Инициация биосинтеза белка эукариотическими рибосомами - раздел Медицина, Экспрессия генов Как Будет Видно Из Дальнейшего Изложения, Инициация Трансляции Эукариотически...
Как будет видно из дальнейшего изложения, инициация трансляции эукариотических мРНК может осуществляться, по крайней мере, тремя способами. В соответствии с первым наиболее распространенным механизмом (модель сканирования) рибосомы после взаимодействия с 5'-концевой последовательностью мРНК осуществляют поиск инициирующего AUG-кодона, перемещаясь вдоль 5'UTR. При реализации второго механизма рибосомы инициируют биосинтез белка на внутренних AUG-кодонах, удаленных от 5'-концевой кэп-группы. И, наконец, после освобождения полипептида из транслирующего комплекса рибосомы, не отделяясь от мРНК, способны реинициировать биосинтез белка на следующем инициирующем кодоне.
Факторы инициации трансляции. Большинство молекулярных механизмов, осуществляющих регуляцию экспрессии генов на уровне трансляции, реализуется на стадии инициации биосинтеза белка. По-видимому, этот факт находит свое отражение в большой сложности аппарата инициации трансляции. Помимо субъединиц эукариотических рибосом и белков, обычно ассоциированных с 5'- и 3'-концевыми последовательностями мРНК, в инициации принимают участие по меньшей мере 11 белковых факторов, построенных более чем из 25 полипептидов (табл. I.11).
Таблица I.11
Факторы инициации трансляции дрожжей S. cerevisiae
| Фактор
| Субъединица
| Предполагаемая функция
|
| eIF1
|
| Обеспечивает связывание Met-тРНК и мРНК с 40S субчастицей рибосом и распознавание инициирующего AUG-кодона (у животных)
|
| eIF1A
|
| Обеспечивает диссоциацию 40S–60S субчастиц рибосом, связывание Met-тРНК и распознавание инициирующего кодона (у животных)
|
| eIF2
| α, β, γ
| Участвует в выборе инициирующего кодона
|
| eIF2B
| α, β, γ, δ, ε
| Обеспечивает обмен гуанилового нуклеотида на eIF2
|
| eIF3
| α, β, γ, δ, ε, ζ, η, θ
| Обеспечивает связывание Met-тРНК и мРНК с 40S субчастицей и диссоциацию 40S–60S субчастиц рибосом
|
| eIF4A
|
| АТРаза, РНК-связывающая хеликаза
|
| eIF4B
|
| Хеликаза, облегчающая связывание РНК
|
| eIF4E
|
| Взаимодействует с кэп-группой мРНК
|
| eIF4G
| G1(p150), G2(p130)
| Взаимодействует с eIF3, eIF4E и Pab 1p
|
| eIF4H
|
| Стимулирует активность eIF4B и компонентов eIF4F
|
| eIF5
|
| Вызывает диссоциацию факторов инициации
|
| eIF5A
|
| Функции неизвестны, мутации изменяют стабильность мРНК
|
| eIF6
|
| Вызывает диссоциацию 40S–60S субчастиц рибосом
|
Учитывая сложность процесса инициации трансляции у эукариот, последовательность реакций, приводящих к образованию первой пептидной связи в строящемся полипептиде, удобно разбить на ряд последовательных этапов, что является сознательным упрощением единого процесса.
Взаимодействие мРНК с кэп-связывающим комплексом и рибосомами.Возможность вступления эукариотических мРНК в цикл трансляции как правило обеспечивается их 5'-концевыми кэп-структурами, с которыми взаимодействуют белки кэп-связывающего комплекса (CBC). Хотя основными компонентами CBC являются факторы инициации трансляции, его роль далеко не ограничивается участием в инициации синтеза белка рибосомами. Как уже обсуждалось в разделе 2.2.4, полифункциональные белки CBC интегрируют основные реакции метаболизма мРНК и их предшественников в эукариотических клетках, необходимые для осуществления эффективной регулируемой трансляции.
Взаимодействие eIF2 с Met-тРНК.Гетеротримерный фактор eIF2 обеспечивает взаимодействие рибосом с инициаторной Met-тРНК и мРНК in vitro. Гены всех трех субъединиц являются жизненно важными. В связанном с GTP состоянии eIF2 приобретает способность взаимодействовать с Met-тРНК с образованием тройного комплекса Met-тРНК–eIF2–GTP. Имеются данные, указывающие на участие фактора eIF2B в обмене GDP на GTP в комплексе eIF2–GDP. Неизвестна точная последовательность объединения тройного комплекса с рибосомой и мРНК. Большая часть имеющихся данных указывает на то, что взаимодействие тройного комплекса с 40S субчастицей рибосом предшествует образованию комплекса 40S-мРНК. Однако наличие феномена реинициации трансляции, при которой тройной комплекс входит в инициирующий комплекс с предсуществующим комплексом рибосома–мРНК, указывает на возможность осуществления этих событий в другой последовательности.
Формирование кэп-связывающего комплекса на мРНК. Сборка прединициационного комплекса на мРНК начинается со взаимодействия фактора eIF4E с кэп-группой мРНК. Это дает возможность объединения eIF4E и eIF4G с образованием многокомпонентного фактора eIF4F. В настоящее время не исключается возможность того, что объединение eIF4E и eIF4G предшествует взаимодействию первого с кэп-группой. У животных в состав многокомпонентного фактора eIF4F, кроме того, входит eIF4A, причем eIF4G удерживает два других фактора рядом друг с другом. Комплекс факторов eIF4F животных обладает двунаправленной ATP-зависимой РНК-хеликазной активностью, которая стимулируется фактором eIF4B. Недавно (1998 г.) обнаруженный фактор eIF4H усиливает активность eIF4F и eIF4B, однако его истинная роль в инициации трансляции остается невыясненной. Еще два белка дрожжей взаимодействуют с компонентами eIF4F: белок p20, конкурирующий с eIF4G за связывание eIF4E, а также поли(А)-связывающий белок Pab 1p, который контактирует со специфическим сайтом полипептидной цепи фактора eIF4G1. Функциональным аналогом p20 у млекопитающих является белок 4E-BP – ингибитор инициации трансляции.
Полипептидная цепь eIF4G млекопитающих содержит сайты связывания факторов eIF3, eIF4E и eIF4A. На этом основании делается вывод, что eIF4G в обоих системах выполняет функции белка-адаптера, обеспечивающего сборку комплекса eIF4F. Исключительно важная роль фактора eIF4E в регуляции экспрессии генов на уровне трансляции (и в канцерогенезе) будет рассмотрена в разделе 3.4.1.
Таким образом, взаимодействию малой субчастицы рибосом с мРНК предшествует серия высоко специфических белок–белковых и белково–нуклеиновых взаимодействий, приводящих к формированию белкового комплекса вокруг кэп-группы мРНК, в котором полипептидная цепь фактора eIF4G обладает сайтом связывания eIF3. Последний, в свою очередь, специфически взаимодействует с малой субчастицей рибосом, обеспечивая ее вхождение в прединициационный комплекс. При этом 40S субчастица ассоциирована с тройным комплексом Met-тРНК–eIF2–GTP, содержащим аминоацилированную инициаторную тРНКMet.
В итоге образуется прединициационный комплекс, содержащий мРНК, 40S субчастицу рибосом, связанную с тройным комплексом Met-тРНК–eIF2–GTP и через фактор eIF3 взаимодействующую с фактором eIF4G. Последний, в свою очередь, является частью многокомпонентного фактора eIF4F, в который кроме eIF4G входят eIF4E, взаимодействующий с кэп-группой мРНК, и eIF4A, обладающий РНК-хеликазной активностью. Кроме того, в состав этого комплекса входит фактор eIF1A. В таком виде прединициационный комплекс способен перемещаться вдоль 5'UTR мРНК и осуществлять поиск инициирующего AUG-кодона.
Роль 3'-концевой поли(А)-последовательности мРНК в инициации трансляции. Помимо вышеупомянутых сайтов белок–белковых взаимодействий, N-концевая часть полипептидной цепи дрожжевого eIF4G содержит участок, взаимодействующий с поли(А)-связывающим белком Pab1p. Другим указанием на участие 3'-концевой поли(А)-последовательности мРНК в трансляции является наличие мутаций в генах рибосомных белков 60S субчастицы, супрессирующих мутации в гене pab1. Кроме того, как будет видно из дальнейшего изложения, 3'-концевая поли(А)-последовательность мРНК может обеспечивать кэп-независимую инициацию трансляции. Данные такого рода указывают на возможную ключевую роль этой последовательности в инициации синтеза белка, однако механизм данного явления остается неизвестным.
Выбор точки инициации трансляции и инициация биосинтеза белка. Сформировавшись, прединициационный комплекс должен оказаться на инициирующем AUG-кодоне мРНК, в ряде случаев весьма удаленном от кэп-группы, с которой он первоначально взаимодействует. Рибосомы прокариот локализуют точку инициации биосинтеза белка путем непосредственного взаимодействия регуляторных элементов 5'UTR их мРНК (таких, как SD-последовательность), расположенных в области инициации трансляции TIR (translation initiation region), с 3'-концевой последовательностью 16S рРНК малой субчастицы рибосом. В эукариотической клетке не обнаружено подобных взаимодействий между мРНК и рРНК. Одной из наиболее популярных в настоящее время моделей поиска эукариотической рибосомой точки инициации трансляции является модель сканирования, в соответствии с которой прединициационный комплекс перемещается вдоль 5'UTR до первого специфически распознаваемого им инициирующего кодона.
Модель сканирующей рибосомы. Как следует из модели сканирования, сформированный прединициационный комплекс перемещается от кэп-группы мРНК вдоль 5'UTR, "проверяя" ее последовательность на наличие инициирующего AUG-кодона. В настоящее время отсутствуют твердые доказательства того, что сканирование является строго однонаправленным. Из-за отсутствия в мРНК эукариот SD-подобных последовательностей и соответствующих контактов с рРНК AUG-кодон распознается в результате кодон–антикодонового взаимодействия с участием Met-тРНК, входящей в состав прединициационного комплекса. Перемещение комплекса часто должно происходить на фоне ярко выраженной вторичной структуры лидерной последовательности мРНК. В этой связи предполагается, что происходящее во время сканирования расщепление ATP сопряжено с работой РНК-хеликазы, разрушающей вторичную структуру 5'UTR. Как уже упоминалось, данная активность ассоциирована с фактором eIF4A, входящим в состав прединициационного комплекса, и стимулируется фактором eIF4B. Однако роль этих факторов, по-видимому, не ограничивается разрушением вторичной структуры лидера, поскольку их присутствие требуется и для инициации синтеза белка на мРНК с короткими 5'UTR, не обладающими выраженной вторичной структурой.
В выборе AUG-кодона у эукариот участвует фактор eIF2. На это указывает тот факт, что его мутационные повреждения сопровождаются ослаблением специфичности такого выбора. Неожиданными оказались недавно полученные результаты, подчеркивающие важную роль фактора eIF5 в распознавании инициирующего кодона прединициационным комплексом. Не исключено, что этот фактор определяет точность процесса распознавания AUG и является функциональным аналогом прокариотического фактора IF3. Описаны мутантные формы eIF5, в присутствии которых in vivo в качестве инициирующего узнается кодон UUG. Не исключено, что совместное действие факторов eIF2 и eIF5 в обеспечении точности выбора инициирующего кодона становится возможным благодаря наличию на ß-субъединице eIF2 сайта связывания eIF5.
После локализации инициирующего кодона 40S субчастицей она приобретает способность объединяться с большой 60S субчастицей рибосом при участии фактора eIF5, что в конечном итоге приводит к образованию полноценного инициационного комплекса. В это время происходит отделение от комплекса ряда факторов инициации трансляции, сопряженное с гидролизом GTP. Прежде всего, освобождается комплекс eIF2–GDP, а также большинство остальных факторов инициации, включая eIF1A и eIF3. В таком виде при наличии соответствующей аминоацил-тРНК инициационный комплекс способен образовывать первую пептидную связь в строящейся полипептидной цепи, т.е. инициировать синтез белка.
Контекст и приоритеты инициирующих AUG-кодонов. Последовательности, окружающие инициирующие AUG-кодоны, оказывают сильное влияние на эффективность инициации трансляции у позвоночных и в значительно меньшей степени у дрожжей. В последнем случае наиболее благоприятным для инициации трансляции является нуклеотид A в положении –3 по отношению к AUG (нуклеотид A в AUG-кодоне находится в положении +1), замена которого на любой другой нуклеотид снижает эффективность инициации приблизительно в два раза. Вообще, A-богатые последовательности, предшествующие AUG, характерны для мРНК дрожжей, что отличает их от мРНК позвоночных, соответствующие области мРНК которых сильнее обогащены GC. Это объясняют высокой чувствительностью аппарата трансляции дрожжей к вторичной структуре 5'UTR их мРНК, которая при наличии GC-пар была бы более прочной. В следующих за AUG последовательностях мРНК дрожжей не обнаружено предпочтения в отношении A, и они, как правило, обогащены пиримидиновыми нуклеотидами.
Оптимальный контекст для инициации трансляции в клетках животных и растений, по-видимому, один и тот же: AACAATGGC. Самыми важными для инициации в обоих случаях являются пурин в положении –3 и G в положении +4. В клетках животных на эффективность трансляции мРНК оказывают влияние также нуклеотиды в положениях +5 и +6. Инициирующие кодоны в контексте, отличающемся от оптимального, узнаются рибосомами менее эффективно и допускают их прохождение до следующего инициирующего кодона. Это явление, обнаруженное в клетках животных и растений, получило название ослабленного сканирования (leaky scanning). Некоторые примеры реализации механизма ослабленного сканирования будут рассмотрены в разделе 3.4.1 (см. рис. I.40,а–в) в связи с особенностями инициации трансляции у вирусов растений.
Другим важным фактором, определяющим выбор AUG-кодона в качестве инициирующего, является его положение в 5'UTR. Как правило, ближайший к 5'-концу мРНК AUG предпочтительно используется для инициации трансляции. Это объясняют преимущественным перемещением сканирующей рибосомы в направлении 5'→3'. Многие 5'UTR содержат дополнительные AUG, не принадлежащие к основным ОРС, а также короткие ОРС (uAUG, uORF) перед основным инициирующим кодоном. И те и другие обычно оказывают ингибирующее действие на трансляцию соответствующих мРНК. Ингибирующий эффект является наиболее сильным, если расстояние первого uAUG от 5'-конца мРНК меньше 15–20 нуклеотидов. Наличие двух следующих друг за другом AUG-кодонов может сопровождаться их использованием в качестве альтернативных сайтов инициации трансляции. В этом случае одна и та же мРНК может направлять синтез двух полипептидов, различающихся лидерными пептидами, что, в свою очередь, может определять направление их внутриклеточного транспорта.
Распознавание инициирующих кодонов в процессе инициации трансляции может сопровождаться продолжительными паузами в дальнейшем перемещении рибосом вдоль мРНК при ее сканировании.
Инициирующие кодоны, отличающиеся от AUG.Трансляция в клетках млекопитающих и насекомых может начинаться на кодонах, которые отличаются от канонического AUG. В природных мРНК в качестве альтернативного инициирующего кодона чаще всего встречается CUG и значительно реже – AUC и ACG. В клетках дрожжей любые не-AUG-кодоны распознаются очень неэффективно. Эффективность может быть повышена мутациями в субъединицах фактора eIF2 b и g. Кодон AUU обычно открывает первую ОРС у некоторых вирусов растений. В этом случае эффективность инициации трансляции составляет ~ 10% от эффективности на каноническом кодоне AUG, который располагается ниже первого. Таким образом, использование вирусами на одной матрице неканонического и канонического кодонов является одним из регуляторных механизмов, контролирующих соотношение синтезирующихся полипептидных цепей на уровне трансляции позволяющих рибосоме достичь в процессе сканирования второго инициирующего кодона и инициировать на нем синтез белка.
У млекопитающих вышерасположенный неканонический инициирующий кодон также, как правило, сопровождается каноническим кодоном. При этом дополнительная инициация трансляции на неканоническом кодоне чаще всего характерна для ОРС, кодирующих регуляторные белки. Образование по такому механизму полипептидных цепей, удлиненных с N-концевой части, приводит к появлению у них новой регуляторной активности, а сам процесс инициации на неканоническом кодоне может контролироваться условиями внутри клетки.
Влияние вторичной структуры мРНК на инициацию трансляции. Вторичные структуры в 5'UTR мешают сканированию мРНК 40S субчастицами рибосом. Уровень ингибирования инициации трансляции зависит от положения таких структур относительно 5'-конца матрицы. Например, в лизатах ретикулоцитов кроликов структура типа стебель–петля со стабильностью –30 ккал/моль ингибирует инициацию трансляции, если расположена в непосредственной близости от кэп-структуры и не замечается рибосомами при удалении от 5'-конца более чем на 52 нуклеотида. В последнем случае у сканирующего прединициационного комплекса хватает энергии для разрушения этой структуры 5'UTR, но он не может быть собран при наличии шпильки, расположенной в непосредственной близости от кэп-структуры. Тем не менее, шпильки, удаленные от 5'-конца мРНК, могут подавлять трансляцию более чем на 85%, если их стабильность превышает –50 ккал/моль.
Интересно отметить, что структуры типа стебель–петля, образованные вслед за инициирующим AUG-кодоном, могут повышать эффективность инициации трансляции. Полагают, что такие структуры вызывают задержку сканирующего комплекса на инициирующем кодоне, что повышает вероятность его правильного распознавания. Например, элемент вторичной структуры, локализованный на 14 нуклеотидов ниже инициирующего кодона, оказывает стимулирующее влияние на распознавание слабых AUG-кодонов, а также инициирующих кодонов, отличающихся от AUG.
Шунтирование при сканировании мРНК. У некоторых вирусов растений, в частности при трансляции 35S РНК вируса мозаики цветной капусты (CaMV), содержащей лидерную последовательность, в процессе инициации имеет место модифицированное сканирование, получившее название рибосомного шунта (см. рис. I.40,г). По этому механизму сканирующие рибосомы могут непосредственно переноситься из донорного в акцепторный сайт на РНК, избегая линейного сканирования расположенной между ними последовательности нуклеотидов. Такое явление было исследовано на искусственных матрицах, содержащих между донорным и акцепторным сайтами последовательности нуклеотидов, образующих интенсивную вторичную структуру. При этом в отсутствие функционирования шунта последовательности обладали ингибирующим действием, точно предсказываемым на основании модели сканирования. Интересно, что шунтирование внутренних последовательностей сканирующими рибосомами может происходить, хотя и с меньшей эффективностью, и in trans, т.е. в условиях, когда донорный и акцепторный сайты располагаются на разных молекулах РНК. Механизмы, лежащие в основе шунтирования, в настоящее время до конца не изучены. Полагают, что ключевую роль в этом могут играть специфические взаимодействия участков РНК, расположенных на больших расстояниях друг от друга. Механизм шунтирования обнаружен при трансляции РНК вируса Сендай, тройной лидерной последовательности аденовирусов, а также у паповавирусов.
Реинициация трансляции. В отличие от прокариотических, мРНК эукариот, как правило, моноцистронны, т.е. содержат только одну основную ОРС. Однако как уже упоминалось выше, часто 5'UTR эукариотических мРНК содержат короткие ОРС. Например, у дрожжей известно несколько сотен видов таких мРНК, и они содержат от одной до шести коротких ОРС, часть из которых может перекрываться. То же самое характерно для мРНК животных. Несмотря на свои малые размеры, короткие ОРС способны обеспечивать инициацию, терминацию и реинициацию трансляции рибосомами эукариот.
Короткие ОРС эукариот играют важную роль в регуляции экспрессии генов на уровне трансляции, о чем подробнее будет говориться в разделе 3.4. Здесь же хочется отметить, что по функциональному признаку короткие ОРС разделяются на две группы: в одних случаях регуляторные функции коротких ОРС не зависят от их кодирующего потенциала, тогда как другие ОРС реализуют свои регуляторные возможности через кодируемые ими пептиды.
В том случае, если короткие ОРС следуют в мРНК друг за другом, рибосомы после завершения трансляции одной из них могут реинициировать синтез белка на следующем инициирующем кодоне. Как и в случае прокариотической трансляции, эффективность реинициации у эукариот в большой степени зависит от расстояния между терминирующим и инициирующим кодоном, а также от нуклеотидного контекста, в котором находится инициирующий кодон.
Инициация на внутренних AUG-кодонах. Третья возможность инициации трансляции у эукариот основана на прямом вхождении рибосом в цикл трансляции независимо от кэп-структур и лидерных последовательностей мРНК при прямом участии их IRES-последовательностей (internal ribosome entry site). В отличие от классической инициации трансляции у прокариот на внутренних AUG-кодонах полицистронных мРНК, обеспечиваемой последовательностями TIR, IRES-опосредованная инициация происходит не на полицистронных мРНК в обычном смысле, т.е. содержащих последовательности нескольких структурных генов. В этой связи полагают, что основная физиологическая роль инициации трансляции на внутренних AUG-кодонах эукариот заключается в предоставлении некоторым ОРС возможности транслироваться, минуя основной кэп-зависимый механизм инициации. Например, во время вирусной инфекции протеиназа пикорнавирусов отщепляет от полипептидной цепи клеточного фактора eIFG N-концевой пептид, содержащий сайт связывания фактора eIF4E – основного кэп-связывающего белка эукариот. При этом C-концевая часть такого модифицированного фактора сохраняет сайты связывания факторов eIF3 и eIF4A. В результате происходит (неполное) переключение с кэп-зависимой трансляции мРНК клетки-хозяина на кэп-независимую трансляцию вирусных мРНК, опосредованную IRES-последовательностями вирусов.
Все темы данного раздела:
ЧАСТЬ I. МЕХАНИЗМЫ ХРАНЕНИЯ И РЕАЛИЗАЦИИ ГЕНЕТИЧЕСКОЙ ИНФОРМАЦИИ
ВВЕДЕНИЕ
Организм. Живой организм представляет собой самовоспроизводящуюся, открытую термодинамическую систему, в которой пути превращения вещества и э
Средний размер гаплоидного генома у некоторых групп организмов
Группы организмов
Средний размер генома, п.о.
Мелкие вирусы
1,0·104
Микоплазмы
1,6·1
Гены и хромосомы
Генетическая информация о структуре отдельных белков и нуклеиновых кислот у всех организмов заключена в молекулах ДНК или РНК в виде последовательностей нуклеотидов, называемых генами
Геном прокариот
Как уже было упомянуто выше, основной чертой молекулярной организации прокариот является отсутствие в их клетках (или вирионах – вирусных частицах, в случае вирусов) ядра, отгороженного ядер
Геном вирусов
По определению Х. Френкель-Конрата, "вирусы – это частицы, состоящие из одной или нескольких молекул ДНК или РНК, обычно (но не всегда) окруженных белковой оболочкой; вирусы способны передават
Геном архебактерий
Царство архебактерий представляет собой своеобразную и наименее изученную таксономическую группу прокариот. Хотя по своей морфологии Archeabacteria похожи на привычные эубактерии, на молекулярном у
Минимальный размер генома одноклеточных организмов
Определение минимального размера генома, обеспечивающего все необходимые функции, которые позволяют одноклеточному организму существовать в определенных экологических условиях, не является праздным
Геном эукариот
Как уже упоминалось выше, в отличие от прокариот основная часть генома эукариот находится в специальном клеточном компартменте (органелле), получившем название ядра, а значи
Последовательности нуклеотидов эукариотического генома
Геном эукариот составляют уникальные и повторяющиеся последовательности нуклеотидов. Содержание уникальных последовательностей в геноме, определенное на основании кинетики реассоциации фрагментиров
Хроматин
Хроматином называют сложную смесь веществ, из которых построены хромосомы эукариот. Основными компонентами хроматина являются ДНК, гистоны и негистоновые белки, образующие высо
Свойства гистонов животных
Гистон
Размер полипептида
(число аминокислот)
Локализация и типы посттрансляционных модификаций
Вся мол
Роль ДНК-топоизомераз в обеспечении структуры и функционирования хроматина
Топоизомеразы контролируют в клетках уровень суперскрученности ДНК, который может изменяться в процессе ее репликации, транскрипции, гомологичной рекомбинации, а также во время перестроек хроматина
Транскрипция
В процессе транскрипции генов происходит биосинтез молекул РНК, комплементарных одной из цепей матричной ДНК, сопровождаемый полимеризацией четырех рибонуклеозидтрифосфатов (ATP, GTP, CTP и UTP) с
ДНК-зависимые РНК-полимеразы
В соответствии с субъединичным составом РНК-полимеразы подразделяются на две группы. К первой группе относятся ферменты, состоящие только из одной субъединицы, среди них – РНК-полимеразы митохондри
РНК-полимеразы II дрожжей
Компонент
Характеристика
Pol II
РНК-Полимеразная активность, взаимодействует с множеством общих и тканеспецифических факторов транск
Единицы транскрипции (транскриптоны)
Синтез РНК молекулами РНК-полимераз in vivo начинается в определенных местах ДНК, называемых промоторами, и завершается на особых регуляторных последовательностях – терминаторах. Посл
Этапы транскрипции
Процесс транскрипции в настоящее время принято подразделять на 4 основные стадии: 1) связывание молекул РНК-полимеразы с ДНК и распознавание промотора; 2) инициация; 3) элонгация; 4)
Субъединичный состав и характеристика основных факторов транскрипции (GTF) РНК-полимеразы II человека
Фактор
(GTF)
Молекулярные массы субъединиц (кДа) и их обозначение
Характеристика
TFIIA
37 (a)
19
Основные факторы элонгации РНК-полимеразы II
Фактор
Структура
Молекулярная масса полипептидов, кДа
Функция
P-TEFb
Гетеродимер
124, 43
Хроматин во время транскрипции
В эукариотических клетках матрицей для РНК-полимераз служит ДНК, находящаяся в составе хроматина. Из общих соображений белки нуклеосом и более высокоорганизованного хроматина должны быть препятстви
Котранскрипционные и посттранскрипционные модификации РНК
Транскрипция у любого организма является первым этапом реализации генетической информации – экспрессии генов. Однако первичные транскрипты, как правило, представляют собой лишь предшественники зрел
Процессинг РНК у бактерий
мРНК прокариот обычно являются полицистронными, т.е. включают в себя последовательности нуклеотидов нескольких генов одного оперона (рис. I.10,а). Полицистронные мРНК бактерий при выполнении
Редактирование пре-мРНК
Недавно появились сообщения о новых механизмах изменения кодирующего потенциала мРНК на посттранскрипционном уровне, названных редактированием РНК (editing). Оказалось, что в клетках многих
Различные способы редактирования мРНК
Объект
Модифицированные или добавленные нуклеотиды
Митохондрии трипаносом
AAUUUAUGUUGUCUUU
Митохондрии P. po
Редактирование РНК у животных и их вирусов
Организм, ткань
Локализация
РНК-субстрат
Последствия редактирования
Печень/кишечник крыс
Ядро
Другие модификации эукариотических мРНК
Посттранскрипционные модификации предшественников эукариотических мРНК по сравнению с теми же изменениями первичных транскриптов прокариот более разнообразны и играют большую роль в регуляции экспр
Сравнение полиаденилирования мРНК у эукариот и прокариот
Функции
Млекопитающие
E. coli
Длина поли(А)-последовательностей, нт
80–200
14–60
У
Интронов группы I
Аутосплайсинг
Обратное лигирование
GTPOH
+
[Экзон 1]upA-Интрон-Gpa[Экзон 2]
↓
Кэп-связывающий комплекс в роли фактора, сопрягающего основные реакции метаболизма транскриптов РНК-полимеразы II
РНК не может находиться in vivo в свободном виде. На протяжении всего внутриклеточного существования – от инициации биосинтеза до полной деградации – РНК пребывает в составе рибонуклеопротеиновых к
Функциональная компартментализация ядра
При рассмотрении механизмов реализации генетической информации на уровне транскрипции и посттранскрипционных модификаций РНК чаще всего не принимается во внимание пространственная внутриклеточная о
Интерфазные хромосомы в ядре
В разделе 1.3 уже кратко обсуждался петельно-доменный уровень структурной организации хромосом эукариот, который отражает разделение интерфазных хромосом на дискретные домены по функциональному при
Ядрышко
Структурно-функциональная организация ядрышка (nucleolus) еще более наглядно иллюстрирует концепцию функциональной компартментализации ядра эукариотических клеток. В этой части ядра происход
Пространственная организация синтеза мРНК
Внутриядерный синтез мРНК и доставка зрелых транскриптов к месту их трансляции требуют участия множества тонко сбалансированных во времени, пространственно организованных молекулярных механизмов. В
Ядерные тельца и домены
Исследования структурно-функцональных отношений в ядре в связи с компартментализацией транскрипции, процессинга РНК и репликации продемонстрировали наличие особых функций у многих морфологически ра
Компартментализованное ядро
Два основных структурных образования характерны для ядер всех эукариот. Это, во-первых, оболочка ядра с ядерными порами, связанная с ядерной ламиной (электронно-плотный слой, прилегающий к я
Биосинтез белка рибосомами бактерий
В процесс биосинтеза белка рибосомами, называемого трансляцией, вовлечено множество макромолекул и макромолекулярных комплексов. На этом этапе реализации генетической информации происходит с
Рибосомы
Рибосомы представляют собой крупный рибонуклеопротеидный комплекс с молекулярной массой ~ 2,5 мДа, состоящий из рибосомных белков, молекул рРНК и ассоциированных с ними факторов трансляции. Рибосом
Этапы биосинтеза белка
Хотя построение первых моделей механизмов биосинтеза белка было начато еще в начале 1960-х гг., полное описание процесса трансляции далеко до завершения и в настоящее время. Ниже будут кратко рассм
Антибиотики, действующие на уровне трансляции
На рис. I.21 приведены некоторые широко распространенные антибиотики, являющиеся ингибиторами биосинтеза белка у бактерий. Многие из них находят применение не только как лекарственные средства, но
Трансляция у эукариот
Бактерии обладают единственной универсальной системой трансляции, основные механизмы функционирования которой были кратко рассмотрены выше. В отличие от этого, клетки животных кроме основной систем
Особенности первичной структуры эукариотических мРНК
Зрелая мРНК эукариот наряду с основной последовательностью нуклеотидов, в которой закодирована информация о последовательности аминокислот в соответствующем белке, содержит целый ряд некодирующих п
Элонгация полипептидных цепей
Элонгация полипептидных цепей в ходе эукариотической трансляции традиционно пользовалась меньшим вниманием исследователей по сравнению с инициацией, поскольку считалось, что ее механизмы в основных
Терминация трансляции
В эукариотических белоксинтезирующих системах терминация трансляции, как и у бактерий, контролируется специфическими рилизинг-факторами. Однако у эукариот эти факторы менее разнообразны. В частност
Трансляция в митохондриях
Митохондрии являются органеллами эукариотических клеток, в которых в результате окислительного фосфорилирования энергия химических связей, освобождающаяся при метаболизме, накапливается в виде энер
Трансляция в хлоропластах.
Хлоропласты являются органеллами клеток растений, осуществляющих процесс фотосинтеза – преобразование энергии квантов света в энергию макроэргических связей ATP. Так же как и митохондрии, хлороплас
Регуляция экспрессии генов на уровне транскрипции у прокариот
Регуляция транскрипции в клетках осуществляется на уровне индивидуальных генов, их блоков и даже целых хромосом. Возможность управления многими генами, как правило, обеспечивается наличием у них об
Регуляция на уровне инициации транскрипции
Активность многих генов прокариот регулируется с помощью белковых факторов, взаимодействующих с регуляторными участками промоторов генов. При этом происходят как активация транскрипции генов, так и
Регуляция синтеза РНК на уровне элонгации и терминации
Выше было отмечено, что РНК-полимераза в процессе элонгации цепей РНК перемещается неравномерно вдоль матричной ДНК и во время ее движения имеют место остановки (паузы). Время задержки молекул РНК-
Регуляция экспрессии генов на уровне транскрипции у эукариот
Несмотря на то что основные принципы регуляции транскрипции генов у прокариотических и эукариотических организмов остаются неизменными – через специфические взаимодействия белков и нуклеиновых кисл
Передача сигнала и вторичные мессенджеры
Жизнь любой клетки, включая глобальные процессы ее роста, деления и даже гибели, зависит от внешних регуляторных сигналов, которые она воспринимает. Такими сигналами могут быть физические воздейств
Рецепторы мембран, осуществляющие трансмембранный перенос сигнала
Класс рецепторов
Четвертичная структура
Система переноса сигнала
Лиганд
1. Олигомеры, окружающие каналы:
а) активируе
Механизмы позитивной регуляции транскрипции
При обсуждении механизмов внутриклеточной передачи сигнала были упомянуты регуляторные белки, взаимодействующие со специфическими последовательностями нуклеотидов генов и получившие название фактор
Функциональные домены факторов транскрипции
Домен
Функция
Факторы, содержащие домен
Примечание
Механизмы негативной регуляции транскрипции
Позитивный контроль транскрипции у эукариот, в котором участвуют многочисленные активаторы транскрипции, играет ключевую роль в регуляции экспрессии их генов на уровне транскрипции. Однако негативн
Импринтинг
Другим характерным примером регуляции экспрессии генов, приводящей к эпигенетическому наследованию признаков, является уже упомянутый выше импринтинг, при котором специфический характер дифференциа
Метилирование ДНК в регуляции транскрипции
Единственной известной генетически запрограммированной ковалентной модификацией ДНК у высших эукариот является метилирование остатков цитозина в положении 5 с образованием 5-метилцитозина (5-mC). Э
Направленный транспорт, внутриклеточная локализация и депонирование мРНК
По завершении регулируемого синтеза РНК в процессе транскрипции она должна быть доставлена к месту трансляции, где сценарий координированной экспрессии генов получает свое дальнейшее развитие. При
Сплайсинг РНК в регуляции экспрессии генов
Разнообразные механизмы процессинга РНК в клетках были уже рассмотрены выше. Как оказалось, созревание мРНК играет важную роль и в регуляции экспрессии тех генов, транскриптами которых эти РНК явля
Избирательная деградация мРНК
Время полужизни мРНК в клетках является важным фактором регуляции экспрессии генов. Феномен деградации мРНК как регуляторного явления впервые обнаружен у бактерий на заре развития молекулярной гене
Регуляция экспрессии генов на уровне трансляции
В процесс биосинтеза белка рибосомами вовлекается большое количество мРНК, экипированных разнообразными регуляторными элементами. Даже в случае клеток дрожжей количество транслируемых видов мРНК пр
Регуляция инициации трансляции
Инициация, т.е. сборка компонентов системы трансляции на 5'-конце мРНК, завершающаяся образованием первой пептидной связи, является важнейшей точкой приложения регуляторных воздействий на уровне тр
Регуляция элонгации синтеза полипептидных цепей
При обсуждении механизмов элонгации цепей РНК в процессе транскрипции была отмечена неравномерность прочитывания матричной ДНК РНК-полимеразами. То же самое наблюдается и во время элонгации растущи
Регуляция терминации трансляции
Альтернативные сайты терминации трансляции могут быть использованы для расширения кодирующего потенциала определенных генов. Выше уже был рассмотрен пример, в котором в результате редактирования РН
Синтез белков, содержащих остатки селеноцистеина
С помощью своеобразного механизма осуществляется передача генетической информации от генов к полипептидным цепям селенопротеинов с необычным аминокислотным остатком – селеноцистеином, входящим в их
Посттрансляционная регуляция экспрессии генов
Синтезом полноценного полипептида в результате трансляции кодирующей его мРНК рибосомами обычно завершается процесс передачи генетической информации от генов к белкам как у бактерий, так и у высших
Последствия фолдинга вновь синтезированных полипептидных цепей
В процессе трансляции растущие полипептидные цепи начинают приобретать высокоспецифическую пространственную структуру, которая формируется полностью вскоре после завершения их биосинтеза. Процесс с
Специфические протеиназы в посттрансляционном процессинге белков
Одним из характерных примеров специфического действия протеиназ является активация предшественников (зимогенов) протеолитических ферментов (трипсина и химотрипсина) после их переноса от места синте
Убиквитин-зависимая система протеолиза в регулируемой деградации белков
Убиквитин-зависимая система протеолиза проводит поиск потенциальной мишени для протеолитической деградации среди огромного числа внутриклеточных белков. Все белки несут в себе специфические сигналы
Сплайсинг белков
Феномен сплайсинга белков, обнаруженный в 1990 г. в группой Т.Стивенса, пошатнул еще один постулат молекулярной биологии, в соответствии с которым последовательности нуклеотидов зрелых мРНК всегда
Другие посттрансляционные модификации белков
Многие белки и секретируемые пептиды претерпевают различные структурные изменения в результате котрансляционных и посттрансляционных модификаций, т.е. во время или после завершения их синтеза рибос
Репликация ДНК
Репликация ДНК происходит в соответствии с правилами Уотсона–Крика и наряду с биосинтезом РНК и белков является еще одним примером матричного синтеза биологических макромолекул. Во время репликации
Белки, входящие в состав репликативных комплексов прокариотических и эукариотических организмов
Белки в организмах
Функции компонентов комплексов
E. coli
Фаг Т4
Вирус SV40 / человек
DnaB
Репликативная вилка E. coli и бактериофага T4
Во время редупликации ДНК ее дочерние синтезирующиеся цепи расходятся из точки репликации, образуя Y-подобную структуру, называемую репликативной вилкой. Именно в окрестностях этой точки раз
Особенности функционирования репликативной вилки эукариот
Механизмы репликации ДНК у высших эукариот менее изучены из-за их большей сложности. Основные результаты получены на модельной системе с ДНК вируса SV40, в которой процесс репликации исследовали в
Эукариотические ДНК-полимеразы и их функциональные гомологи у прокариот
ДНК-полимераза
Ген дрожжей
Гомолог E. coli
Молекулярные массы субъединиц, кДа
Биологические функции
a
Регуляция репликации ДНК
Подробное рассмотрение молекулярных механизмов регуляции репликации ДНК выходит за рамки книги, поэтому ограничимся несколькими замечаниями по данному вопросу и более детально обсудим лишь механизм
Инициация репликации ДНК у E. coli и ее регуляция
Репликация хромосомной ДНК у бактерий играет ключевую роль в их жизненном цикле. В ходе этого процесса микроорганизмы редуплицируют свой геном, а образовавшиеся дочерние геномы далее переходят в до
Регуляция репликации плазмиды ColE1
Многие клетки прокариот в дополнение к основной хромосоме содержат небольшие внехромосомные ДНК, называемые плазмидами. Плазмиды, размеры которых варьируют от нескольких тысяч до сотен тысяч
Особенности репликации линейных геномов
Кольцевые замкнутые геномы характерны для многих бактерий, их плазмид и некоторых вирусов. У подавляющего большинства других организмов геном представлен линейными молекулами ДНК в составе одной ил
Линейные хромосомы бактерий
Афоризм Жака Моно: "То, что верно для E. coli, – верно и для других бактерий (слона)" получил широкое распространение. К счастью, на деле все обстоит не так скучно. До недавнего времени о
Репликаторы эукариот
Хромосомы эукариот содержат линейные молекулы ДНК, а следовательно, остаются все те же проблемы, связанные с их репликацией, которые обсуждались в связи с воспроизводством линейных хромосом бактери
Репликация теломерных участков эукариотических хромосом
Исследование механизмов репликации теломерных участков эукариотических хромосом показало, что они принципиально отличаются от механизмов репликации центральных областей ДНК. Изучение этих механизмо
Пространственная организация синтеза ДНК у эукариот
Пространственная организация репликативного синтеза ДНК у эукариот является одним из наиболее ярких примеров внутриядерной компартментализации генетических процессов. Анализ локализации мест синтез
Мутации
Мутации – это наследуемые изменения структуры генома. Поскольку основу любого генома составляют нуклеиновые кислоты – ДНК или РНК, то под действием мутаций происходит, прежде всего, изменение струк
Основные источники мутаций и методы определения мутагенной активности
В основе мутаций на молекулярном уровне лежат две основные причины: ошибки репликации и мутагенные воздействия различной природы. Ошибки репликации возникают из-за того, что точность функционирован
Метаболиты нормальной микрофлоры человека, обладающие мутагенной и канцерогенной активностями
Соединение
Метаболит
Тип активности
Метионин
Этионин
К
SOS-мутагенез у бактерий
Образование мутаций в клетках организма, подвергнутого мутагенному воздействию, происходит в основном по одному и тому же механизму. При прохождении репликативного комплекса через некодирующий или
Мутаторный фенотип
Несмотря на обилие эндогенных и экзогенных мутагенов, лишь небольшая часть их взаимодействий с ДНК завершается образованием мутаций. Для того чтобы исходное повреждение ДНК в виде аддукта, апуринов
Экспансия ДНК
Под экспансией ДНК понимают увеличение числа копий коротких повторяющихся последовательностей нуклеотидов внутри кластера при передаче генетической информации от родителей потомкам. В настоящее вре
Адаптивные мутации
Проблема, связанная с возможностью возникновения адаптивных мутаций, имеет глубокие корни в биологии. За 50 лет до того как Ч. Дарвин начал свои знаменитые исследования происхождения биологических
Механизмы защиты генома от мутаций
Несмотря на то что иногда мутации помогают организму выжить, подавляющее большинство мутационных изменений генома нежелательно и сопровождается развитием различных патологических состояний мутантно
Репарация ДНК
Большая группа молекулярно-генетических явлений, известная в настоящее время под общим названием "репарация повреждений ДНК", была осознана как отдельный и очень важный биологический фено
Эксцизионная репарация в клетках животных
Эксцизионная репарация ДНК путем удаления поврежденных азотистых оснований (BER). Система BER вызывает защиту геномной ДНК от повреждений, вызываемых главным образом алкилирующими
ДНК-гликозилазы и эндонуклеазы клеток микроорганизмов и человека, участвующие в BER
Фермент
Источник
Ген
Субстрат (см. рис. I.57)
Урацил-ДНК-гликозилаза
E. coli
S. cerevisiae
Человек
Белки животных, участвующие в NER
Белковая система
Белки системы
Ферментативная активность
Функция в репарации
XPA
XPA (p31)
Св
Гомологичная рекомбинация в репарации ДНК
Давно известно, что быстро делящиеся бактериальные клетки, содержащие несколько репликонов, образованных недореплицированными хромосомами (см. введение к разделу 4.2), более устойчивы к действию ио
Репарация ошибочно спаренных нуклеотидов
Система, осуществляющая репарацию ошибочно спаренных нуклеотидов (mismatch repair), выполняет в клетке несколько важных функций. Прежде всего она исправляет ошибки репликации ДНК, меняя ошибочно вк
Полимераза поли(ADP-рибозы) в репарации ДНК у эукариот
В отличие от бактерий одним из первых ответов клеток животных на тяжелые повреждения ДНК является массированная полимеризация остатков ADP-рибозы специальным ферментом – полимеразой поли(ADP-риб
Альтруистичная ДНК
Как следует из вышеизложенного, стабильность генетической информации любого организма обеспечивается двумя различными путями. Прежде всего, системы детоксикации ксенобиотиков и эндогенных мутагенов
Парадокс возможности существования многоклеточных организмов
Огромный размер генома многоклеточных организмов с генетической точки зрения должен создавать для их существования многочисленные и, на первый взгляд, трудноразрешимые препятствия. Проблемы начинаю
Повышение информационной стабильности генома избыточными последовательностями
Анализ структуры генома современных эукариот показывает, что эволюционные преобразования генома-предшественника, приведшие к включению в него избыточных последовательностей нуклеотидов, сопровождал
Селективная защита генов от мутаций
Во всех предыдущих рассуждениях речь шла о глобальной защите функционально значимых участков гипотетического генома от спонтанных и индуцируемых мутаций некодирующими последовательностями нуклеотид
Высокоупорядоченное расположение летальных генов на хромосомах
Если гипотеза о наличии внутри ядер генетически детерминированных, пространственно упорядоченных участков геномной ДНК является верной, то это влечет за собой важное следствие. В этом случае в проц
Возможный смысл парадокса С
У организмов, находящихся на примерно одинаковых ступенях эволюционного развития, часто наблюдаются значительные вариации в размерах геномов (см. главу 1). Например, у некоторых видов рыб, относящи
Рестриктазы и ДНК-метилазы
Среди ферментов, используемых в генной инженерии для клонирования, большое значение имеют эндонуклеазы рестрикции – рестриктазы. Эти ферменты, впервые открытые как часть системы рестрикции–м
Эффективность расщепления коротких последовательностей ДНК некоторыми распространенными рестриктазами
Рестриктаза
Последовательность олигонуклеотидов в окрестностях сайта рестрикции
Длина цепи, нт
Процент расщепления олигонуклеотида после инкуба
ДНК- и РНК-лигазы
Создание фосфодиэфирных связей в одноцепочечных разрывах двухцепочечной ДНК с помощью ДНК-лигаз является наряду с рестрикцией одним из важнейших этапов получения рекомбинантных ДНК in vitro. Наибол
Ферменты матричного синтеза ДНК и РНК
К ферментам матричного синтеза нуклеиновых кислот относятся многочисленные ДНК- и РНК-зависимые ДНК- и РНК-полимеразы, осуществляющие зависимый от матричных ДНК или РНК синтез нуклеиновых кислот. Э
Частота ошибок при синтезе ДНК, осуществляемом термостабильными ДНК-полимеразами in vitro при проведении ПЦР в оптимальных условиях
ДНК-полимераза
Частота мутаций
(на 1 нуклеотид/1 раунд репликации)
Pfu
1,3 10-6
Deep Vent
Другие ферменты
Среди других многочисленных ферментов, используемых в генной инженерии, прежде всего следует упомянуть полинуклеотидкиназы, которые осуществляют перенос g-фосфатных групп ATP на 5’
Векторы
Ферменты, описанные в предыдущем разделе, позволяют производить тонкие манипуляции как с протяженными молекулами ДНК, так и с их фрагментами. В частности, с помощью рестриктаз можно с большой точно
Векторы на основе фага l
Основным недостатком плазмидных векторов для клонирования является их малая емкость в отношении клонируемых фрагментов ДНК. Размер вставок клонируемой ДНК в плазмидных векторах, которые способны ст
Интегрирующие и челночные (бинарные) векторы
Векторы, пригодные для клонирования ДНК в бактериях, отличающихся от E. coli, должны обладать всеми характерными чертами, которые были отмечены выше. От только что рассмотренных они отличаются глав
Конструирование экспрессирующих векторов и их функционирование
Первая часть книги была посвящена описанию механизмов, обеспечивающих высокоэффективную и высокоспецифическую экспрессию генов. Такого рода информацию успешно используют в настоящее время для эффек
Векторы для переноса ДНК в клетки животных и растений
Все основные принципы, используемые при конструировании бактериальных векторов, применимы и для получения векторов эукариотических клеток. Как и в случае бактерий, эукариотический вектор представля
Клонотеки генов
Любой индивидуальный ген занимает лишь небольшую часть генома живого организма. В то же время размер генома даже наиболее просто организованных бактерий в среднем составляет 2•106 п.о.,
Получение клонотек генов
Клонотека генов представляет собой набор разных последовательностей нуклеотидов ДНК, клонированных в составе векторных молекул, которые в сумме составляют весь геном исследуемого организма или каку
Методы скрининга клонотек генов
Все методы получения из клонотек генов требуемых последовательностей нуклеотидов можно разделить на две группы. При использовании первой группы методов рекомбинантные бактерии или фаговые частицы и
Эукариотические системы экспрессии рекомбинантных генов, основанные на культурах клеток
Выделение любого нового рекомбинантного гена описанными выше методами неизбежно заканчивается попытками получения его полноценной экспрессии в искусственных генетических системах. Только на первый
Клетки яичников китайских хомячков (линия CHO)
Эта линия клеток и ее многочисленные производные часто используются для синтеза рекомбинантных белков после предварительной эндогенной амплификации соответствующих рекомбинантных генов, введенных в
Клетки селезенки мышей (линия MEL)
Обе системы экспрессии, описанные выше, базируются на амплификации трансгенов, обеспечивающей высокий уровень внутриклеточного синтеза кодируемых ими рекомбинантных белков в отобранных клонах клето
Клетки африканской зеленой мартышки (линия COS)
Получение временной экспрессии генов в клетках COS часто используется для быстрой наработки рекомбинантных белков и ДНК. При конструировании клеток COS клетки зеленой мартышки CV-1 были трансформир
Клетки насекомых, зараженные бакуловирусами
Многочисленное семейство бакуловирусов, размножающихся в клетках беспозвоночных, обладает геномом в виде двухцепочечной кольцевой ковалентно замкнутой ДНК длиной в 80–220 т.п.о. Круг хозяев бакулов
Сравнение эффективности рассмотренных систем экспрессии
Проведено сравнение эффективности рассмотренных выше систем экспрессии эукариотических рекомбинантных генов с использованием гена huLIF в качестве модели. In vivo этот белок с молекулярной массой 3
Бесклеточные белоксинтезирующие системы
Среди искусственных систем биосинтеза белка важное место занимают бесклеточные системы. Любая бесклеточная система создается, прежде всего, для моделирования конкретных биохимических процессов, про
Прокариотические системы
Среди прокариотических бесклеточных белоксинтезирующих систем наибольшее распространение получили системы на основе экстрактов клеток E. coli, хотя основные принципы, используемые для их получения,
Эукариотические системы
Несмотря на относительную простоту получения бактериальных белоксинтезирующих систем, их использование ограничивается трансляцией бактериальных и фаговых мРНК или рекомбинантных последовательностей
Проточные системы
Бесклеточные системы биосинтеза белка позволили генной инженерии получать экспрессию изолированных генов, не прибегая к помощи живых клеток. До недавнего времени все обсуждавшиеся выше бесклеточные
Другие современные методы исследования генов
Основным методическим достижением генной инженерии в исследовании генов является разработка способов выделения индивидуальных генов и экспрессии их в новом генетическом окружении в гомологичных и г
Рестрикционное картирование генов
Полную, но, к сожалению, пока трудно интерпретируемую информацию о строении гена может дать только определение его первичной структуры, т.е. последовательности составляющих ген нуклеотидов. На прак
S1-картирование РНК и ДНК
Нуклеаза S1, специфически гидролизующая одноцепочечные ДНК и РНК, успешно используется для исследования колинеарности ДНК и кодируемой ей РНК, точного картирования мест инициации и терминации транс
Футпринтинг
Принцип защиты последовательности нуклеотидов рестрикционных фрагментов ДНК белками от действия агентов, расщепляющих ДНК, лежит в основе футпринтинга – метода, позволяющего определять места специф
Стратегия выделения нового гена
После обсуждения основных экспериментальных приемов, используемых в современной генной инженерии, становится ясно, каким образом можно решить одну из основных методических задач молекулярной генети
Методы направленного получения мутаций
Развитие генной инженерии революционизировало процесс получения мутаций в конкретных участках генома и анализ последствий этих мутаций на молекулярном уровне. Совокупность методов получения мутаций
Получение делеций и вставок
Делецией называют потерю части нуклеотидов в геноме организма. Такой вид мутаций удобнее всего использовать для локализации (картирования) функционально значимых участков генов и кодируемых
Химический мутагенез
Делеции и вставки, создаваемые в структурных частях генов, как правило, их инактивируют, особенно в тех случаях, когда такие мутации приводят к сдвигу открытых рамок считывания. Поэтому делеции и в
Полимеразная цепная реакция в направленном мутагенезе
Разработка метода полимеразной цепной реакции принципиально изменила ситуацию в исследованиях по направленному мутагенезу. Использование ПЦР для направленного мутагенеза основано на применении в ка
Белковая инженерия
После рассмотрения способов получения сайт-специфических мутаций необходимо сделать лишь один шаг, чтобы оказаться лицом к лицу с бурно развивающимся направлением молекулярной генетики, называемым
Библиотеки пептидов и эпитопов
В живом организме большинство биологических процессов управляется посредством специфических белок-белковых или белково-нуклеиновых взаимодействий. К таким процессам относятся, например регуляция тр
Белки-репортеры в гибридных белках
В рассмотренных выше библиотеках пептидов последние ковалентно связаны с белком-носителем. В таком виде они являются одними из представителей гибридных белков, получаемых методами генной инженерии.
Подходы к созданию новых ферментов
Подавляющее большинство исследований, в которых методы белковой инженерии используют для замен отдельных аминокислотных остатков в полипептидных цепях белков, заканчиваются получением мутантных про
Субтилигаза в лигировании пептидов
В заключение рассмотрим еще одно неожиданное направление белковой инженерии, четко обозначившееся в самое последнее время. Во всех вышеупомянутых подходах конструирование белков с новыми свойствами
Концепция ксенобиоза
Успехи белковой инженерии, демонстрирующие возможность изменения субстратной специфичности ферментов путем замены одной или нескольких аминокислот с помощью направленного мутагенеза, наводят на мно
Антисмысловые РНК и олигонуклеотиды
Главный механизм, лежащий в основе функционирования системы антисмысловых РНК, прост и опирается на известный феномен взаимодействия двух комплементарных друг другу молекул нуклеиновых кислот с обр
Механизм действия антисмысловых РНК
Многочисленные исследования антисмысловых РНК как in vitro, так и in vivo показали, что конечным результатом их действия, как правило, является высокоспецифическое ослабление экспрессии генов, мРНК
Использование антисмысловых РНК
Получение фенокопий.Клетки или организмы, обладающие фенотипом мутантных клеток или организмов, сформировавшимся не вследствие мутаций, называют фенокопиями. Развитие техник
Влияние экспрессии антисмысловых РНК на фенотип трансгенных мышей
Гены-мишени
Длина micРНК, п.о.
Мишень в гене
Фенотип
Основной белок миелина
Экзоны
Природные антисмысловые РНК
За то время, которое прошло с момента открытия в середине 1970-х годов антисмысловых РНК и их успешного использования для искусственной регуляции экспрессии генов, стало ясно, что этот эффектный ге
Рибозимы и дезоксирибозимы
Регуляция экспрессии генов с помощью антисмысловых РНК характеризуется высокой специфичностью. Это обусловлено большой точностью процесса РНК-РНК-гибридизации, основанной на комплементарном взаимод
Типы рибозимов
Эндорибонуклеазная активность РНК была впервые обнаружена Т. Чехом в 1980 г. у интрона группы I предшественника рибосомной РНК Tetrahymena, осуществляющего аутокаталитическую реакцию сплайсинга (ау
Свойства рибозимов
Стабильность рибозимов в биологических жидкостях. Нестабильность РНК является одним из основных ограничений, препятствующих эффективному их использованию in vivo в качестве лекарст
Рибозимы как лекарственные средства
На основании результатов рассмотренных опытов, а также других накопленных знаний о рибозимах складывалось мнение о принципиальной возможности использования рибозимов для регуляции активности конкре
Дезоксирибозимы
В отличие от РНК, выполняющих в клетке разнообразные функции, благодаря возможностям формирования у этих макромолекул сложных пространственных структур, для внутриклеточных ДНК пока известна единст
Аптамеры
Аптамерами называют небольшие молекулы нуклеиновых кислот, которые могут выполнять функции высокоспецифичных рецепторов низкомолекулярных органических соединений. Олигонуклеотидные аптамеры
Молекулы РНК у истоков жизни
Большинство современных теорий происхождения жизни рассматривает молекулы РНК, обладающие активностями рибозимов, в качестве первичных самореплицирующихся молекул, давших начало развитию жизни на З
Молекулы РНК в качестве РНК-репликаз
Для первоначального появления рибозимов необходим абиотический синтез олигорибонуклеотидов длиной 30–70 оснований. Долгое время это требование было камнем преткновения в разработке теории происхожд
Возможность синтеза полипептидных цепей молекулами РНК
Вскоре после открытия рибозимов в литературе стала активно обсуждаться гипотеза о каталитической (а не только структурной) функции рРНК в рибосомах. Первые экспериментальные данные в пользу возможн
Способы получения трансгенных многоклеточных организмов
Многоклеточный организм высших животных и растений является продуктом онтогенетического развития, при котором из одной клетки (зиготы), образовавшейся в результате слияния двух половых клеток родит
Экспрессия трансгенов
Если трансгены в своем функционировании проявляют тканеспецифичность, то уровень их экспрессии зависит от места интеграции в хромосому. В тех редких случаях, когда экспрессия трансгена полностью от
Использование трансгенов у животных
Техника трансгеноза открывает практически безграничные, принципиально новые возможности исследования экспрессии генов. Ниже будут кратко рассмотрены четыре активно развиваемые направления использов
Исследование механизмов экспрессии генов
Как уже упоминалось выше, цис-действующие регуляторные последовательности нуклеотидов обеспечивают тканеспецифический характер экспрессии трансгенов. Этим свойством воспользовались для опред
Токсигены в исследовании дифференцировки соматических клеток в онтогенезе
Выше рассматривалась возможность применения гибридных токсинов для специфического воздействия на группы соматических клеток, обладающих определенными фенотипическими маркерами. Высокоспецифической
Изменение физиологического статуса лабораторных и сельскохозяйственных животных
Одними из первых указаний на возможность использования трансгеноза для изменения физиологических параметров и физической конституции организма животных были результаты работ по экспрессии трансгено
Моделирование наследственных и приобретенных заболеваний человека
Для разработки эффективных методов лечения наследственных и приобретенных заболеваний человека, а также для полного понимания их этиологии требуется моделирование соответствующих симптомов на лабор
Трансгенные растения
Способность к вегетативному размножению отличает организм растений от организма высших животных, что заметно облегчает осуществление трансгеноза. Многие клетки растений, например клетки зародыша на
Генотерапия наследственных и приобретенных заболеваний
Современные методы лечения наследственных и приобретенных заболеваний связаны с введением в организм больного недостающих продуктов метаболизма или с ограничением поступления их предшественников с
Способы доставки новых генов в геном человека
Ретровирусные векторы. Для доставки трансгенов в организм человека в целях генотерапии ретровирусные векторы используются наиболее широко и являются одним из наиболее эффективных с
Управление экспрессией трансгенов в клетках-мишенях
Для того чтобы терапевтическое действие трансгенов реализовывалось в полной мере, часто бывает необходимо обеспечивать их тканеспецифическую экспрессию в клетках-мишенях на протяжении всей жизни ин
Современные достижения генотерапии онкологических заболеваний
Несмотря на разработку множества новых лекарственных препаратов, направленных на лечение онкологических заболеваний, за последние 30 лет не удалось увеличить число пациентов, проживших более 5 лет
Ближайшие перспективы использования генотерапии
Какие же еще заболевания человека можно рассматривать в качестве ближайшей перспективы для генотерапии? Как упоминалось выше, ретинобластома (онкологическое заболевание, при котором поражаются заро
Успехи генотерапии в модельных экспериментах
В последнее время получены впечатляющие результаты и по коррекции дефектов на генном уровне с помощью направленного переноса генов в клетки мышей. Одним из таких примеров является успешная генотера
Проблемы, возникающие в связи с практическим применением генотерапии
Несмотря на впечатляющие успехи генотерапии на модельных животных, в настоящее время имеется ряд принципиальных затруднений, препятствующих широкому использованию метода для лечения заболеваний чел
Получение клинического генетического материала
Для проведения ПЦР используют ДНК клеток различных органов и тканей человека. Основными требованиями, предъявляемыми к такой ДНК, является отсутствие сильной ее деградации и повреждений химическими
Диагностика заболеваний
В процессе диагностики и исследования генетических механизмов наследственных заболеваний человека возникают две тесно связанные друг с другом задачи. На первом этапе исследований в ДНК из клиническ
ДНК-типирование
Результаты, полученные при исследовании структуры и организации геномной ДНК животных, растений и микроорганизмов, наложили глубокий отпечаток на методологию их систематизации. Проблема адекватного
ДНК-типирование микроорганизмов
Наиболее часто в настоящее время используют два способа ДНК-типирования патогенных микроорганизмов, в основе которых лежит метод ПЦР. В первом случае используют один или несколько коротких праймеро
Микроматрицы и микрочипы ДНК
Одним из интенсивно развивающихся направлений биотехнологии нуклеиновых кислот в последнее время становится использование микроматриц ДНК для анализа нуклеотидных последовательностей. В этой группе
Ограничения в использовании микроматриц ДНК
Помимо самой достаточно сложной технологии производства микроматриц, к числу факторов, ограничивающих их широкое применение, относятся кинетические параметры гибридизации, а также точность и чувств
Использование микроматриц ДНК в фундаментальных и прикладных исследованиях
Определение первичной структуры и картирование ДНК являются основными направлениями использования микроматриц олигонуклеотидов в настоящее время. Прямое секвенирование генов с помощью олигонуклеоти
Основные подходы к картированию генома человека
Решение основной задачи программы "Геном человека" включает три основных этапа. На первом этапе необходимо специфическим образом разделить каждую индивидуальную хромосому на части меньшег
Генетические карты сцепления
Генетические карты сцепления представляют собой одномерные схемы взаимного расположения генетических маркеров на индивидуальных хромосомах. Под генетическими маркерами понимают любые
Современные методы построения генетических карт сцепления
Метод
Число картированных локусов
Гибридизация соматических клеток
Гибридизация in situ
ПЦР в исследованиях генома человека
Полимеразная цепная реакция занимает центральное место в разработке подходов к практическому осуществлению программы "Геном человека". Как уже обсуждалось выше (раздел 7.1.3), с помощью П
Физические карты низкого разрешения
В отличие от рассмотренных выше генетических карт сцепления физические карты генома отражают реальное расстояние между маркерами, выражаемое в парах оснований. Физические карты различаются по степе
Определение полной первичной структуры ДНК генома человека
Исчерпывающая физическая карта генома человека (и любого другого организма) должна представлять собой полную последовательность нуклеотидов ДНК всех его хромосом. Благодаря тому, что к решению тако
Базы данных получаемой информации
Полное использование информации о структуре генома человека в биологии и медицине станет возможным лишь в отдаленном будущем. Еще долгие годы предстоит собирать и обрабатывать получаемую информацию
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Современная генетика находится на взлете. Новые факты обнаруживаются настолько быстро, что едва хватает времени на то, чтобы просто осознать их появление. Еще труднее уловить многочисленные связи м
Конечный результат экспрессии генов предопределен.
Будущее трансгеноза и генотерапии. Это будет. И совершенно безразлично - хотим мы этого или нет.
Большинство физиологических моделей, в кот
К главе 1
Георгиев Г.П. Гены высших организмов и их экспрессия. М.: Наука, 1989. 254 с.
Георгиев Г.П., Бакаев В.В. Три уровня структурной организации хромосом эукариот
К главе 2
Молекулярная биология: Структура и биосинтез нуклеиновых кислот / Под ред. А.С. Спирина. М.: Высш. шк. 1990. 352 с.
Спирин А.С. Молекулярная биология. Структура рибо
К главе 3
Жимулев И.Ф. Гетерохроматин и эффект положения гена. Новосибирск: Наука, 1993. 491 с.
Льюин Б. Гены. М.: Мир, 1987. 544 с.
Молекулярная биология: Стр
К главе 4
Bell S.P. Eukaryotic replicators and associated protein complexes // Curr. Opinion Genet. Develop. 1995. Vol. 5. P. 162–167.
Cesareni G., Heimer-Citterich M., Сas
К главе 5
Ауэрбах Ш. Проблемы мутагенеза. М.: Мир, 1978. 463 с.
DNA repair. A special issue. // Trends Biochem. Sci. 1995. Vol. 20. P. 381–440.
Friedberg E.C., Ger
К главе 7
Патрушев Л.И. Биосинтез белка в искусственных генетических системах // Проблема белка. М.: Наука, 1995. Т.1 Химическое строение белка. С. 354–478.
Рыбчин В.Н. Основы генетиче
К главе 8
Chang T.K., Jackson D.Y., Burnier J.P. et al. Subtiligase: a tool for semisynthesis of proteins // Proc. Nat. Acad. Sci. US. 1994. Vol. 91. P. 12544–12548.
Houghten R.A
К главе 9
Crooke S.T. Progress in antisense therapeutics // Med. Res. Rev. 1996. Vol. 16. P. 319–344.
Dolnick B.J. Naturally occurring antisense RNA // Pharmacol. Ther.
К главе 10
Свердлов Е.Д. Очерки современной молекулярной генетики по курсу лекций для студентов биологического факультета МГУ. Очерк 5. Трансгеноз и новая молекулярная генетика // Молек
К главе 11
Шагинян И.А., Гинцбург А.Л. ПЦР-генетическое типирование патогенных микроорганизмов // Генетика. 1995. Т. 31. С. 600–610.
Graber J.H., O'Donnell M.J., Smith C.L., Cantor C.R.
К главе 12
Benner S.A., Trabesinger N., Schreiber D. Past-genomic science: Converting primary structure into physiological function // Adv. Enzyme Regul. 1998. Vol. 38. P. 155–180.
Billings
Новости и инфо для студентов