотидов
Система, осуществляющая репарацию ошибочно спаренных нуклеотидов (mismatch repair), выполняет в клетке несколько важных функций. Прежде всего она исправляет ошибки репликации ДНК, меняя ошибочно вк
Полимераза поли(ADP-рибозы) в репарации ДНК у эукариот
В отличие от бактерий одним из первых ответов клеток животных на тяжелые повреждения ДНК является массированная полимеризация остатков ADP-рибозы специальным ферментом – полимеразой поли(ADP-риб
Альтруистичная ДНК
Как следует из вышеизложенного, стабильность генетической информации любого организма обеспечивается двумя различными путями. Прежде всего, системы детоксикации ксенобиотиков и эндогенных мутагенов
Парадокс возможности существования многоклеточных организмов
Огромный размер генома многоклеточных организмов с генетической точки зрения должен создавать для их существования многочисленные и, на первый взгляд, трудноразрешимые препятствия. Проблемы начинаю
Повышение информационной стабильности генома избыточными последовательностями
Анализ структуры генома современных эукариот показывает, что эволюционные преобразования генома-предшественника, приведшие к включению в него избыточных последовательностей нуклеотидов, сопровождал
Селективная защита генов от мутаций
Во всех предыдущих рассуждениях речь шла о глобальной защите функционально значимых участков гипотетического генома от спонтанных и индуцируемых мутаций некодирующими последовательностями нуклеотид
Возможный смысл парадокса С
У организмов, находящихся на примерно одинаковых ступенях эволюционного развития, часто наблюдаются значительные вариации в размерах геномов (см. главу 1). Например, у некоторых видов рыб, относящи
Рестриктазы и ДНК-метилазы
Среди ферментов, используемых в генной инженерии для клонирования, большое значение имеют эндонуклеазы рестрикции – рестриктазы. Эти ферменты, впервые открытые как часть системы рестрикции–м
Эффективность расщепления коротких последовательностей ДНК некоторыми распространенными рестриктазами
Рестриктаза
Последовательность олигонуклеотидов в окрестностях сайта рестрикции
Длина цепи, нт
Процент расщепления олигонуклеотида после инкуба
ДНК- и РНК-лигазы
Создание фосфодиэфирных связей в одноцепочечных разрывах двухцепочечной ДНК с помощью ДНК-лигаз является наряду с рестрикцией одним из важнейших этапов получения рекомбинантных ДНК in vitro. Наибол
Ферменты матричного синтеза ДНК и РНК
К ферментам матричного синтеза нуклеиновых кислот относятся многочисленные ДНК- и РНК-зависимые ДНК- и РНК-полимеразы, осуществляющие зависимый от матричных ДНК или РНК синтез нуклеиновых кислот. Э
Частота ошибок при синтезе ДНК, осуществляемом термостабильными ДНК-полимеразами in vitro при проведении ПЦР в оптимальных условиях
ДНК-полимераза
Частота мутаций
(на 1 нуклеотид/1 раунд репликации)
Pfu
1,3 10-6
Deep Vent
Другие ферменты
Среди других многочисленных ферментов, используемых в генной инженерии, прежде всего следует упомянуть полинуклеотидкиназы, которые осуществляют перенос g-фосфатных групп ATP на 5’
Векторы
Ферменты, описанные в предыдущем разделе, позволяют производить тонкие манипуляции как с протяженными молекулами ДНК, так и с их фрагментами. В частности, с помощью рестриктаз можно с большой точно
Векторы на основе фага l
Основным недостатком плазмидных векторов для клонирования является их малая емкость в отношении клонируемых фрагментов ДНК. Размер вставок клонируемой ДНК в плазмидных векторах, которые способны ст
Интегрирующие и челночные (бинарные) векторы
Векторы, пригодные для клонирования ДНК в бактериях, отличающихся от E. coli, должны обладать всеми характерными чертами, которые были отмечены выше. От только что рассмотренных они отличаются глав
Конструирование экспрессирующих векторов и их функционирование
Первая часть книги была посвящена описанию механизмов, обеспечивающих высокоэффективную и высокоспецифическую экспрессию генов. Такого рода информацию успешно используют в настоящее время для эффек
Векторы для переноса ДНК в клетки животных и растений
Все основные принципы, используемые при конструировании бактериальных векторов, применимы и для получения векторов эукариотических клеток. Как и в случае бактерий, эукариотический вектор представля
Клонотеки генов
Любой индивидуальный ген занимает лишь небольшую часть генома живого организма. В то же время размер генома даже наиболее просто организованных бактерий в среднем составляет 2•106 п.о.,
Получение клонотек генов
Клонотека генов представляет собой набор разных последовательностей нуклеотидов ДНК, клонированных в составе векторных молекул, которые в сумме составляют весь геном исследуемого организма или каку
Методы скрининга клонотек генов
Все методы получения из клонотек генов требуемых последовательностей нуклеотидов можно разделить на две группы. При использовании первой группы методов рекомбинантные бактерии или фаговые частицы и
Эукариотические системы экспрессии рекомбинантных генов, основанные на культурах клеток
Выделение любого нового рекомбинантного гена описанными выше методами неизбежно заканчивается попытками получения его полноценной экспрессии в искусственных генетических системах. Только на первый
Клетки яичников китайских хомячков (линия CHO)
Эта линия клеток и ее многочисленные производные часто используются для синтеза рекомбинантных белков после предварительной эндогенной амплификации соответствующих рекомбинантных генов, введенных в
Клетки селезенки мышей (линия MEL)
Обе системы экспрессии, описанные выше, базируются на амплификации трансгенов, обеспечивающей высокий уровень внутриклеточного синтеза кодируемых ими рекомбинантных белков в отобранных клонах клето
Клетки африканской зеленой мартышки (линия COS)
Получение временной экспрессии генов в клетках COS часто используется для быстрой наработки рекомбинантных белков и ДНК. При конструировании клеток COS клетки зеленой мартышки CV-1 были трансформир
Клетки насекомых, зараженные бакуловирусами
Многочисленное семейство бакуловирусов, размножающихся в клетках беспозвоночных, обладает геномом в виде двухцепочечной кольцевой ковалентно замкнутой ДНК длиной в 80–220 т.п.о. Круг хозяев бакулов
Сравнение эффективности рассмотренных систем экспрессии
Проведено сравнение эффективности рассмотренных выше систем экспрессии эукариотических рекомбинантных генов с использованием гена huLIF в качестве модели. In vivo этот белок с молекулярной массой 3
Бесклеточные белоксинтезирующие системы
Среди искусственных систем биосинтеза белка важное место занимают бесклеточные системы. Любая бесклеточная система создается, прежде всего, для моделирования конкретных биохимических процессов, про
Прокариотические системы
Среди прокариотических бесклеточных белоксинтезирующих систем наибольшее распространение получили системы на основе экстрактов клеток E. coli, хотя основные принципы, используемые для их получения,
Эукариотические системы
Несмотря на относительную простоту получения бактериальных белоксинтезирующих систем, их использование ограничивается трансляцией бактериальных и фаговых мРНК или рекомбинантных последовательностей
Проточные системы
Бесклеточные системы биосинтеза белка позволили генной инженерии получать экспрессию изолированных генов, не прибегая к помощи живых клеток. До недавнего времени все обсуждавшиеся выше бесклеточные
Другие современные методы исследования генов
Основным методическим достижением генной инженерии в исследовании генов является разработка способов выделения индивидуальных генов и экспрессии их в новом генетическом окружении в гомологичных и г
Рестрикционное картирование генов
Полную, но, к сожалению, пока трудно интерпретируемую информацию о строении гена может дать только определение его первичной структуры, т.е. последовательности составляющих ген нуклеотидов. На прак
S1-картирование РНК и ДНК
Нуклеаза S1, специфически гидролизующая одноцепочечные ДНК и РНК, успешно используется для исследования колинеарности ДНК и кодируемой ей РНК, точного картирования мест инициации и терминации транс
Футпринтинг
Принцип защиты последовательности нуклеотидов рестрикционных фрагментов ДНК белками от действия агентов, расщепляющих ДНК, лежит в основе футпринтинга – метода, позволяющего определять места специф
Стратегия выделения нового гена
После обсуждения основных экспериментальных приемов, используемых в современной генной инженерии, становится ясно, каким образом можно решить одну из основных методических задач молекулярной генети
Методы направленного получения мутаций
Развитие генной инженерии революционизировало процесс получения мутаций в конкретных участках генома и анализ последствий этих мутаций на молекулярном уровне. Совокупность методов получения мутаций
Получение делеций и вставок
Делецией называют потерю части нуклеотидов в геноме организма. Такой вид мутаций удобнее всего использовать для локализации (картирования) функционально значимых участков генов и кодируемых
Химический мутагенез
Делеции и вставки, создаваемые в структурных частях генов, как правило, их инактивируют, особенно в тех случаях, когда такие мутации приводят к сдвигу открытых рамок считывания. Поэтому делеции и в
Полимеразная цепная реакция в направленном мутагенезе
Разработка метода полимеразной цепной реакции принципиально изменила ситуацию в исследованиях по направленному мутагенезу. Использование ПЦР для направленного мутагенеза основано на применении в ка
Белковая инженерия
После рассмотрения способов получения сайт-специфических мутаций необходимо сделать лишь один шаг, чтобы оказаться лицом к лицу с бурно развивающимся направлением молекулярной генетики, называемым
Библиотеки пептидов и эпитопов
В живом организме большинство биологических процессов управляется посредством специфических белок-белковых или белково-нуклеиновых взаимодействий. К таким процессам относятся, например регуляция тр
Белки-репортеры в гибридных белках
В рассмотренных выше библиотеках пептидов последние ковалентно связаны с белком-носителем. В таком виде они являются одними из представителей гибридных белков, получаемых методами генной инженерии.
Подходы к созданию новых ферментов
Подавляющее большинство исследований, в которых методы белковой инженерии используют для замен отдельных аминокислотных остатков в полипептидных цепях белков, заканчиваются получением мутантных про
Субтилигаза в лигировании пептидов
В заключение рассмотрим еще одно неожиданное направление белковой инженерии, четко обозначившееся в самое последнее время. Во всех вышеупомянутых подходах конструирование белков с новыми свойствами
Концепция ксенобиоза
Успехи белковой инженерии, демонстрирующие возможность изменения субстратной специфичности ферментов путем замены одной или нескольких аминокислот с помощью направленного мутагенеза, наводят на мно
Антисмысловые РНК и олигонуклеотиды
Главный механизм, лежащий в основе функционирования системы антисмысловых РНК, прост и опирается на известный феномен взаимодействия двух комплементарных друг другу молекул нуклеиновых кислот с обр
Механизм действия антисмысловых РНК
Многочисленные исследования антисмысловых РНК как in vitro, так и in vivo показали, что конечным результатом их действия, как правило, является высокоспецифическое ослабление экспрессии генов, мРНК
Использование антисмысловых РНК
Получение фенокопий.Клетки или организмы, обладающие фенотипом мутантных клеток или организмов, сформировавшимся не вследствие мутаций, называют фенокопиями. Развитие техник
Влияние экспрессии антисмысловых РНК на фенотип трансгенных мышей
Гены-мишени
Длина micРНК, п.о.
Мишень в гене
Фенотип
Основной белок миелина
Экзоны
Природные антисмысловые РНК
За то время, которое прошло с момента открытия в середине 1970-х годов антисмысловых РНК и их успешного использования для искусственной регуляции экспрессии генов, стало ясно, что этот эффектный ге
Рибозимы и дезоксирибозимы
Регуляция экспрессии генов с помощью антисмысловых РНК характеризуется высокой специфичностью. Это обусловлено большой точностью процесса РНК-РНК-гибридизации, основанной на комплементарном взаимод
Типы рибозимов
Эндорибонуклеазная активность РНК была впервые обнаружена Т. Чехом в 1980 г. у интрона группы I предшественника рибосомной РНК Tetrahymena, осуществляющего аутокаталитическую реакцию сплайсинга (ау
Свойства рибозимов
Стабильность рибозимов в биологических жидкостях. Нестабильность РНК является одним из основных ограничений, препятствующих эффективному их использованию in vivo в качестве лекарст
Рибозимы как лекарственные средства
На основании результатов рассмотренных опытов, а также других накопленных знаний о рибозимах складывалось мнение о принципиальной возможности использования рибозимов для регуляции активности конкре
Дезоксирибозимы
В отличие от РНК, выполняющих в клетке разнообразные функции, благодаря возможностям формирования у этих макромолекул сложных пространственных структур, для внутриклеточных ДНК пока известна единст
Аптамеры
Аптамерами называют небольшие молекулы нуклеиновых кислот, которые могут выполнять функции высокоспецифичных рецепторов низкомолекулярных органических соединений. Олигонуклеотидные аптамеры
Молекулы РНК у истоков жизни
Большинство современных теорий происхождения жизни рассматривает молекулы РНК, обладающие активностями рибозимов, в качестве первичных самореплицирующихся молекул, давших начало развитию жизни на З
Молекулы РНК в качестве РНК-репликаз
Для первоначального появления рибозимов необходим абиотический синтез олигорибонуклеотидов длиной 30–70 оснований. Долгое время это требование было камнем преткновения в разработке теории происхожд
Возможность синтеза полипептидных цепей молекулами РНК
Вскоре после открытия рибозимов в литературе стала активно обсуждаться гипотеза о каталитической (а не только структурной) функции рРНК в рибосомах. Первые экспериментальные данные в пользу возможн
Способы получения трансгенных многоклеточных организмов
Многоклеточный организм высших животных и растений является продуктом онтогенетического развития, при котором из одной клетки (зиготы), образовавшейся в результате слияния двух половых клеток родит
Экспрессия трансгенов
Если трансгены в своем функционировании проявляют тканеспецифичность, то уровень их экспрессии зависит от места интеграции в хромосому. В тех редких случаях, когда экспрессия трансгена полностью от
Использование трансгенов у животных
Техника трансгеноза открывает практически безграничные, принципиально новые возможности исследования экспрессии генов. Ниже будут кратко рассмотрены четыре активно развиваемые направления использов
Исследование механизмов экспрессии генов
Как уже упоминалось выше, цис-действующие регуляторные последовательности нуклеотидов обеспечивают тканеспецифический характер экспрессии трансгенов. Этим свойством воспользовались для опред
Токсигены в исследовании дифференцировки соматических клеток в онтогенезе
Выше рассматривалась возможность применения гибридных токсинов для специфического воздействия на группы соматических клеток, обладающих определенными фенотипическими маркерами. Высокоспецифической
Изменение физиологического статуса лабораторных и сельскохозяйственных животных
Одними из первых указаний на возможность использования трансгеноза для изменения физиологических параметров и физической конституции организма животных были результаты работ по экспрессии трансгено
Моделирование наследственных и приобретенных заболеваний человека
Для разработки эффективных методов лечения наследственных и приобретенных заболеваний человека, а также для полного понимания их этиологии требуется моделирование соответствующих симптомов на лабор
Трансгенные растения
Способность к вегетативному размножению отличает организм растений от организма высших животных, что заметно облегчает осуществление трансгеноза. Многие клетки растений, например клетки зародыша на
Генотерапия наследственных и приобретенных заболеваний
Современные методы лечения наследственных и приобретенных заболеваний связаны с введением в организм больного недостающих продуктов метаболизма или с ограничением поступления их предшественников с
Способы доставки новых генов в геном человека
Ретровирусные векторы. Для доставки трансгенов в организм человека в целях генотерапии ретровирусные векторы используются наиболее широко и являются одним из наиболее эффективных с
Управление экспрессией трансгенов в клетках-мишенях
Для того чтобы терапевтическое действие трансгенов реализовывалось в полной мере, часто бывает необходимо обеспечивать их тканеспецифическую экспрессию в клетках-мишенях на протяжении всей жизни ин
Современные достижения генотерапии онкологических заболеваний
Несмотря на разработку множества новых лекарственных препаратов, направленных на лечение онкологических заболеваний, за последние 30 лет не удалось увеличить число пациентов, проживших более 5 лет
Ближайшие перспективы использования генотерапии
Какие же еще заболевания человека можно рассматривать в качестве ближайшей перспективы для генотерапии? Как упоминалось выше, ретинобластома (онкологическое заболевание, при котором поражаются заро
Успехи генотерапии в модельных экспериментах
В последнее время получены впечатляющие результаты и по коррекции дефектов на генном уровне с помощью направленного переноса генов в клетки мышей. Одним из таких примеров является успешная генотера
Проблемы, возникающие в связи с практическим применением генотерапии
Несмотря на впечатляющие успехи генотерапии на модельных животных, в настоящее время имеется ряд принципиальных затруднений, препятствующих широкому использованию метода для лечения заболеваний чел
Получение клинического генетического материала
Для проведения ПЦР используют ДНК клеток различных органов и тканей человека. Основными требованиями, предъявляемыми к такой ДНК, является отсутствие сильной ее деградации и повреждений химическими
Диагностика заболеваний
В процессе диагностики и исследования генетических механизмов наследственных заболеваний человека возникают две тесно связанные друг с другом задачи. На первом этапе исследований в ДНК из клиническ
ДНК-типирование
Результаты, полученные при исследовании структуры и организации геномной ДНК животных, растений и микроорганизмов, наложили глубокий отпечаток на методологию их систематизации. Проблема адекватного
ДНК-типирование микроорганизмов
Наиболее часто в настоящее время используют два способа ДНК-типирования патогенных микроорганизмов, в основе которых лежит метод ПЦР. В первом случае используют один или несколько коротких праймеро
Микроматрицы и микрочипы ДНК
Одним из интенсивно развивающихся направлений биотехнологии нуклеиновых кислот в последнее время становится использование микроматриц ДНК для анализа нуклеотидных последовательностей. В этой группе
Ограничения в использовании микроматриц ДНК
Помимо самой достаточно сложной технологии производства микроматриц, к числу факторов, ограничивающих их широкое применение, относятся кинетические параметры гибридизации, а также точность и чувств
Использование микроматриц ДНК в фундаментальных и прикладных исследованиях
Определение первичной структуры и картирование ДНК являются основными направлениями использования микроматриц олигонуклеотидов в настоящее время. Прямое секвенирование генов с помощью олигонуклеоти
Основные подходы к картированию генома человека
Решение основной задачи программы "Геном человека" включает три основных этапа. На первом этапе необходимо специфическим образом разделить каждую индивидуальную хромосому на части меньшег
Генетические карты сцепления
Генетические карты сцепления представляют собой одномерные схемы взаимного расположения генетических маркеров на индивидуальных хромосомах. Под генетическими маркерами понимают любые
Современные методы построения генетических карт сцепления
Метод
Число картированных локусов
Гибридизация соматических клеток
Гибридизация in situ
ПЦР в исследованиях генома человека
Полимеразная цепная реакция занимает центральное место в разработке подходов к практическому осуществлению программы "Геном человека". Как уже обсуждалось выше (раздел 7.1.3), с помощью П
Физические карты низкого разрешения
В отличие от рассмотренных выше генетических карт сцепления физические карты генома отражают реальное расстояние между маркерами, выражаемое в парах оснований. Физические карты различаются по степе
Определение полной первичной структуры ДНК генома человека
Исчерпывающая физическая карта генома человека (и любого другого организма) должна представлять собой полную последовательность нуклеотидов ДНК всех его хромосом. Благодаря тому, что к решению тако
Базы данных получаемой информации
Полное использование информации о структуре генома человека в биологии и медицине станет возможным лишь в отдаленном будущем. Еще долгие годы предстоит собирать и обрабатывать получаемую информацию
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Современная генетика находится на взлете. Новые факты обнаруживаются настолько быстро, что едва хватает времени на то, чтобы просто осознать их появление. Еще труднее уловить многочисленные связи м
Конечный результат экспрессии генов предопределен.
Будущее трансгеноза и генотерапии. Это будет. И совершенно безразлично - хотим мы этого или нет.
Большинство физиологических моделей, в кот
К главе 1
Георгиев Г.П. Гены высших организмов и их экспрессия. М.: Наука, 1989. 254 с.
Георгиев Г.П., Бакаев В.В. Три уровня структурной организации хромосом эукариот
К главе 2
Молекулярная биология: Структура и биосинтез нуклеиновых кислот / Под ред. А.С. Спирина. М.: Высш. шк. 1990. 352 с.
Спирин А.С. Молекулярная биология. Структура рибо
К главе 3
Жимулев И.Ф. Гетерохроматин и эффект положения гена. Новосибирск: Наука, 1993. 491 с.
Льюин Б. Гены. М.: Мир, 1987. 544 с.
Молекулярная биология: Стр
К главе 4
Bell S.P. Eukaryotic replicators and associated protein complexes // Curr. Opinion Genet. Develop. 1995. Vol. 5. P. 162–167.
Cesareni G., Heimer-Citterich M., Сas
К главе 5
Ауэрбах Ш. Проблемы мутагенеза. М.: Мир, 1978. 463 с.
DNA repair. A special issue. // Trends Biochem. Sci. 1995. Vol. 20. P. 381–440.
Friedberg E.C., Ger
К главе 7
Патрушев Л.И. Биосинтез белка в искусственных генетических системах // Проблема белка. М.: Наука, 1995. Т.1 Химическое строение белка. С. 354–478.
Рыбчин В.Н. Основы генетиче
К главе 8
Chang T.K., Jackson D.Y., Burnier J.P. et al. Subtiligase: a tool for semisynthesis of proteins // Proc. Nat. Acad. Sci. US. 1994. Vol. 91. P. 12544–12548.
Houghten R.A
К главе 9
Crooke S.T. Progress in antisense therapeutics // Med. Res. Rev. 1996. Vol. 16. P. 319–344.
Dolnick B.J. Naturally occurring antisense RNA // Pharmacol. Ther.
К главе 10
Свердлов Е.Д. Очерки современной молекулярной генетики по курсу лекций для студентов биологического факультета МГУ. Очерк 5. Трансгеноз и новая молекулярная генетика // Молек
К главе 11
Шагинян И.А., Гинцбург А.Л. ПЦР-генетическое типирование патогенных микроорганизмов // Генетика. 1995. Т. 31. С. 600–610.
Graber J.H., O'Donnell M.J., Smith C.L., Cantor C.R.
К главе 12
Benner S.A., Trabesinger N., Schreiber D. Past-genomic science: Converting primary structure into physiological function // Adv. Enzyme Regul. 1998. Vol. 38. P. 155–180.
Billings
Новости и инфо для студентов