Влияние ионов металлов и ингибиторов на активный центр фермента

Влияние ионов металлов и ингибиторов на активный центр фермента. Главным признаком, используемым при отношении протеолитических ферментов к тому или иному классу, является строение каталитического центра.

Отправной точкой в изучении строения активного центра, механизма катализа является идентификация функциональных групп, что достигается комплексными исследованиями и, в первую очередь, применением специфических ингибиторов. В наших опытах в качестве ингибиторов были использованы ЭДТА, монойодуксусная кислота, n-хлормеркурийбензоат натрия, фенилметилсульфатонилфторид, диизопропилфторфосфат, перманганат калия.

Растворы ферментов, содержащие 510-3М этих соединений, выдерживали при 30оС в течение одного часа. Как показали результаты опытов, протеиназа 1 полностью инактивировалась ЭДТА - ингибитором металлоферментов, остальные ферменты не изменяли протеолитическую активность. Протеиназа 2 инактивировалась монойодуксусной кислотой и n-хлормеркурийбензоатом натрия на 84 и 63 соответственно. Фермент терял активность при воздействии фенилметилсульфатонилфторидом и диизопропилфторфосфатом, это даёт возможность предположить, что протеиназа 2 относится к сериновым. Не оказывал влияния не на одну из протеиназ перманганат калия, что свидетельствует об отсутствии в активном центре карбоксильной группы.

На основе полученных данных можно предположить, что протеиназа 1 относится к металлоферментам, а протеиназа 2 - к сериновым. В дальнейшем было интересно рассмотреть влияние на протеиназы гистидина. На протеиназу 2 он не оказывал ингибирующего действия, в то время как полностью ингибировал протеолитическую и коллагеназную активности протеиназы 1. Из литературы известно, что гистидин является ингибитором коллагеназ.

В связи с чем очевидно, что протеиназа 1 является ферментом, проявляющим свойства протеиназы с коллагеназным действием К специфическим реагентам относятся также ионы металлов. Они могут оказывать ингибирующий или активирующий эффект. В наших опытах мы использовали соли двухвалентных металлов в виде хлоридов и концентрации 0,005М. Фермент выдерживали в соли, а затем определяли остаточную активность.

Ионы Mn2 , Ca2 , Ba2 практически не оказывали никакого влияния на активность обеих протеиназ Zn2 , Co2 незначительно ингибировали оба фермента, ионы Cd2 , Cu2 ингибировали протеиназу 1, а протеиназа 2 ингибировалась ионами Fe2 , Ni2 , Cd2 , Cu2 . Результаты представлены в таблице 4. Таблица 4. Влияние ионов металлов на активность протеиназ Penicillium wortmannii 2091. Ион металла С 0,005М Ферментная активность, от исходной.

Протеиназа I Протеиназа II Mn2 100,0 95,39 Ca2 100,0 100,0 Ba2 100,0 100,0 Zn2 95,2 95,2 Co2 93,9 95,2 Cu2 34,5 19,2 Cd2 20,4 20,8 Ni2 98,5 67,5 Fe2 97,9 44,9 3.7 Субстратная специфичность. В изучении протеолитических ферментов значительное место занимают исследования специфичности их действия. В литературе нет сведений, касающихся вопроса специфичности действия протеиназ грибов рода Penicillium. В связи с этим исследовалась способность протеиназы 1 к гидролизу некоторых пептидных связей.

Исследования проводили на синтетических пептидах и различных белках. Результаты показали, что протеиназа 1 гидролизовала довольно широкий спектр пептидных связей. Она разрывала связи в пептидах цис - ала, про - ала, гли - лей, гли - мет, ала - гли - гли, ала - гли - фен. Следует отметить, что гидролизу подвергались связи, характерные для белков животного происхождения. В связи с этим мы исследовали специфичность действия протеиназы на животных белках.

В качестве субстратов использовались казеин, гемоглобиин, денатурированный мочевиной, кератин, коллаген, желатина. При одной и той же концентрации фермента наиболее активно расщепляется казеин 78 - 80 и гемоглобин 60 - 62 , затем слабее желатина и коллаген. Менее всего гидролизу подвергается кератин 22 - 25 рис.5 . 3.8 Гидролиз коллагенсодержащего сырья ноги птиц, шквара. Мясная промышленность располагает значительным количеством шквары, получаемой при перетопке говяжьего и свиного жиросырья.

Анализ химического состава шквары свидетельствует о значительном содержании в ней белковых веществ и подтверждает целесообразность её использования как в колбасном, так и ряде других производств. Общее содержание белка в шкваре колеблется в пределах 65 - 80 . В состав белков входят 22 - 44 коллагена и 19 - 30 эластина. Однако использование шквары ограничивалось из-за большого содержания соединительной ткани. В настоящее время соединительную ткань рассматривают не как билластное вещество, а как необходимый компонент питания 10 . В связи с этим возрастает практический интерес к рациональному и полному использованию шквары на пищевые цели, разработке путей повышения её биологической ценности.

Это направление явилось основой разрабатываемой нами темы. Для получения гидролиза шквары целесообразно использование протеиназ, расщепляющих белки в нейтральной зоне рН и действующих на коллаген. Нами был проведён сравнительный анализ промышленных препаратов, обладающих этими свойствами и полученного препарата табл. 5 . Таблица 5. Характеристика протеолитических свойств и степени гидролиза гомогената шквары под действием различных ферментных препаратов.

Фермент Массовая доля, рН ПА, ед см 3 Аминный азот, мг на см3 субстрата Протовортманин 0,1 7,2 0,838 7,616 Протосубтилин 0,1 7,2 0,0476 5,068 Панкреотин 0,1 7,2 0,0570 4,868 Пепсин 0,1 7,2 Пигмауесин 0,3 7,2 Контроль - 7,2 - 0,000 Контролем служила среда, где вместо фермента была добавлена дистилированная вода в аликвотном количестве.

Согласно полученным результатам, препарат протовортманин наиболее эффективен при получении белкового гидролизата. В дальнейшем нами были определены условия эффективной работы фермента. Наши исследования ограничивались изучением влияния гидромодуля среды, температуры, продолжительности гидролиза, дозировки препарата, т. е. параметров, играющих решающее значение для разрабатываемой технологии и влияющих на экономику процесса.

Протеолитические ферменты катализируют реакцию расщепления белков с участием воды. В связи с этим важным моментом в подборе условий гидролиза является определение минимального гидромодуля для высокого гидролиза субстрата. Постановка эксперимента заключалась в следующем в семь колб объёмом в 100см3 вносили по 10 г гомогената шквары, затем одновременно раствор ферментного препарата и соответствующий объём воды. После внесения фермента и воды колбы закрывали и ставили на 3 часа в ультратермостат при 50оС. Результаты эксперимента оценивали по степени накопления аминного азота рис.6 . Как видно на рисунке 6 для активного гидролиза белков сырья достаточен гидромодуль гомогенат вода 1 1 1,5. Дальнейший рост содержания воды в среде увеличения степени гидролиза не даёт. Решающее значение в ферментативных реакциях имеет температура при низких температурах фермент может быть практически не активен, а высокие температуры могут привести к инактивации фермента.

Поэтому при постановке этого эксперимента особое внимание уделялось поддержанию строгого температурного режима.

Эксперимент проводился в трёх поверхностях. В 15 колб по 100см3 вносили 10 г гомогената. Колбы помещали в термостаты при температурах 20, 30, 40, 50, 60оС. Затем вносили по 3см3 фермента и 12см3 воды согласно ранее полученным данным, плотно закрывали и вели гидролиз в течение 3 часов. По истечению 3 часов из каждой колбы отбирали по 10см3 субстрата и определяли аминный азот по методике Серенсена.

Результаты представлены на рис. 7. Как видно на рис.7 наибольшее накопление аминного азота, а, следовательно, и максимальная степень гидролиза наблюдается при температуре 50оС. При температурах 20, 30, 40оС гидролиз, видимо, идёт не до конца, т. е. эти температуры не обеспечивают достаточной катализирующей способности ферментного препарата и требуют увеличения продолжительности процесса гидролиза, что с точки зрения технологического процесса очень невыгодно. Температура 60оС приводит, по-видимому, к частичной инактивации фермента.

Дальнейшее увеличение температуры приведёт, скорее всего к полной инактивации фермента, поэтому исследование действия ферментного препарата при температурах выше 60оС не имеет смысла. Таким образом, оптимальная температура гидролиза субстрата препаратом из Penicillium wortmannii 2091 равна 50оС. Дальнейшим этапом нашей работы было определение дозировки препарата. Дозировка препарата в большей степени отражается на экономической стороне процесса, так как ферментные препараты пока ещё имеют достаточно высокую стоимость.

Эксперимент проводился по аналогии с предыдущим с учётом оптимальной температуры и внесением различного количества ферментного препарата. Фермент вносили по ПА в количестве 2,0, 2,5, 3,0, 4,0, 5,0 ед. в расчёте на 10 г гомогената. После трёх часов гидролиза определяли аминный азот. Результаты представлены на рис.8. Исходя из полученных в ходе эксперимента данных можно сделать вывод о целесообразности внесения 4,0 ед. по ПА ферментного препарата в расчёте на 10 г белкового сырья. Время гидролиза, необходимое для течения реакции, отражается на продолжительности всего технологического процесса.

Именно с целью определения минимального времени гидролиза с максимальным эффектом накопления аминного азота был поставлен следующий эксперимент гомогенат в количестве 40 г, с выбранным гидромодулем, помещали в термостат при 50оС и добавляли раствор фермента в оптимальном количестве. Пробы отбирали каждый час с момента внесения фермента. Эксперимент проводился в трёх повторностях.

Анализируя результаты можно сказать, что первые пять часов идёт накопление аминного азота, следовательно, гидролиз ещё не окончен и целесообразно его продолжать. После 6 - 7 часов гидролиза изменение аминного азота незначительно, т. е. процесс гидролиза, видимо, находится на стадии завершения. Таким образом, оптимальная продолжительность процесса гидролиза укладывается в 6 часов. Для того, чтобы судить о ценности полученного гидролиза была проведена оценка полученного продукта в сравнении с исходным сырьём табл. 6 . Таблица 6. Характеристика химического состава исследуемых продуктов.

Показатель Гомогенат шквары Гидролизат шквары Плотность, кг м3 1,005 1,005 рН 7,75 7,40 Сухие вещества, 8,4 8,4 Жир, 2,2 2,2 Общий азот, 7,25 7,25 Белковый азот водорастворимый, 2,5 0,91 Аминный азот, мг г 1,6 11,0 Вязкость 42 4,2 Анализируя данные таблицы 6 можно сделать следующие выводы полученный гидролизат значительно отличается по свойствам от исходного продукта.

Гидролизат шквары характерен накоплением большого количества свободных аминокислот, о чём свидетельствует резкое увеличение аминокислот азота и снижение рН среды. Как показали наши исследования, заметные изменения произошли во фракционном составе белковых компонентов. В результате гидролиза высота нерастворённого осадка продукта уменьшилась в 4 раза, почти в 4 раза уменьшилось содержание водорастворимых белков. Накопление низкомолекулярных продуктов распада белков, видимо, является причиной потери желирующих свойств водорастворимой фракции и снижения вязкости среды в 10 раз. Снижение жира практически не изменилось, т. е. фермент не обладает липазной активностью.

Анализ свойств гидролизата дал возможность судить о ценности белкового продукта, полученного из шквары и возможности использования его в производстве в качестве заменителя основного сырья. Мясная промышленность располагает большими резервами увеличения выработки ценных пищевых продуктов.

В настоящее время большое внимание уделяется рациональному использованию малоценных продуктов убоя и переработки птицы для получения белковых гидролизатов, которые находят широкое применение не только как компонент пищи, но и как диетический продукт для лечебного питания. Питательная ценность белковых пищевых гидролизатов зависит от технологии их производства. В мировой практике широко используются процессы кислотного и щелочного гидролиза белков. Однако они имеют ряд недостатков.

Так при щелочном гидролизе практически полностью разрушается серин, треонин, аргенин, цистеин. Полученные гидролизаты обладают неприятным вкусом. Кислотный гидролиз протекает быстрее и более специфично. Ферментативный гидролиз лишён этих недостатков, что позволяет значительно повысить питательную ценность получаемых продуктов и имеет ряд преимуществ. При его применении исключается жесткое воздействие на белковые молекулы, распад аминокислот, возможен подбор системы ферментов и условий процесса, что позволяет создать оптимальную технологию переработки разных видов белкового сырья.

Путём подбора ферментов можно добиться получения гидролизата без горького привкуса. ГЛАВА 4.