Направленный транспорт, внутриклеточная локализация и депонирование мРНК - раздел Медицина, Экспрессия генов По Завершении Регулируемого Синтеза Рнк В Процессе Транскрипции Она Должна Бы...
По завершении регулируемого синтеза РНК в процессе транскрипции она должна быть доставлена к месту трансляции, где сценарий координированной экспрессии генов получает свое дальнейшее развитие. При этом многие виды мРНК оказываются асимметрично распределенными в цитоплазме родительских клеток, пролиферация которых сопровождается избирательным попаданием (доставкой) мРНК в дочерние клетки. В итоге на ранних стадиях эмбриогенеза в зиготе и дочерних клетках происходит образование набора белков без соответствующей транскрипции их собственных генов, что обеспечивает их дальнейшую дифференцировку. Такой тип регуляции экспрессии генов через асимметричное распределение их РНК в цитоплазме играет исключительно важную роль в оогенезе животных, завершаемом образованием зрелых яйцеклеток.
Структура и образование комплекса ооцит–питающие клетки у дрозофилы. Каждый из двух симметрично расположенных яичников дрозофилы содержит ~16 овариол, в передней части каждой из которых находится гермарий. В гермарии происходит асимметричное деление стволовых клеток, сопровождаемое воспроизводством стволовых и образованием коммитированных клеток, называемых цистобластами. Каждый цистобласт делится четыре раза с образованием 16 цистоцитов – группы клеток, связанных друг с другом цитоплазматическими мостиками, которые проходят через специализированные, связанные с цитоскелетом структуры, называемые кольцевыми каналами (ring canals). Лишь один из 16 цистоцитов становится ооцитом, остальные 15 – питающими клетками (nurse cells). Каждая из 16-клеточных зародышевых цист окружена соматическими фолликулярными клетками, что образует яйцевую камеру (1-я стадия развития). Задние части овариол составлены серией яйцевых камер, возраст которых уменьшается по мере удаления от оси тела насекомого. Наиболее удаленные от оси яйцевые камеры находятся в стадии развития 1, а ближайшие к оси – на конечной, 14-й, стадии развития. Для созревания яйцеклетки в яйцевой камере требуется три дня. В это время питающие клетки синтезируют большое количество РНК и белков, которые переносятся в созревающий ооцит. Большинство этих молекул бывают необходимы в первые два часа эмбрионального развития дрозофилы, до начала транскрипции в зиготе.
Выбор клетки, которая становится ооцитом среди 16 цистоцитов, не происходит случайно. Лишь две из 16 клеток связаны кольцевыми каналами с четырьмя другими, и одна из этих двух клеток всегда дифференцируется в ооцит. Большая цитоплазматическая структура, названная фьюсомой (fusome), в формировании которой участвует несколько белков цитоскелета, проходит через кольцевые каналы, объединяющие цистоциты, и участвует в детерминации ооцита. Единственный в 16-клеточном комплексе центр, организующий микротрубочки (microtubule organizing center – MTOC), расположен в проооците. MTOC объединяет нити микротрубочек, исходящих из всех 15 питающих клеток, которые проходят через кольцевые каналы. Поскольку в MTOC сходятся минус-концы микротрубочек, основанный на микротрубочках цитоскелет 16-клеточной конструкции структурно поляризован. Такая направленность микротрубочек играет ключевую роль в упорядоченном транспорте РНК из питающих клеток в созревающий ооцит и специфическом распределении РНК в самом ооците, а следовательно, лежит в основе регулируемой экспрессии генов развивающегося организма.
Этот краткий экскурс в дифференцировку клеток зародышевой линии насекомого был предпринят, в частности для того, чтобы продемонстрировать, насколько самонадеянными являются попытки объяснения живого организма исключительно на молекулярном уровне. Если на заре молекулярной генетики (а именно эта часть дня сейчас за окнами лабораторий) такой подход оказывается плодотворным при изучении механизмов регуляции экспрессии генов у бактериофагов, то он явно не срабатывает в случае многоклеточных организмов. Смещение интересов современных генетиков от индивидуальных генов к организации целых геномов и геномике в силу большой сложности проблемы пока еще лишь намечается. И дело разворачивается медленно не только из-за сложности объекта, но скорее из-за очевидности альтернативного пути. Новых неизвестных генов, так же, как и новых видов насекомых, хватит еще не на одно поколение биологов. Однако для понимания организма как целого неизбежен переход к исследованию функционирования больших надмолекулярных комплексов, клеток и клеточных ансамблей.
Упорядоченное распределение РНК в ооцитах и ранних эмбрионах дрозофилы. Большинство РНК, которые позднее локализуются в растущем ооците, первоначально синтезируются во всех 16 клетках зародышевой линии. При этом временные различия аккумуляции РНК в ооцитах коррелируют с различиями в начале их синтеза, но не с различиями механизмов внутриклеточного и межклеточного транспорта.
Правильную локализацию РНК в ооците во многом обеспечивают микротрубочки его цитоскелета. Например, мутация в гене homeless, сопровождающаяся образованием ооцитов с двумя передними полюсами, приводит на стадии 7 к перемещению минус-концов микротрубочек к обоим полюсам, а их плюс-концов – в центр клетки. Это имеет следствием перераспределение РНК внутри мутантных ооцитов. РНК bicoid накапливается на обоих полюсах ооцитов, а РНК oskar – в центре клетки.
По мере созревания ооцита (стадии 7–8) могут происходить упорядоченные внутриклеточные перемещения импортированной РНК, например между его полюсами. На заключительных стадиях созревания (10–14) питающие клетки усиливают синтез РНК и их перенос в ооциты на фоне перетекания ооплазмы, что сопровождается их специфическим внутриклеточным распределением.
Активация ооцитов после оплодотворения сопряжена с упорядоченными перестройками цитоскелета. Ядра зиготы дрозофилы претерпевают 13 синхронных делений без цитокинеза, образуя зародыш с несколькими тысячами ядер, окруженными общей цитоплазмой. Такой синцитий существует до конца 14-го клеточного цикла, в котором ~6000 ядер локализованы вблизи оболочки – кортекса. Затем впячивания мембраны формируют индивидуальные клетки бластодермы, в которой переднезадняя и дорсовентральная полярность положения клеток уже определена, и они содержат требуемые для дальнейшего развития материнские РНК. На стадии синцития и клеточной бластодермы начинается основной зиготный синтез РНК.
Механизмы регулируемой локализации РНК в клетках животных. Механизмы, обеспечивающие специфическую локализацию РНК в клетках многоклеточных организмов, весьма разнообразны. Прежде всего, после завершения синтеза РНК имеет место ее направленная доставка из ядра в цитоплазму к месту хранения или трансляции. Однако часть внутриклеточных РНК не синтезируется в ядрах этих клеток, а экспортируется в цитоплазму из митохондрий или соседних клеток другой специализации. Кроме того, специальные механизмы контролируют направленное перемещение РНК в цитоплазме и ее избирательную деградацию.
Направленный ядерно-цитоплазматический транспорт РНК. Одним из самых ранних посттранскрипционных событий, связанных с их направленной доставкой к месту внутриклеточной локализации и трансляции, является векторизованный экспорт РНК из ядра в цитоплазму. Несмотря на то что наличие механизма направленного переноса синтезированной РНК из одной части ядра к другой с последующим упорядоченным выходом в цитоплазму кажется очевидным, имеется мало экспериментальных свидетельств этому явлению. Большинство экспериментальных данных такого рода относится к ранним эмбрионам дрозофилы. В частности, направленный перенос продемонстрирован для транскриптов генов hairy и fushi tarazu в эмбрионах на стадии бластодермы, а также для мРНК гена gurken, которая на стадии 8 ооцитов в их цитоплазме располагается по отношению к ядру строго упорядоченно. Помимо всего прочего, результаты этих экспериментов позволили предположить, что ядра как таковые обладают собственной полярностью, независимой от цитоплазматического цитоскелета.
Перенос РНК из клеток одного типа в клетки другого типа. Второй класс механизмов направленной доставки мРНК впервые обнаружен во время оогенеза дрозофилы. В этом случае РНК, синтезированная в питающих клетках, переносится в ооциты по кольцевым каналам. Питающие клетки связаны только с передними полюсами ооцитов, и часть поступающих из них РНК (например bicoid) специфически удерживается после их вхождения и остается в этой зоне ооцитов. У мутантов дрозофилы, для которых характерно взаимодействие питающих клеток с передним и задним полюсами ооцита, транскрипты гена bicoid локализованы на обоих полюсах ооцитов. В отличие от РНК, которые удерживаются на переднем полюсе ооцитов, другие РНК, преимущественно располагающиеся на заднем полюсе, активно переносятся внутри клетки к месту своей локализации. Такой перенос и внутриклеточная локализация транскриптов тесно связаны с цитоскелетом или обеспечиваются другими механизмами, например посредством их избирательной защиты от распада и деградации (подробнее см. ниже).
Импорт РНК из митохондрий. Цитоплазма заднего полюса ооцитов дрозофилы содержит большие, не связанные с клеточными мембранами органеллы – полярные гранулы, которые участвуют в образовании и дифференцировке клеток зародышевой линии. С полярными гранулами тесно ассоциированы митохондрии, осуществляющие экспорт в эти органеллы большой митохондриальной 16S рРНК, которая кодируется митохондриальным геномом. Функции этой РНК в ооците не ясны. Полагают, что она требуется для образования клеток переднего полюса.
Массовая деградация РНК, сопряженная с ее локальной защитой. Гетерогенное внутриклеточное распределение и депонирование РНК могут достигаться за счет ее избирательной защиты от деградации. Например, материнские транскрипты генов nanos, cyclin B и Hsp83 концентрируются в плазме переднего полюса ранних эмбрионов дрозофилы, однако часть РНК остается нелокализованной. РНК переднего полюса переходит в отпочковывающиеся клетки во время дробления ооцита, тогда как остающаяся РНК деградирует. Избирательную защиту РНК в плазме переднего полюса ооцитов обеспечивают вышеупомянутые полярные гранулы.
Другим примером избирательной дестабилизации и защиты мРНК является метаболизм материнской РНК гена PCNA в ооцитах асцидий. В цитоплазме этих ооцитов различают три основные зоны: центральную эктоплазму и периферийные участки, прилегающие к кортексу, между которыми находится миоплазма. Во время оогенеза не кодирующая белок РНК гена YC локализована вокруг ядра в перинуклеарном пространстве и постепенно переносится к кортексу. После оплодотворения эта РНК переходит в миоплазму и ассоциирует с цитоскелетом. 3'-Концевая последовательность YC-РНК комплементарна 3'UTR PCNA-РНК, а также 5'UTR РНК рибосомного белка L5. Вначале синтезируемая PCNA-РНК распределена равномерно в цитоплазме, однако постепенно миоплазма становится свободной от нее. Предполагают, что дестабилизация происходит в результате образования в миоплазме двухцепочечных YC-PCNA РНК-РНК-гибридов. В отличие от этого L5-РНК, несмотря на значительную гомологию с YC-РНК, не дестабилизируется, а накапливается в миоплазме. Истинные механизмы, лежащие в основе различий поведения этих двух транскриптов, остаются неизвестными.
Направленный транспорт РНК в цитоплазме. Многочисленные данные указывают на то, что направленный перенос РНК к специфическим внутриклеточным микрокомпартментам осуществляется при участии и микротрубочек, и микрофиламентов цитоскелета эукариотических клеток. Такие выводы основаны, прежде всего, на результатах, полученных с использованием агентов, специфически нарушающих нормальное формирование частей цитоскелета, построенных из микротрубочек (колхицин, нокодазол, таксол) или микрофиламентов (цитохолазины). Информативными оказались и мутанты дрозофилы, и Sacharomyces с измененными компонентами цитоскелета.
Наиболее изученными в отношении механизмов транспорта являются транскрипты генов bicoid и oskar дрозофилы, первый из которых кодирует фактор транскрипции, а точные функции второго белка неизвестны. В процессе переноса от питающих клеток к месту своей окончательной локализации – переднему полюсу ооцита – РНК bicoid претерпевает несколько стадий ассоциации–диссоциации с компонентами цитоскелета. Внутриклеточный перенос РНК в питающих клетках к кольцевым каналам осуществляется с участием минус-концевого мотора микротрубочек, так как подавляется их деполимеризующими агентами (колхицин, тубулозол С, нокодазол). Перемещение РНК через кольцевые каналы в ооцит не зависит от цитоскелета, поскольку не подавляется ингибиторами образования микротрубочек и микрофиламентов актина. Во время ранних этапов накопления транскриптов гена bicoid в ооцитах они снова ассоциируют с цитоскелетом, переходя в детергент-нерастворимую фракцию. На стадиях 8–11 развития ооцита РНК локализуются у его передней границы в неассоциированном с цитоскелетом состоянии, однако на стадии 14 транскрипты bicoid сильно компактизуются в передней части ооцита, находясь в связанном с микротрубочками состоянии. Наконец, в ранних эмбрионах эта РНК больше не ассоциирована с кортексом и цитоскелетом.
Зависимый от цитоскелета направленный перенос РНК происходит не только в оогенезе. Внутриклеточная локализация многих РНК в нейронах млекопитающих также происходит при участии микротрубочек. Функционирование того же механизма с участием микрофиламентов актина было обнаружено и при специфическом переносе ASH1-РНК в почкующиеся клетки дрожжей S. cerevisiae, а также при мембранной локализации мРНК β-актина в различных соматических клетках животных (фибробластах, миобластах и т.п.).
Захват и фиксация РНК в сайтах внутриклеточной локализации. На стадии 10B оогенеза дрозофилы происходит перестройка микротрубочек цитоскелета ооцита, которые формируют параллельные ряды вблизи его поверхности в субкортикальной зоне. Это индуцирует начало упорядоченного движения ооплазмы (ooplasmic streaming), в которое вовлекаются и многочисленные молекулы мРНК, поступающие в ооцит из питающих клеток. В данном случае РНК, которые специфически накапливаются в задней части ооцита, как бы отфильтровываются из потока ооплазмы путем захвата расположенными там специализированными структурами. Как следует из результатов генетического анализа, по крайней мере два белка Egalitarian и Bicaudal-D вовлечены в этот процесс. В опытах с РНК oskar было установлено, что если первый белок требуется для первоначального захвата РНК oskar , то Bicaudal-D не участвует в начальных этапах этого процесса, но необходим для последующего удержания в задней части ооцита. Полагают, что в норме оба белка взаимодействуют друг с другом.
В захвате и удержании РНК на заднем полюсе ооцита дрозофилы также участвуют полярные гранулы – уже упоминавшиеся большие рибонуклеопротеиновые органеллы, не ассоциированные с клеточными мембранами. Доставляемая к ним в потоке ооплазмы РНК часто находится в составе больших транспортных частиц в комплексе с белками. В частности, РНК bicoid, накапливающаяся на переднем полюсе ооцита, в составе транспортных частиц находится в комплексе с белком Exuperantia, тогда как РНК oskar переносится к заднему полюсу связанной с белком Staufen.
Локализующие последовательности РНК и транс-действующие факторы, участвующие в направленной доставке РНК к местам ее внутриклеточной локализации. Использование гибридных РНК, содержащих в своем составе изучаемые и маркерные последовательности, является основным подходом к исследованию механизмов направленной доставки РНК к местам ее внутриклеточной локализации. В качестве маркерной последовательности часто применяют 5'-концевой фрагмент мРНК β-галактозидазы E. coli, которую обнаруживают в клетках in situ с помощью соответствующих антисмысловых гибридизационных зондов. Делеции, которые приводят к делокализации изучаемых РНК, также позволяют находить последовательности, направляющие РНК в определенные зоны цитоплазмы. В случае дрозофилы внутриклеточное поведение гибридных и мутантных РНК чаще всего исследуют у трансгенных мух. Для введения РНК в клетки также используют прямые инъекции и трансфекцию плазмид, экспрессирующих соответствующие гены.
Для идентификации транс-действующих факторов и их генов в настоящее время применяют три подхода. Первый из них, основанный на получении мутаций, нарушающих внутриклеточную локализацию РНК, используют для дрозофилы и S. cerevisiae. После создания мутантов осуществляют поиск и клонирование мутантных генов. При втором подходе исследуют факторы, специфически взаимодействующие с изучаемыми РНК. Наконец, обнаружение белков или РНК со специфической внутриклеточной локализацией также открывает путь к исследованию их генов.
Цис-действующие локализующие последовательности РНК. Все цис-действующие локализующие последовательности, обнаруженные до настоящего времени, расположены в 3'UTR их РНК. По аналогии с сигнальными аминокислотными последовательностями белков, наличие таких нуклеотидных последовательностей часто оказывается достаточным для направленной внутриклеточной доставки соответствующих РНК.
Создание одиночных локализующих последовательностей может обеспечиваться альтернативным сплайсингом, механизм которого будет подробно рассмотрен в следующем разделе. Например, транскрипты гена Cyclin B дрозофилы процессируются по такому механизму. Короткая форма мРНК синтезируется преимущественно в раннем оогенезе. Она равномерно распределена в проооците до стадий 7–8. В отличие от этого более длинный транскрипт, содержащий дополнительную 3'-концевую последовательность длиной в 393 нуклеотида, в конце концов концентрируется в задней части ооцита и синтезируется в питающих клетках в позднем оогенезе (стадии 9–11). Эта же изоформа мРНК накапливается в перинуклеарном пространстве зародышей на стадии синцития.
В ряде случаев направленный транспорт мРНК (например bicoid) обеспечивается несколькими дискретными последовательностями, расположенными в 3'UTR. У этой мРНК локализующий элемент BLE1 (bicoid localization element) длиной в 50 нуклеотидов является необходимым и достаточным для направленного транспорта мРНК, если он присутствует в виде двух копий. С такой двойной последовательностью взаимодействует белок Staufen, специфичный в отношении двухцепочечных РНК, который фиксирует РНК bicoid в передней зоне ооцита на поздних стадиях оогенеза. Этому способствуют и межмолекулярные взаимодействия РНК через их 3'UTR.
Кажущаяся функциональная избыточность характерна для регуляторных элементов ряда других РНК, содержащих несколько таких последовательностей, каждая из которых способна обеспечивать внутриклеточный транспорт РНК независимо от других. Примером такой РНК является транскрипт гена orb дрозофилы, который кодирует РНК-связывающий белок. Эта РНК начинает поступать в клетку на ранней стадии (1) развития ооцита и концентрируется сначала (стадии 2–7) на его переднем полюсе, а затем (стадии 8–10) на заднем. Такую направленную внутриклеточную доставку обеспечивает локализующий регуляторный элемент длиной в 280 нуклеотидов. Однако искусственное разделение данного элемента на два не инактивировало последовательность, хотя и снижало специфичность распределения РНК в цитоплазме.
Действие некоторых множественных локализующих элементов мРНК оказывается аддитивным. Иными словами, разные сочетания таких последовательностей 3'UTR обеспечивают различную специфичность накопления РНК в цитоплазме. Примерами таких транскриптов являются уже рассматриваемая выше мРНК bicoid, а также мРНК Add-hts (изоформа N4), кодирующая белковый компонент цитоскелета дрозофилы. В последнем случае 3'UTR мРНК содержит центральную локализующую последовательность ALE1 (Add-hts localization element 1) длиной 100–150 нуклеотидов, обеспечивающую накопление РНК вблизи поверхности ооцита на стадиях его созревания 7–8, и другую, необходимую для ее перемещения к передней части созревающего яйца на стадии 9, которая функционирует только в присутствии последовательности ALE1.
В ооцитах многие мРНК не транслируются до тех пор, пока они не доставлены к месту постоянной локализации. В частности, синтез белка, направляемый уже упоминавшейся мРНК oskar, регулируется по такому механизму. В норме трансляция этой мРНК начинается лишь после перемещения к заднему полюсу ооцита. Трансляция нелокализованной мРНК oskar сопровождается многочисленными дефектами развития зародыша насекомого. Контроль трансляции и локализация мРНК обеспечиваются разными последовательностями, расположенными в ее 3'UTR. В подавлении трансляции участвуют регуляторные элементы BRE (Bruno response elements), состоящие из трех дискретных сегментов A, B и C, взаимодействующих с белком-репрессором Bruno (молекулярная масса 80 кДа). Все эти сегменты обладают консервативной последовательностью длиной в 7–9 нуклеотидов: U(G/A)U(A/G)U(G/A)U, которые присутствуют в виде одной копии в сегментах A и B и представлены двумя копиями в сегменте C. Мутационные изменения этой последовательности нарушают взаимодействие с ними репрессора, а следовательно, и подавление трансляции мРНК oskar до завершения ее цитоплазматической локализации.
Транс-действующие белковые факторы. Уже упоминавшийся белок Staufen был обнаружен у мутантов дрозофилы с материнским типом наследования дефектов локализации мРНК bicoid и oskar в цитоплазме ранних эмбрионов. Этот белок связывает двухцепочечную РНК, а также взаимодействует с одноцепочечным участком структуры типа "стебель–петля" в 3'UTR мРНК bicoid, обеспечивая ее правильную локализацию в ооплазме. Те же функции белок Staufen выполняет и в нейробластах, взаимодействуя в позднем эмбриогенезе с 3'UTR мРНК prospero, что необходимо для ее адекватной локализации в нейронах.
Белок Xsl дрозофилы с молекулярной массой 115 кДа взаимодействует с уже обсуждавшимися локализующими элементами BLE1, обеспечивая транспорт мРНК bicoid из питающих клеток и ее накопление в переднем полюсе ооцита. Этот белок выполняет свои функции как непосредственно связываясь с 3'UTR, так и обеспечивая роль посредника во взаимодействии белка Exuperantia с 3'UTR мРНК bicoid в локализующих РНП-частицах. Аллель exuperantia был получен вместе с аллелем staufen. Одновременное присутствие этих аллелей в геноме мутантных мух вначале обнаруживается по нарушению распределения РНК в питающих клетках. Белок Exuperantia накапливается в большом количестве вблизи оболочки передней части ооцита между стадиями 8 и 10. Его мутационные повреждения приводят к нарушению внутриклеточной локализации РНК bicoid в передней части ооцита и к прекращению ассоциации с микротрубочками цитоскелета. Поскольку в норме белок Exuperantia отсутствует на поздних стадиях оогенеза или в ранних эмбрионах, полагают, что он необходим для установления локализованного состояния РНК bicoid, но не для его последующего поддержания. Этот белок переносится в ооциты из питающих клеток в составе больших РНП-частиц через кольцевые каналы.
В настоящее время с помощью генетических и молекулярных методов обнаружено более десяти других транс-действующих белковых факторов, участвующих во внутриклеточной локализации мРНК дрозофилы, и несколько факторов, функционирующих в других организмах. Хотя многие из них оказались гомологичны известным РНК-связывающим белкам, прямое взаимодействие с локализуемыми РНК было продемонстрировано лишь для небольшой их части. Большинство РНК, обладающих такими свойствами, содержат несколько дискретных цис-действующих локализующих последовательностей, с которыми, как полагают, взаимодействуют специфические транс-действующие факторы. Возможно, обнаруженные РНП-частицы, локализующие РНК, содержат в своем составе такие факторы, а также ряд других белков, обеспечивающих взаимодействие РНК с системами ее цитоплазматического транспорта и фиксации в местах постоянной локализации. Большую роль в этих процессах отводят и комплементарным РНК-РНК-взаимодействиям.
Функции локализованных РНК. Направленная доставка и накопление РНК в определенных частях эукариотических клеток являются мощным механизмом, регулирующим экспрессию соответствующих генов в онтогенетическом развитии организмов. Прежде всего, локализованные РНК обеспечивают высокий уровень синтеза кодируемых ими белков в определенных частях клеток. Одновременно с этим предотвращается трансляция этих мРНК в других внутриклеточных компартментах как путем их избирательной деградации, так и с участием белковых репрессоров трансляции. Локализуемые изоформы мРНК с разной специфичностью внутриклеточной доставки, которые могут образовываться в результате альтернативного сплайсинга, обеспечивают синтез соответствующих изоформ белков в разных клетках или цитоплазматических доменах одной и той же клетки. При этом асимметричное внутриклеточное распределение мРНК, в свою очередь, может приводить к неравномерному их распределению в дочерних клетках, получающих специфические наборы мРНК. Это может быть одним из ключевых моментов последующей дифференцировки клеток-потомков. Ряд РНК, локализующихся в цитоплазматических компартментах, не кодируют белки. Во многих случаях их роль не ясна. Полагают, что они могут выполнять структурные функции в локализующих РНП-частицах или органеллах, например зародышевых гранулах ооцитов. Кроме того эти РНК могут участвовать в фиксации локализуемых РНК в местах их накопления в цитоплазме.
От молекул ооцита дрозофилы к зародышу. Не все мРНК ооцита имеют своим источником питающие клетки. В частности, ген gurken, играющий ключевую роль в становлении переднезадней и дорсовентральной осей ооцита, транскрибируется в его ядре. Для этой РНК характерна строго выраженная внутриклеточная локализация. На стадии 7 она ассоциирована только с задним полюсом ооцита, на стадии 8 – с обоими полюсами, а на стадиях 8–10 – с переднеспинной зоной. Белок Gurken является секретируемым TGFα-подобным фактором роста, который передает ключевой сигнал к окружающим ооцит фолликулярным клеткам, которые обеспечивают становление осей ооцита. Сначала сигнал в виде секретируемого фактора поступает к фолликулярным клеткам, окружающим заднюю часть ооцита, что обеспечивается соответствующей локализацией мРНК gurken. Это приводит к становлению переднезадней оси ооцита и поляризации его цитоскелета, построенного из микротрубочек, что является важнейшим условием дальнейшей локализации РНК. Сигнал в виде вышеупомянутого фактора роста, поступающий из переднеспинной части ооцита к питающим клеткам, приводит к становлению дорсовентральной оси яйцевой камеры. Локализация мРНК gurken в переднеспинной части ооцита, в свою очередь, является следствием зависимого от цитоскелета перемещения ядра ооцита в эту зону цитоплазмы.
мРНК bicoid начинает транслироваться в месте ее локализации на переднем полюсе раннего зародыша вскоре после оплодотворения. Поскольку на этой стадии зародыш представляет собой бесклеточный синцитий с многими ядрами, образующийся белок диффундирует к заднему полюсу зародыша, образуя градиент концентрации вдоль его переднезадней оси, которая максимальна в его передней части. Белок Bicoid является гомеодоменным фактором транскрипции. Он активирует синтез РНК соответствующих генов только в ядрах, расположенных в передней половине зародыша. При этом активация генов зависит от концентрации фактора. Например, ген hunchback содержит высоко аффинный сайт связывания белка Bicoid и активируется как в местах высокой, так и низкой концентраций фактора. В отличие от этого, такие гены как orthodenticle и empty spiracles обладают низкоаффинными сайтами связывания фактора и начинают транскрибироваться лишь в ядрах, расположенных ближе к переднему концу зародыша. По такому механизму формируются островки дифференцирующихся клеток передней части зародыша с разными группами экспрессирующихся генов. Однако это не все. Белок Bicoid обладает способностью функционировать не только как фактор транскрипции, но и как репрессор трансляции определенных РНК (например caudal), с 3'UTR которых он прямо взаимодействует. В результате передняя локализация мРНК bicoid приводит к образованию обратного градиента концентрации белка Caudal, РНК которого исходно не локализована. В итоге пик концентрации этого белка имеет место в задней части зародыша, где он также определяет наборы транскрибирующихся генов.
Приведенные примеры охватывают далеко не все механизмы, детерминирующие дифференцировку клеток в развивающемся зародыше, и служат для иллюстрации ключевой роли посттранскрипционной внутриклеточной локализации мРНК в контроле экспрессии генов, транскриптами которых они являются. Как можно видеть уже из этих примеров, посттранскрипционное перемещение и метаболизм РНК являются важными элементами регуляции экспрессии генов в онтогенезе. Ниже некоторые другие аспекты метаболизма РНК как регулятора экспрессии генов будут рассмотрены более подробно.
Все темы данного раздела:
ЧАСТЬ I. МЕХАНИЗМЫ ХРАНЕНИЯ И РЕАЛИЗАЦИИ ГЕНЕТИЧЕСКОЙ ИНФОРМАЦИИ
ВВЕДЕНИЕ
Организм. Живой организм представляет собой самовоспроизводящуюся, открытую термодинамическую систему, в которой пути превращения вещества и э
Средний размер гаплоидного генома у некоторых групп организмов
Группы организмов
Средний размер генома, п.о.
Мелкие вирусы
1,0·104
Микоплазмы
1,6·1
Гены и хромосомы
Генетическая информация о структуре отдельных белков и нуклеиновых кислот у всех организмов заключена в молекулах ДНК или РНК в виде последовательностей нуклеотидов, называемых генами
Геном прокариот
Как уже было упомянуто выше, основной чертой молекулярной организации прокариот является отсутствие в их клетках (или вирионах – вирусных частицах, в случае вирусов) ядра, отгороженного ядер
Геном вирусов
По определению Х. Френкель-Конрата, "вирусы – это частицы, состоящие из одной или нескольких молекул ДНК или РНК, обычно (но не всегда) окруженных белковой оболочкой; вирусы способны передават
Геном архебактерий
Царство архебактерий представляет собой своеобразную и наименее изученную таксономическую группу прокариот. Хотя по своей морфологии Archeabacteria похожи на привычные эубактерии, на молекулярном у
Минимальный размер генома одноклеточных организмов
Определение минимального размера генома, обеспечивающего все необходимые функции, которые позволяют одноклеточному организму существовать в определенных экологических условиях, не является праздным
Геном эукариот
Как уже упоминалось выше, в отличие от прокариот основная часть генома эукариот находится в специальном клеточном компартменте (органелле), получившем название ядра, а значи
Последовательности нуклеотидов эукариотического генома
Геном эукариот составляют уникальные и повторяющиеся последовательности нуклеотидов. Содержание уникальных последовательностей в геноме, определенное на основании кинетики реассоциации фрагментиров
Хроматин
Хроматином называют сложную смесь веществ, из которых построены хромосомы эукариот. Основными компонентами хроматина являются ДНК, гистоны и негистоновые белки, образующие высо
Свойства гистонов животных
Гистон
Размер полипептида
(число аминокислот)
Локализация и типы посттрансляционных модификаций
Вся мол
Роль ДНК-топоизомераз в обеспечении структуры и функционирования хроматина
Топоизомеразы контролируют в клетках уровень суперскрученности ДНК, который может изменяться в процессе ее репликации, транскрипции, гомологичной рекомбинации, а также во время перестроек хроматина
Транскрипция
В процессе транскрипции генов происходит биосинтез молекул РНК, комплементарных одной из цепей матричной ДНК, сопровождаемый полимеризацией четырех рибонуклеозидтрифосфатов (ATP, GTP, CTP и UTP) с
ДНК-зависимые РНК-полимеразы
В соответствии с субъединичным составом РНК-полимеразы подразделяются на две группы. К первой группе относятся ферменты, состоящие только из одной субъединицы, среди них – РНК-полимеразы митохондри
РНК-полимеразы II дрожжей
Компонент
Характеристика
Pol II
РНК-Полимеразная активность, взаимодействует с множеством общих и тканеспецифических факторов транск
Единицы транскрипции (транскриптоны)
Синтез РНК молекулами РНК-полимераз in vivo начинается в определенных местах ДНК, называемых промоторами, и завершается на особых регуляторных последовательностях – терминаторах. Посл
Этапы транскрипции
Процесс транскрипции в настоящее время принято подразделять на 4 основные стадии: 1) связывание молекул РНК-полимеразы с ДНК и распознавание промотора; 2) инициация; 3) элонгация; 4)
Субъединичный состав и характеристика основных факторов транскрипции (GTF) РНК-полимеразы II человека
Фактор
(GTF)
Молекулярные массы субъединиц (кДа) и их обозначение
Характеристика
TFIIA
37 (a)
19
Основные факторы элонгации РНК-полимеразы II
Фактор
Структура
Молекулярная масса полипептидов, кДа
Функция
P-TEFb
Гетеродимер
124, 43
Хроматин во время транскрипции
В эукариотических клетках матрицей для РНК-полимераз служит ДНК, находящаяся в составе хроматина. Из общих соображений белки нуклеосом и более высокоорганизованного хроматина должны быть препятстви
Котранскрипционные и посттранскрипционные модификации РНК
Транскрипция у любого организма является первым этапом реализации генетической информации – экспрессии генов. Однако первичные транскрипты, как правило, представляют собой лишь предшественники зрел
Процессинг РНК у бактерий
мРНК прокариот обычно являются полицистронными, т.е. включают в себя последовательности нуклеотидов нескольких генов одного оперона (рис. I.10,а). Полицистронные мРНК бактерий при выполнении
Редактирование пре-мРНК
Недавно появились сообщения о новых механизмах изменения кодирующего потенциала мРНК на посттранскрипционном уровне, названных редактированием РНК (editing). Оказалось, что в клетках многих
Различные способы редактирования мРНК
Объект
Модифицированные или добавленные нуклеотиды
Митохондрии трипаносом
AAUUUAUGUUGUCUUU
Митохондрии P. po
Редактирование РНК у животных и их вирусов
Организм, ткань
Локализация
РНК-субстрат
Последствия редактирования
Печень/кишечник крыс
Ядро
Другие модификации эукариотических мРНК
Посттранскрипционные модификации предшественников эукариотических мРНК по сравнению с теми же изменениями первичных транскриптов прокариот более разнообразны и играют большую роль в регуляции экспр
Сравнение полиаденилирования мРНК у эукариот и прокариот
Функции
Млекопитающие
E. coli
Длина поли(А)-последовательностей, нт
80–200
14–60
У
Интронов группы I
Аутосплайсинг
Обратное лигирование
GTPOH
+
[Экзон 1]upA-Интрон-Gpa[Экзон 2]
↓
Кэп-связывающий комплекс в роли фактора, сопрягающего основные реакции метаболизма транскриптов РНК-полимеразы II
РНК не может находиться in vivo в свободном виде. На протяжении всего внутриклеточного существования – от инициации биосинтеза до полной деградации – РНК пребывает в составе рибонуклеопротеиновых к
Функциональная компартментализация ядра
При рассмотрении механизмов реализации генетической информации на уровне транскрипции и посттранскрипционных модификаций РНК чаще всего не принимается во внимание пространственная внутриклеточная о
Интерфазные хромосомы в ядре
В разделе 1.3 уже кратко обсуждался петельно-доменный уровень структурной организации хромосом эукариот, который отражает разделение интерфазных хромосом на дискретные домены по функциональному при
Ядрышко
Структурно-функциональная организация ядрышка (nucleolus) еще более наглядно иллюстрирует концепцию функциональной компартментализации ядра эукариотических клеток. В этой части ядра происход
Пространственная организация синтеза мРНК
Внутриядерный синтез мРНК и доставка зрелых транскриптов к месту их трансляции требуют участия множества тонко сбалансированных во времени, пространственно организованных молекулярных механизмов. В
Ядерные тельца и домены
Исследования структурно-функцональных отношений в ядре в связи с компартментализацией транскрипции, процессинга РНК и репликации продемонстрировали наличие особых функций у многих морфологически ра
Компартментализованное ядро
Два основных структурных образования характерны для ядер всех эукариот. Это, во-первых, оболочка ядра с ядерными порами, связанная с ядерной ламиной (электронно-плотный слой, прилегающий к я
Биосинтез белка рибосомами бактерий
В процесс биосинтеза белка рибосомами, называемого трансляцией, вовлечено множество макромолекул и макромолекулярных комплексов. На этом этапе реализации генетической информации происходит с
Рибосомы
Рибосомы представляют собой крупный рибонуклеопротеидный комплекс с молекулярной массой ~ 2,5 мДа, состоящий из рибосомных белков, молекул рРНК и ассоциированных с ними факторов трансляции. Рибосом
Этапы биосинтеза белка
Хотя построение первых моделей механизмов биосинтеза белка было начато еще в начале 1960-х гг., полное описание процесса трансляции далеко до завершения и в настоящее время. Ниже будут кратко рассм
Антибиотики, действующие на уровне трансляции
На рис. I.21 приведены некоторые широко распространенные антибиотики, являющиеся ингибиторами биосинтеза белка у бактерий. Многие из них находят применение не только как лекарственные средства, но
Трансляция у эукариот
Бактерии обладают единственной универсальной системой трансляции, основные механизмы функционирования которой были кратко рассмотрены выше. В отличие от этого, клетки животных кроме основной систем
Особенности первичной структуры эукариотических мРНК
Зрелая мРНК эукариот наряду с основной последовательностью нуклеотидов, в которой закодирована информация о последовательности аминокислот в соответствующем белке, содержит целый ряд некодирующих п
Инициация биосинтеза белка эукариотическими рибосомами
Как будет видно из дальнейшего изложения, инициация трансляции эукариотических мРНК может осуществляться, по крайней мере, тремя способами. В соответствии с первым наиболее распространенным механиз
Элонгация полипептидных цепей
Элонгация полипептидных цепей в ходе эукариотической трансляции традиционно пользовалась меньшим вниманием исследователей по сравнению с инициацией, поскольку считалось, что ее механизмы в основных
Терминация трансляции
В эукариотических белоксинтезирующих системах терминация трансляции, как и у бактерий, контролируется специфическими рилизинг-факторами. Однако у эукариот эти факторы менее разнообразны. В частност
Трансляция в митохондриях
Митохондрии являются органеллами эукариотических клеток, в которых в результате окислительного фосфорилирования энергия химических связей, освобождающаяся при метаболизме, накапливается в виде энер
Трансляция в хлоропластах.
Хлоропласты являются органеллами клеток растений, осуществляющих процесс фотосинтеза – преобразование энергии квантов света в энергию макроэргических связей ATP. Так же как и митохондрии, хлороплас
Регуляция экспрессии генов на уровне транскрипции у прокариот
Регуляция транскрипции в клетках осуществляется на уровне индивидуальных генов, их блоков и даже целых хромосом. Возможность управления многими генами, как правило, обеспечивается наличием у них об
Регуляция на уровне инициации транскрипции
Активность многих генов прокариот регулируется с помощью белковых факторов, взаимодействующих с регуляторными участками промоторов генов. При этом происходят как активация транскрипции генов, так и
Регуляция синтеза РНК на уровне элонгации и терминации
Выше было отмечено, что РНК-полимераза в процессе элонгации цепей РНК перемещается неравномерно вдоль матричной ДНК и во время ее движения имеют место остановки (паузы). Время задержки молекул РНК-
Регуляция экспрессии генов на уровне транскрипции у эукариот
Несмотря на то что основные принципы регуляции транскрипции генов у прокариотических и эукариотических организмов остаются неизменными – через специфические взаимодействия белков и нуклеиновых кисл
Передача сигнала и вторичные мессенджеры
Жизнь любой клетки, включая глобальные процессы ее роста, деления и даже гибели, зависит от внешних регуляторных сигналов, которые она воспринимает. Такими сигналами могут быть физические воздейств
Рецепторы мембран, осуществляющие трансмембранный перенос сигнала
Класс рецепторов
Четвертичная структура
Система переноса сигнала
Лиганд
1. Олигомеры, окружающие каналы:
а) активируе
Механизмы позитивной регуляции транскрипции
При обсуждении механизмов внутриклеточной передачи сигнала были упомянуты регуляторные белки, взаимодействующие со специфическими последовательностями нуклеотидов генов и получившие название фактор
Функциональные домены факторов транскрипции
Домен
Функция
Факторы, содержащие домен
Примечание
Механизмы негативной регуляции транскрипции
Позитивный контроль транскрипции у эукариот, в котором участвуют многочисленные активаторы транскрипции, играет ключевую роль в регуляции экспрессии их генов на уровне транскрипции. Однако негативн
Импринтинг
Другим характерным примером регуляции экспрессии генов, приводящей к эпигенетическому наследованию признаков, является уже упомянутый выше импринтинг, при котором специфический характер дифференциа
Метилирование ДНК в регуляции транскрипции
Единственной известной генетически запрограммированной ковалентной модификацией ДНК у высших эукариот является метилирование остатков цитозина в положении 5 с образованием 5-метилцитозина (5-mC). Э
Сплайсинг РНК в регуляции экспрессии генов
Разнообразные механизмы процессинга РНК в клетках были уже рассмотрены выше. Как оказалось, созревание мРНК играет важную роль и в регуляции экспрессии тех генов, транскриптами которых эти РНК явля
Избирательная деградация мРНК
Время полужизни мРНК в клетках является важным фактором регуляции экспрессии генов. Феномен деградации мРНК как регуляторного явления впервые обнаружен у бактерий на заре развития молекулярной гене
Регуляция экспрессии генов на уровне трансляции
В процесс биосинтеза белка рибосомами вовлекается большое количество мРНК, экипированных разнообразными регуляторными элементами. Даже в случае клеток дрожжей количество транслируемых видов мРНК пр
Регуляция инициации трансляции
Инициация, т.е. сборка компонентов системы трансляции на 5'-конце мРНК, завершающаяся образованием первой пептидной связи, является важнейшей точкой приложения регуляторных воздействий на уровне тр
Регуляция элонгации синтеза полипептидных цепей
При обсуждении механизмов элонгации цепей РНК в процессе транскрипции была отмечена неравномерность прочитывания матричной ДНК РНК-полимеразами. То же самое наблюдается и во время элонгации растущи
Регуляция терминации трансляции
Альтернативные сайты терминации трансляции могут быть использованы для расширения кодирующего потенциала определенных генов. Выше уже был рассмотрен пример, в котором в результате редактирования РН
Синтез белков, содержащих остатки селеноцистеина
С помощью своеобразного механизма осуществляется передача генетической информации от генов к полипептидным цепям селенопротеинов с необычным аминокислотным остатком – селеноцистеином, входящим в их
Посттрансляционная регуляция экспрессии генов
Синтезом полноценного полипептида в результате трансляции кодирующей его мРНК рибосомами обычно завершается процесс передачи генетической информации от генов к белкам как у бактерий, так и у высших
Последствия фолдинга вновь синтезированных полипептидных цепей
В процессе трансляции растущие полипептидные цепи начинают приобретать высокоспецифическую пространственную структуру, которая формируется полностью вскоре после завершения их биосинтеза. Процесс с
Специфические протеиназы в посттрансляционном процессинге белков
Одним из характерных примеров специфического действия протеиназ является активация предшественников (зимогенов) протеолитических ферментов (трипсина и химотрипсина) после их переноса от места синте
Убиквитин-зависимая система протеолиза в регулируемой деградации белков
Убиквитин-зависимая система протеолиза проводит поиск потенциальной мишени для протеолитической деградации среди огромного числа внутриклеточных белков. Все белки несут в себе специфические сигналы
Сплайсинг белков
Феномен сплайсинга белков, обнаруженный в 1990 г. в группой Т.Стивенса, пошатнул еще один постулат молекулярной биологии, в соответствии с которым последовательности нуклеотидов зрелых мРНК всегда
Другие посттрансляционные модификации белков
Многие белки и секретируемые пептиды претерпевают различные структурные изменения в результате котрансляционных и посттрансляционных модификаций, т.е. во время или после завершения их синтеза рибос
Репликация ДНК
Репликация ДНК происходит в соответствии с правилами Уотсона–Крика и наряду с биосинтезом РНК и белков является еще одним примером матричного синтеза биологических макромолекул. Во время репликации
Белки, входящие в состав репликативных комплексов прокариотических и эукариотических организмов
Белки в организмах
Функции компонентов комплексов
E. coli
Фаг Т4
Вирус SV40 / человек
DnaB
Репликативная вилка E. coli и бактериофага T4
Во время редупликации ДНК ее дочерние синтезирующиеся цепи расходятся из точки репликации, образуя Y-подобную структуру, называемую репликативной вилкой. Именно в окрестностях этой точки раз
Особенности функционирования репликативной вилки эукариот
Механизмы репликации ДНК у высших эукариот менее изучены из-за их большей сложности. Основные результаты получены на модельной системе с ДНК вируса SV40, в которой процесс репликации исследовали в
Эукариотические ДНК-полимеразы и их функциональные гомологи у прокариот
ДНК-полимераза
Ген дрожжей
Гомолог E. coli
Молекулярные массы субъединиц, кДа
Биологические функции
a
Регуляция репликации ДНК
Подробное рассмотрение молекулярных механизмов регуляции репликации ДНК выходит за рамки книги, поэтому ограничимся несколькими замечаниями по данному вопросу и более детально обсудим лишь механизм
Инициация репликации ДНК у E. coli и ее регуляция
Репликация хромосомной ДНК у бактерий играет ключевую роль в их жизненном цикле. В ходе этого процесса микроорганизмы редуплицируют свой геном, а образовавшиеся дочерние геномы далее переходят в до
Регуляция репликации плазмиды ColE1
Многие клетки прокариот в дополнение к основной хромосоме содержат небольшие внехромосомные ДНК, называемые плазмидами. Плазмиды, размеры которых варьируют от нескольких тысяч до сотен тысяч
Особенности репликации линейных геномов
Кольцевые замкнутые геномы характерны для многих бактерий, их плазмид и некоторых вирусов. У подавляющего большинства других организмов геном представлен линейными молекулами ДНК в составе одной ил
Линейные хромосомы бактерий
Афоризм Жака Моно: "То, что верно для E. coli, – верно и для других бактерий (слона)" получил широкое распространение. К счастью, на деле все обстоит не так скучно. До недавнего времени о
Репликаторы эукариот
Хромосомы эукариот содержат линейные молекулы ДНК, а следовательно, остаются все те же проблемы, связанные с их репликацией, которые обсуждались в связи с воспроизводством линейных хромосом бактери
Репликация теломерных участков эукариотических хромосом
Исследование механизмов репликации теломерных участков эукариотических хромосом показало, что они принципиально отличаются от механизмов репликации центральных областей ДНК. Изучение этих механизмо
Пространственная организация синтеза ДНК у эукариот
Пространственная организация репликативного синтеза ДНК у эукариот является одним из наиболее ярких примеров внутриядерной компартментализации генетических процессов. Анализ локализации мест синтез
Мутации
Мутации – это наследуемые изменения структуры генома. Поскольку основу любого генома составляют нуклеиновые кислоты – ДНК или РНК, то под действием мутаций происходит, прежде всего, изменение струк
Основные источники мутаций и методы определения мутагенной активности
В основе мутаций на молекулярном уровне лежат две основные причины: ошибки репликации и мутагенные воздействия различной природы. Ошибки репликации возникают из-за того, что точность функционирован
Метаболиты нормальной микрофлоры человека, обладающие мутагенной и канцерогенной активностями
Соединение
Метаболит
Тип активности
Метионин
Этионин
К
SOS-мутагенез у бактерий
Образование мутаций в клетках организма, подвергнутого мутагенному воздействию, происходит в основном по одному и тому же механизму. При прохождении репликативного комплекса через некодирующий или
Мутаторный фенотип
Несмотря на обилие эндогенных и экзогенных мутагенов, лишь небольшая часть их взаимодействий с ДНК завершается образованием мутаций. Для того чтобы исходное повреждение ДНК в виде аддукта, апуринов
Экспансия ДНК
Под экспансией ДНК понимают увеличение числа копий коротких повторяющихся последовательностей нуклеотидов внутри кластера при передаче генетической информации от родителей потомкам. В настоящее вре
Адаптивные мутации
Проблема, связанная с возможностью возникновения адаптивных мутаций, имеет глубокие корни в биологии. За 50 лет до того как Ч. Дарвин начал свои знаменитые исследования происхождения биологических
Механизмы защиты генома от мутаций
Несмотря на то что иногда мутации помогают организму выжить, подавляющее большинство мутационных изменений генома нежелательно и сопровождается развитием различных патологических состояний мутантно
Репарация ДНК
Большая группа молекулярно-генетических явлений, известная в настоящее время под общим названием "репарация повреждений ДНК", была осознана как отдельный и очень важный биологический фено
Эксцизионная репарация в клетках животных
Эксцизионная репарация ДНК путем удаления поврежденных азотистых оснований (BER). Система BER вызывает защиту геномной ДНК от повреждений, вызываемых главным образом алкилирующими
ДНК-гликозилазы и эндонуклеазы клеток микроорганизмов и человека, участвующие в BER
Фермент
Источник
Ген
Субстрат (см. рис. I.57)
Урацил-ДНК-гликозилаза
E. coli
S. cerevisiae
Человек
Белки животных, участвующие в NER
Белковая система
Белки системы
Ферментативная активность
Функция в репарации
XPA
XPA (p31)
Св
Гомологичная рекомбинация в репарации ДНК
Давно известно, что быстро делящиеся бактериальные клетки, содержащие несколько репликонов, образованных недореплицированными хромосомами (см. введение к разделу 4.2), более устойчивы к действию ио
Репарация ошибочно спаренных нуклеотидов
Система, осуществляющая репарацию ошибочно спаренных нуклеотидов (mismatch repair), выполняет в клетке несколько важных функций. Прежде всего она исправляет ошибки репликации ДНК, меняя ошибочно вк
Полимераза поли(ADP-рибозы) в репарации ДНК у эукариот
В отличие от бактерий одним из первых ответов клеток животных на тяжелые повреждения ДНК является массированная полимеризация остатков ADP-рибозы специальным ферментом – полимеразой поли(ADP-риб
Альтруистичная ДНК
Как следует из вышеизложенного, стабильность генетической информации любого организма обеспечивается двумя различными путями. Прежде всего, системы детоксикации ксенобиотиков и эндогенных мутагенов
Парадокс возможности существования многоклеточных организмов
Огромный размер генома многоклеточных организмов с генетической точки зрения должен создавать для их существования многочисленные и, на первый взгляд, трудноразрешимые препятствия. Проблемы начинаю
Повышение информационной стабильности генома избыточными последовательностями
Анализ структуры генома современных эукариот показывает, что эволюционные преобразования генома-предшественника, приведшие к включению в него избыточных последовательностей нуклеотидов, сопровождал
Селективная защита генов от мутаций
Во всех предыдущих рассуждениях речь шла о глобальной защите функционально значимых участков гипотетического генома от спонтанных и индуцируемых мутаций некодирующими последовательностями нуклеотид
Высокоупорядоченное расположение летальных генов на хромосомах
Если гипотеза о наличии внутри ядер генетически детерминированных, пространственно упорядоченных участков геномной ДНК является верной, то это влечет за собой важное следствие. В этом случае в проц
Возможный смысл парадокса С
У организмов, находящихся на примерно одинаковых ступенях эволюционного развития, часто наблюдаются значительные вариации в размерах геномов (см. главу 1). Например, у некоторых видов рыб, относящи
Рестриктазы и ДНК-метилазы
Среди ферментов, используемых в генной инженерии для клонирования, большое значение имеют эндонуклеазы рестрикции – рестриктазы. Эти ферменты, впервые открытые как часть системы рестрикции–м
Эффективность расщепления коротких последовательностей ДНК некоторыми распространенными рестриктазами
Рестриктаза
Последовательность олигонуклеотидов в окрестностях сайта рестрикции
Длина цепи, нт
Процент расщепления олигонуклеотида после инкуба
ДНК- и РНК-лигазы
Создание фосфодиэфирных связей в одноцепочечных разрывах двухцепочечной ДНК с помощью ДНК-лигаз является наряду с рестрикцией одним из важнейших этапов получения рекомбинантных ДНК in vitro. Наибол
Ферменты матричного синтеза ДНК и РНК
К ферментам матричного синтеза нуклеиновых кислот относятся многочисленные ДНК- и РНК-зависимые ДНК- и РНК-полимеразы, осуществляющие зависимый от матричных ДНК или РНК синтез нуклеиновых кислот. Э
Частота ошибок при синтезе ДНК, осуществляемом термостабильными ДНК-полимеразами in vitro при проведении ПЦР в оптимальных условиях
ДНК-полимераза
Частота мутаций
(на 1 нуклеотид/1 раунд репликации)
Pfu
1,3 10-6
Deep Vent
Другие ферменты
Среди других многочисленных ферментов, используемых в генной инженерии, прежде всего следует упомянуть полинуклеотидкиназы, которые осуществляют перенос g-фосфатных групп ATP на 5’
Векторы
Ферменты, описанные в предыдущем разделе, позволяют производить тонкие манипуляции как с протяженными молекулами ДНК, так и с их фрагментами. В частности, с помощью рестриктаз можно с большой точно
Векторы на основе фага l
Основным недостатком плазмидных векторов для клонирования является их малая емкость в отношении клонируемых фрагментов ДНК. Размер вставок клонируемой ДНК в плазмидных векторах, которые способны ст
Интегрирующие и челночные (бинарные) векторы
Векторы, пригодные для клонирования ДНК в бактериях, отличающихся от E. coli, должны обладать всеми характерными чертами, которые были отмечены выше. От только что рассмотренных они отличаются глав
Конструирование экспрессирующих векторов и их функционирование
Первая часть книги была посвящена описанию механизмов, обеспечивающих высокоэффективную и высокоспецифическую экспрессию генов. Такого рода информацию успешно используют в настоящее время для эффек
Векторы для переноса ДНК в клетки животных и растений
Все основные принципы, используемые при конструировании бактериальных векторов, применимы и для получения векторов эукариотических клеток. Как и в случае бактерий, эукариотический вектор представля
Клонотеки генов
Любой индивидуальный ген занимает лишь небольшую часть генома живого организма. В то же время размер генома даже наиболее просто организованных бактерий в среднем составляет 2•106 п.о.,
Получение клонотек генов
Клонотека генов представляет собой набор разных последовательностей нуклеотидов ДНК, клонированных в составе векторных молекул, которые в сумме составляют весь геном исследуемого организма или каку
Методы скрининга клонотек генов
Все методы получения из клонотек генов требуемых последовательностей нуклеотидов можно разделить на две группы. При использовании первой группы методов рекомбинантные бактерии или фаговые частицы и
Эукариотические системы экспрессии рекомбинантных генов, основанные на культурах клеток
Выделение любого нового рекомбинантного гена описанными выше методами неизбежно заканчивается попытками получения его полноценной экспрессии в искусственных генетических системах. Только на первый
Клетки яичников китайских хомячков (линия CHO)
Эта линия клеток и ее многочисленные производные часто используются для синтеза рекомбинантных белков после предварительной эндогенной амплификации соответствующих рекомбинантных генов, введенных в
Клетки селезенки мышей (линия MEL)
Обе системы экспрессии, описанные выше, базируются на амплификации трансгенов, обеспечивающей высокий уровень внутриклеточного синтеза кодируемых ими рекомбинантных белков в отобранных клонах клето
Клетки африканской зеленой мартышки (линия COS)
Получение временной экспрессии генов в клетках COS часто используется для быстрой наработки рекомбинантных белков и ДНК. При конструировании клеток COS клетки зеленой мартышки CV-1 были трансформир
Клетки насекомых, зараженные бакуловирусами
Многочисленное семейство бакуловирусов, размножающихся в клетках беспозвоночных, обладает геномом в виде двухцепочечной кольцевой ковалентно замкнутой ДНК длиной в 80–220 т.п.о. Круг хозяев бакулов
Сравнение эффективности рассмотренных систем экспрессии
Проведено сравнение эффективности рассмотренных выше систем экспрессии эукариотических рекомбинантных генов с использованием гена huLIF в качестве модели. In vivo этот белок с молекулярной массой 3
Бесклеточные белоксинтезирующие системы
Среди искусственных систем биосинтеза белка важное место занимают бесклеточные системы. Любая бесклеточная система создается, прежде всего, для моделирования конкретных биохимических процессов, про
Прокариотические системы
Среди прокариотических бесклеточных белоксинтезирующих систем наибольшее распространение получили системы на основе экстрактов клеток E. coli, хотя основные принципы, используемые для их получения,
Эукариотические системы
Несмотря на относительную простоту получения бактериальных белоксинтезирующих систем, их использование ограничивается трансляцией бактериальных и фаговых мРНК или рекомбинантных последовательностей
Проточные системы
Бесклеточные системы биосинтеза белка позволили генной инженерии получать экспрессию изолированных генов, не прибегая к помощи живых клеток. До недавнего времени все обсуждавшиеся выше бесклеточные
Другие современные методы исследования генов
Основным методическим достижением генной инженерии в исследовании генов является разработка способов выделения индивидуальных генов и экспрессии их в новом генетическом окружении в гомологичных и г
Рестрикционное картирование генов
Полную, но, к сожалению, пока трудно интерпретируемую информацию о строении гена может дать только определение его первичной структуры, т.е. последовательности составляющих ген нуклеотидов. На прак
S1-картирование РНК и ДНК
Нуклеаза S1, специфически гидролизующая одноцепочечные ДНК и РНК, успешно используется для исследования колинеарности ДНК и кодируемой ей РНК, точного картирования мест инициации и терминации транс
Футпринтинг
Принцип защиты последовательности нуклеотидов рестрикционных фрагментов ДНК белками от действия агентов, расщепляющих ДНК, лежит в основе футпринтинга – метода, позволяющего определять места специф
Стратегия выделения нового гена
После обсуждения основных экспериментальных приемов, используемых в современной генной инженерии, становится ясно, каким образом можно решить одну из основных методических задач молекулярной генети
Методы направленного получения мутаций
Развитие генной инженерии революционизировало процесс получения мутаций в конкретных участках генома и анализ последствий этих мутаций на молекулярном уровне. Совокупность методов получения мутаций
Получение делеций и вставок
Делецией называют потерю части нуклеотидов в геноме организма. Такой вид мутаций удобнее всего использовать для локализации (картирования) функционально значимых участков генов и кодируемых
Химический мутагенез
Делеции и вставки, создаваемые в структурных частях генов, как правило, их инактивируют, особенно в тех случаях, когда такие мутации приводят к сдвигу открытых рамок считывания. Поэтому делеции и в
Полимеразная цепная реакция в направленном мутагенезе
Разработка метода полимеразной цепной реакции принципиально изменила ситуацию в исследованиях по направленному мутагенезу. Использование ПЦР для направленного мутагенеза основано на применении в ка
Белковая инженерия
После рассмотрения способов получения сайт-специфических мутаций необходимо сделать лишь один шаг, чтобы оказаться лицом к лицу с бурно развивающимся направлением молекулярной генетики, называемым
Библиотеки пептидов и эпитопов
В живом организме большинство биологических процессов управляется посредством специфических белок-белковых или белково-нуклеиновых взаимодействий. К таким процессам относятся, например регуляция тр
Белки-репортеры в гибридных белках
В рассмотренных выше библиотеках пептидов последние ковалентно связаны с белком-носителем. В таком виде они являются одними из представителей гибридных белков, получаемых методами генной инженерии.
Подходы к созданию новых ферментов
Подавляющее большинство исследований, в которых методы белковой инженерии используют для замен отдельных аминокислотных остатков в полипептидных цепях белков, заканчиваются получением мутантных про
Субтилигаза в лигировании пептидов
В заключение рассмотрим еще одно неожиданное направление белковой инженерии, четко обозначившееся в самое последнее время. Во всех вышеупомянутых подходах конструирование белков с новыми свойствами
Концепция ксенобиоза
Успехи белковой инженерии, демонстрирующие возможность изменения субстратной специфичности ферментов путем замены одной или нескольких аминокислот с помощью направленного мутагенеза, наводят на мно
Антисмысловые РНК и олигонуклеотиды
Главный механизм, лежащий в основе функционирования системы антисмысловых РНК, прост и опирается на известный феномен взаимодействия двух комплементарных друг другу молекул нуклеиновых кислот с обр
Механизм действия антисмысловых РНК
Многочисленные исследования антисмысловых РНК как in vitro, так и in vivo показали, что конечным результатом их действия, как правило, является высокоспецифическое ослабление экспрессии генов, мРНК
Использование антисмысловых РНК
Получение фенокопий.Клетки или организмы, обладающие фенотипом мутантных клеток или организмов, сформировавшимся не вследствие мутаций, называют фенокопиями. Развитие техник
Влияние экспрессии антисмысловых РНК на фенотип трансгенных мышей
Гены-мишени
Длина micРНК, п.о.
Мишень в гене
Фенотип
Основной белок миелина
Экзоны
Природные антисмысловые РНК
За то время, которое прошло с момента открытия в середине 1970-х годов антисмысловых РНК и их успешного использования для искусственной регуляции экспрессии генов, стало ясно, что этот эффектный ге
Рибозимы и дезоксирибозимы
Регуляция экспрессии генов с помощью антисмысловых РНК характеризуется высокой специфичностью. Это обусловлено большой точностью процесса РНК-РНК-гибридизации, основанной на комплементарном взаимод
Типы рибозимов
Эндорибонуклеазная активность РНК была впервые обнаружена Т. Чехом в 1980 г. у интрона группы I предшественника рибосомной РНК Tetrahymena, осуществляющего аутокаталитическую реакцию сплайсинга (ау
Свойства рибозимов
Стабильность рибозимов в биологических жидкостях. Нестабильность РНК является одним из основных ограничений, препятствующих эффективному их использованию in vivo в качестве лекарст
Рибозимы как лекарственные средства
На основании результатов рассмотренных опытов, а также других накопленных знаний о рибозимах складывалось мнение о принципиальной возможности использования рибозимов для регуляции активности конкре
Дезоксирибозимы
В отличие от РНК, выполняющих в клетке разнообразные функции, благодаря возможностям формирования у этих макромолекул сложных пространственных структур, для внутриклеточных ДНК пока известна единст
Аптамеры
Аптамерами называют небольшие молекулы нуклеиновых кислот, которые могут выполнять функции высокоспецифичных рецепторов низкомолекулярных органических соединений. Олигонуклеотидные аптамеры
Молекулы РНК у истоков жизни
Большинство современных теорий происхождения жизни рассматривает молекулы РНК, обладающие активностями рибозимов, в качестве первичных самореплицирующихся молекул, давших начало развитию жизни на З
Молекулы РНК в качестве РНК-репликаз
Для первоначального появления рибозимов необходим абиотический синтез олигорибонуклеотидов длиной 30–70 оснований. Долгое время это требование было камнем преткновения в разработке теории происхожд
Возможность синтеза полипептидных цепей молекулами РНК
Вскоре после открытия рибозимов в литературе стала активно обсуждаться гипотеза о каталитической (а не только структурной) функции рРНК в рибосомах. Первые экспериментальные данные в пользу возможн
Способы получения трансгенных многоклеточных организмов
Многоклеточный организм высших животных и растений является продуктом онтогенетического развития, при котором из одной клетки (зиготы), образовавшейся в результате слияния двух половых клеток родит
Экспрессия трансгенов
Если трансгены в своем функционировании проявляют тканеспецифичность, то уровень их экспрессии зависит от места интеграции в хромосому. В тех редких случаях, когда экспрессия трансгена полностью от
Использование трансгенов у животных
Техника трансгеноза открывает практически безграничные, принципиально новые возможности исследования экспрессии генов. Ниже будут кратко рассмотрены четыре активно развиваемые направления использов
Исследование механизмов экспрессии генов
Как уже упоминалось выше, цис-действующие регуляторные последовательности нуклеотидов обеспечивают тканеспецифический характер экспрессии трансгенов. Этим свойством воспользовались для опред
Токсигены в исследовании дифференцировки соматических клеток в онтогенезе
Выше рассматривалась возможность применения гибридных токсинов для специфического воздействия на группы соматических клеток, обладающих определенными фенотипическими маркерами. Высокоспецифической
Изменение физиологического статуса лабораторных и сельскохозяйственных животных
Одними из первых указаний на возможность использования трансгеноза для изменения физиологических параметров и физической конституции организма животных были результаты работ по экспрессии трансгено
Моделирование наследственных и приобретенных заболеваний человека
Для разработки эффективных методов лечения наследственных и приобретенных заболеваний человека, а также для полного понимания их этиологии требуется моделирование соответствующих симптомов на лабор
Трансгенные растения
Способность к вегетативному размножению отличает организм растений от организма высших животных, что заметно облегчает осуществление трансгеноза. Многие клетки растений, например клетки зародыша на
Генотерапия наследственных и приобретенных заболеваний
Современные методы лечения наследственных и приобретенных заболеваний связаны с введением в организм больного недостающих продуктов метаболизма или с ограничением поступления их предшественников с
Способы доставки новых генов в геном человека
Ретровирусные векторы. Для доставки трансгенов в организм человека в целях генотерапии ретровирусные векторы используются наиболее широко и являются одним из наиболее эффективных с
Управление экспрессией трансгенов в клетках-мишенях
Для того чтобы терапевтическое действие трансгенов реализовывалось в полной мере, часто бывает необходимо обеспечивать их тканеспецифическую экспрессию в клетках-мишенях на протяжении всей жизни ин
Современные достижения генотерапии онкологических заболеваний
Несмотря на разработку множества новых лекарственных препаратов, направленных на лечение онкологических заболеваний, за последние 30 лет не удалось увеличить число пациентов, проживших более 5 лет
Ближайшие перспективы использования генотерапии
Какие же еще заболевания человека можно рассматривать в качестве ближайшей перспективы для генотерапии? Как упоминалось выше, ретинобластома (онкологическое заболевание, при котором поражаются заро
Успехи генотерапии в модельных экспериментах
В последнее время получены впечатляющие результаты и по коррекции дефектов на генном уровне с помощью направленного переноса генов в клетки мышей. Одним из таких примеров является успешная генотера
Проблемы, возникающие в связи с практическим применением генотерапии
Несмотря на впечатляющие успехи генотерапии на модельных животных, в настоящее время имеется ряд принципиальных затруднений, препятствующих широкому использованию метода для лечения заболеваний чел
Получение клинического генетического материала
Для проведения ПЦР используют ДНК клеток различных органов и тканей человека. Основными требованиями, предъявляемыми к такой ДНК, является отсутствие сильной ее деградации и повреждений химическими
Диагностика заболеваний
В процессе диагностики и исследования генетических механизмов наследственных заболеваний человека возникают две тесно связанные друг с другом задачи. На первом этапе исследований в ДНК из клиническ
ДНК-типирование
Результаты, полученные при исследовании структуры и организации геномной ДНК животных, растений и микроорганизмов, наложили глубокий отпечаток на методологию их систематизации. Проблема адекватного
ДНК-типирование микроорганизмов
Наиболее часто в настоящее время используют два способа ДНК-типирования патогенных микроорганизмов, в основе которых лежит метод ПЦР. В первом случае используют один или несколько коротких праймеро
Микроматрицы и микрочипы ДНК
Одним из интенсивно развивающихся направлений биотехнологии нуклеиновых кислот в последнее время становится использование микроматриц ДНК для анализа нуклеотидных последовательностей. В этой группе
Ограничения в использовании микроматриц ДНК
Помимо самой достаточно сложной технологии производства микроматриц, к числу факторов, ограничивающих их широкое применение, относятся кинетические параметры гибридизации, а также точность и чувств
Использование микроматриц ДНК в фундаментальных и прикладных исследованиях
Определение первичной структуры и картирование ДНК являются основными направлениями использования микроматриц олигонуклеотидов в настоящее время. Прямое секвенирование генов с помощью олигонуклеоти
Основные подходы к картированию генома человека
Решение основной задачи программы "Геном человека" включает три основных этапа. На первом этапе необходимо специфическим образом разделить каждую индивидуальную хромосому на части меньшег
Генетические карты сцепления
Генетические карты сцепления представляют собой одномерные схемы взаимного расположения генетических маркеров на индивидуальных хромосомах. Под генетическими маркерами понимают любые
Современные методы построения генетических карт сцепления
Метод
Число картированных локусов
Гибридизация соматических клеток
Гибридизация in situ
ПЦР в исследованиях генома человека
Полимеразная цепная реакция занимает центральное место в разработке подходов к практическому осуществлению программы "Геном человека". Как уже обсуждалось выше (раздел 7.1.3), с помощью П
Физические карты низкого разрешения
В отличие от рассмотренных выше генетических карт сцепления физические карты генома отражают реальное расстояние между маркерами, выражаемое в парах оснований. Физические карты различаются по степе
Определение полной первичной структуры ДНК генома человека
Исчерпывающая физическая карта генома человека (и любого другого организма) должна представлять собой полную последовательность нуклеотидов ДНК всех его хромосом. Благодаря тому, что к решению тако
Базы данных получаемой информации
Полное использование информации о структуре генома человека в биологии и медицине станет возможным лишь в отдаленном будущем. Еще долгие годы предстоит собирать и обрабатывать получаемую информацию
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Современная генетика находится на взлете. Новые факты обнаруживаются настолько быстро, что едва хватает времени на то, чтобы просто осознать их появление. Еще труднее уловить многочисленные связи м
Конечный результат экспрессии генов предопределен.
Будущее трансгеноза и генотерапии. Это будет. И совершенно безразлично - хотим мы этого или нет.
Большинство физиологических моделей, в кот
К главе 1
Георгиев Г.П. Гены высших организмов и их экспрессия. М.: Наука, 1989. 254 с.
Георгиев Г.П., Бакаев В.В. Три уровня структурной организации хромосом эукариот
К главе 2
Молекулярная биология: Структура и биосинтез нуклеиновых кислот / Под ред. А.С. Спирина. М.: Высш. шк. 1990. 352 с.
Спирин А.С. Молекулярная биология. Структура рибо
К главе 3
Жимулев И.Ф. Гетерохроматин и эффект положения гена. Новосибирск: Наука, 1993. 491 с.
Льюин Б. Гены. М.: Мир, 1987. 544 с.
Молекулярная биология: Стр
К главе 4
Bell S.P. Eukaryotic replicators and associated protein complexes // Curr. Opinion Genet. Develop. 1995. Vol. 5. P. 162–167.
Cesareni G., Heimer-Citterich M., Сas
К главе 5
Ауэрбах Ш. Проблемы мутагенеза. М.: Мир, 1978. 463 с.
DNA repair. A special issue. // Trends Biochem. Sci. 1995. Vol. 20. P. 381–440.
Friedberg E.C., Ger
К главе 7
Патрушев Л.И. Биосинтез белка в искусственных генетических системах // Проблема белка. М.: Наука, 1995. Т.1 Химическое строение белка. С. 354–478.
Рыбчин В.Н. Основы генетиче
К главе 8
Chang T.K., Jackson D.Y., Burnier J.P. et al. Subtiligase: a tool for semisynthesis of proteins // Proc. Nat. Acad. Sci. US. 1994. Vol. 91. P. 12544–12548.
Houghten R.A
К главе 9
Crooke S.T. Progress in antisense therapeutics // Med. Res. Rev. 1996. Vol. 16. P. 319–344.
Dolnick B.J. Naturally occurring antisense RNA // Pharmacol. Ther.
К главе 10
Свердлов Е.Д. Очерки современной молекулярной генетики по курсу лекций для студентов биологического факультета МГУ. Очерк 5. Трансгеноз и новая молекулярная генетика // Молек
К главе 11
Шагинян И.А., Гинцбург А.Л. ПЦР-генетическое типирование патогенных микроорганизмов // Генетика. 1995. Т. 31. С. 600–610.
Graber J.H., O'Donnell M.J., Smith C.L., Cantor C.R.
К главе 12
Benner S.A., Trabesinger N., Schreiber D. Past-genomic science: Converting primary structure into physiological function // Adv. Enzyme Regul. 1998. Vol. 38. P. 155–180.
Billings
Новости и инфо для студентов