Исследование процессов кислотной и термической инактивации

Исследование процессов кислотной и термической инактивации.

Изучение термо- и рН-стабильности ферментов часто несёт прикладной характер. Исследование этих характеристик проводится остаточной активностью фермента после выдержки его раствора в течение некоторого времени при определённых рН и температуре 11 . Нами были проведены исследования кинетики кислотной и термической инактивации протеиназ Penicillium wortmannii 2091 и рассчитаны кинетические параметры этого процесса.

При изучении термо- и рН -стабильности раствор препарата выдерживали в фосфатном буфере в диапазоне рН от 5,0 до 12,0 и температур от 30 до 60оС. Периодически отбирали аликвотные доли раствора и определяли остаточную протеолитическую активность.

Полученные результаты по инактивации обоих ферментов показали, что протеиназа 1 сохраняет активность в широком диапазоне рН. При значении рН 7,0 через 200 часов фермент сохраняет около 90 активности рис.4 . При значениях рН 6,0 - 9,0 активность фермента снижается до 70 - 75 , это указывает на то, что фермент в указанном интервале не подвержен автолизу, а, следовательно, его нативная конформация обладает высокой стабильностью.

При значениях рН ниже 6,0 и выше 11,0 каталитическая активность фермента быстро снижается. Во всех случаях ПА КлА-const, это свидетельствует о том, что мы имеем дело с одним ферментом. Термическую инактивацию протеиназ изучали в интервале температур 30 - 60оС. Протеиназа 1 в области высокой рН-стабильности инактивируется почти полностью при температуре 60оС в течение 60 часов, в то время как протеиназа 2 при этой же температуре инактивируется полностью уже за 3 часа. Данные свидетельствуют о высокой термостабильности протеиназы 1. Инактивация протеиназы 2, происходящая при высокой температуре, по-видимому, определяется процессом разворачивания белковой глобулы.

Протеиназа 1, обладающая коллагенолитическим действием, нас интересует с практической точки зрения, поэтому были рассчитаны некоторые кинетические характеристики для этого фермента.

Если предположить, что в каждом элементарном акте процесса инактивации фермента под действием Н - ионов участвует одна его молекула, то кислотную инактивацию можно представить в виде реакции первого порядка. Кинетическое уравнение первого порядка имеет вид 2,303 lg E0 E K, где Е0 - исходная активность фермента Е - активность в момент времени К - константа скорости инактивации, характеризующая потерю активности в течение часа, час-1. Остаточную активность выражали в процентах от исходной и затем использовали в расчётах констант инактивации.

Величину находили, как среднее из 5 - 6 определений табл.2 . Таблица 2. Кислотная инактивация протеиназы 1 при температуре 500С ч Значения рН 5,0 7,0 9,0 11,0 Е К 103ч-1 Е К 103ч-1 Е К 103ч-1 Е К 103ч-1 0 100 2 100 2 100 2 100 2 12 65,1 37,0 100 2 100 2 63,2 38,1 24 45,2 33,6 92,3 2,33 92,3 2,33 42,3 36,0 48 16,8 37,7 88,0 2,54 87,8 2,54 18,1 36,3 96 7,6 36,8 81,0 2,23 81,5 2,19 7,0 37,1 120 6,7 35,7 66,3 2,50 68,2 2,30 6,5 37,7 144 6,5 33,1 62,2 2,56 60,9 2,54 6,0 34,0 Как видно из табл.2, при определённом рН, значения констант достаточно близки друг к другу, максимальное отклонение от средних значений не превышает 10 - 15 , что вполне допустимо в исследованиях кинетики химических реакций.

Это свидетельствует о том, что процесс инактивации протеиназы 1 является реакцией первого порядка. Различия в значениях при рН 5,0 и 11,0 и при рН 7,0 - 10,0 на целый порядок ещё раз указывают на лабильность фермента в слабо - кислой и слабо - щелочной зонах.

Исследования термической инактивации протеиназы 1 при различных значениях рН позволили рассчитать константы инактивации для температур 30, 40, 50, 60оС, а затем найти термодинамические параметры этого процесса. Термодинамические расчёты были проведены только для вышеуказанных температур табл.3 . Таблица 3. Термодинамические характеристики активированного комплекса протеиназы I. t, oC PH Еакт Н F S Дж К-1 моль-1 Дж моль-1 30-60 5,0 245,8 244,6 53,2 600,3 30-40 7,0 75,6 72,0 68,1 13,6 40-60 7,0 300,5 298,2 60,0 734,9 30-40 9,0 72,4 71,0 69,9 9,9 40-60 9,0 295,9 294,1 60,0 723,9 30-40 11,0 255,9 253,6 54,9 624,3 Поскольку инактивация протеиназы была необратимой, для определения энтальпии Н, свободной энергии F и энтропии S воспользовались теорией абсолютных скоростей Эйринга.

При повышении температуры скорость инактивации возрастает.

Это можно объяснить тем, что тепловая энергия разрушает гидрофобные взаимодействия, которые играют важную роль в стабильности белков. В результате происходит развёртывание полипептидной цепи, что подтверждается высокими значениями S и согласуется с литературными данными. Таким образом, изменение величины рН вызывает разрушение электростатических сил, и решающую роль в этих условиях в процессе инактивации играют, по-видимому, гидрофобные взаимодействия. 3.6