Спиртове бродіння

У 1836 французький учений Каньяр де ла Тур встановив, що спиртове бродіння пов'язано із зростанням і розмноженням дріжджів. Хімічне рівняння спиртового бродіння: C₆H₁₂O₆ = 2C₂H₅OH + 2CO₂ було дано французькими хіміками А. Лавуазье (1789) і Ж. Гей-люссаком (1815). Л. Пастер прийшов до висновку (1857), що спиртове бродіння можуть викликати тільки живі дріжджі в анаеробних умовах («бродіння - це життя без повітря»). На противагу цьому німецький учений Ю. Лібіх наполягав на тому, що бродіння відбувається поза живою клітиною. На можливість безклітинного спиртового бродіння вперше (1871) вказала російський лікар-біохімік М. М. Манассєїна. Німецький хімік Э. Бухнер в 1897, віджавши під великим тиском дріжджі, розтерті з кварцевим піском, одержав безклітинний сік, що зброджує цукор з утворенням спирту і CO₂. При нагріванні до 50°C і вище за сік втрачав бродильні властивості. Все це указувало на ферментативну природу активного початку, що міститься в дріжджовому сіку. Російський хімік Л. А. Іванов виявив (1905), що додані до дріжджового сіку фосфати у декілька разів підвищують швидкість бродіння Дослідження вітчизняних біохіміків А. І. Лебедева, С. П. Костичева, Я. О. Парнаса і німецьких біохіміків До. Нейберга, Р. Ембдена, О. Мейергофа і ін. підтвердили, що фосфорна кислота бере участь в найважливіших етапах спиртового бродіння.

Надалі багато дослідників детально вивчили ферментативну природу і механізм спиртового бродіння. Послідовність реакцій до стадії утворення ПВК аналогічна реакціям гліколізу. В подальшому ПВК за участю наявного в дріжджах ферменту піруватдекарбоксилази розщеплюється на оцетовий альдегід та двоокис вуглецю. Оцетовий альдегід, реагуючи з тією, що утворилася під час окислення гліцеринальдегідфосфорної кислоти відновленою формою никотинамідаденіндинуклеотиду (НАД-Н), за участю ферменту алкогольдегідрогенази перетворюється на етиловий спирт. Сумарно рівняння спиртового бродіння може бути представлено в наступному вигляді:

C₆H₁₂O₆ + 2H₃PO₄ + 2АДФ = 2CH₃CH₂OH + 2CO₂ + 2АТФ.

Таким чином, при зброджуванні 1 моля глюкози утворюються 2 моля етилового спирту, 2 благаючи CO₂, а також в результаті фосфорилювання 2 молі АДФ утворюються 2 благаючи АТФ. Термодинамічні розрахунки показують, що при спиртному бродіння перетворення 1 моля глюкози може супроводжуватися зменшенням вільної енергії приблизно на 210 кдж (50 000 кал), тобто енергія, закумульована в 1 молі етилового спирту, на 210 кдж (50 000 кал) менше енергії 1 моля глюкози. При освіті 1 благаючи АТФ (макроергічних - багатих енергією фосфатних з'єднань) використовується 42 кдж (10 000 кал). Отже, значна частина енергії, що звільняється при спиртному бродінні, запасається у вигляді АТФ, що забезпечує різноманітні енергетичні потреби дріжджових кліток. Таке ж біологічне значення має процес бродіння для інших мікроорганізмів. При повному згоранні 1 моля глюкози (з утворенням CO₂ і H₂O) зміна вільній енергії досягає 2,87 Мдж (686 000 кал). Інакше кажучи, дріжджова клітка використовує лише 7% енергії глюкози. Це показує малу ефективність анаеробних процесів в порівнянні з процесами, що йдуть у присутності кисню. За наявності кисню спиртове бродіння пригнічується або припиняється і дріжджі одержують енергію для життєдіяльності в процесі дихання. Спостерігається тісний зв'язок між бродінням. і диханням мікроорганізмів, рослин і тварин. Ферменти, що беруть участь в спиртному бродінні, є також в тканинах тварин і рослин. У багатьох випадках перші етапи розщеплювання сахаров, аж до утворення піровиноградної кислоти, - загальні для бродіння та дихання. Більше значення процес анаеробного розпаду глюкози має і при скороченні м'язів, перші етапи цього процесу також схожі з початковими реакціями спиртового бродіння.

Зброджування вуглеводів (глюкози, ферментативних гідролізатів крохмалю, кислотних гідролізатів деревини) використовується в багатьох галузях промисловості: для отримання етилового спирту, гліцерину і ін. технічних і харчових продуктів. На спиртному бродінні засновані приготування тесту в хлібопекарській промисловості, виноробство і пивоваріння.

Молочнокисле бродіння. Молочнокислі бактерії підрозділяють на 2 групи - гомоферментатівні та гетероферментативні. Гомоферментативні бактерії (наприклад, Lactobacillus delbruckii) розщеплюють моносахариди з утворенням двох молекул молочної кислоти відповідно до сумарного рівняння:

C₆H₁₂O₆ = 2CH₃CHOH·COOH.

Гетероферментативні бактерії (наприклад, Bacterium lactis aerogenes) ведуть зброджування з освітою молочної кислоти, оцетової кислоти, етилового спирту і CO₂, а також утворюють невелику кількість ароматичних. речовин - диацетилу, ефірів і т.д. Під час молочнокислого бродіння перетворення вуглеводів, особливо на перших етапах, близько до реакцій спиртового бродіння, за винятком декарбоксилювання піровиноградної кислоти, яка відновлюється до молочної кислоти за рахунок водню, що одержується від НАД-Н. Гомоферментативне молочнокисле бродіння використовується для отримання молочної кислоти, при виготовленні різних кислих молочних продуктів, хліби і в силосуванні кормів в сільському господарстві. Гетероферментативне молочнокисле бродіння відбувається при консервації різних плодів і овочів шляхом квашення.

Маслянокисле бродіння. Зброджування вуглеводів з переважним утворенням масляної кислоти проводять багато анаеробних бактерій, що відносяться до роду Clostridium. Перші етапи розщеплювання вуглеводів при маслянокислому бродінні аналогічні відповідним етапам спиртового бродіння, аж до утворення піровиноградної кислоти, з якої при маслянокислому бродінні утворюється ацетил-кофермент A (CH₃CO-KoA). Ацетил-KoA може служити попередником масляної кислоти, піддававшись наступним перетворенням:

Маслянокисле бродіння застосовувалося для отримання масляної кислоти з крохмалю.

Ацетоно-бутилове бродіння. Бактерії Clostridium acetobutylicum зброджують вуглеводи з переважним утворенням бутилового спирту (CH₃CH₂CH₂CH₂OH) і ацетону (CH₃COCH₃). При цьому утворюються також в порівняно невеликих кількостях водень, CO₂, оцетова, масляна кислоти, етиловий спирт. Перші етапи розщеплювання вуглеводів ті ж, що і при спиртному бродінні бутиловий спирт утворюється шляхом відновлення масляної кислоти:

CH₃CH₂CH₂COOH + 4H = CH₃CH₂CH₂CH₂OH + H₂O.

Ацетон же утворюється декарбоксилюванням ацетооцтової кислоти, яка виходить в результаті конденсації двох молекул оцетової кислоти. Дослідженнями В. Н. Шапошникова показано, що ацетоно-бутилове бродіння (як і ряд ін., наприклад пропіоновокисле, маслянокисле) у дослідах з культурою, що росте, відбувається в дві фази. У першу фазу бродіння паралельно з наростанням біомаси накопичуються оцетова і масляна кислоти; у другу фазу утворюються переважно ацетон і бутиловий спирт. При ацетоно-бутиловому бродінні зброджуються моносахариди, дисахариди і полісахариди - крохмаль, інсулін, але не зброджуються клітковина і геміцеллюлоза. Ацетоно-бутилове БРОДІННЯ використовувалося для промислового отримання бутилового спирту та ацетону, що використовуються в хімічній та лакофарбній промисловості.

Пропіоновокисле бродіння. Основні продукти пропіоновокислого бродіння, що викликається декількома видами бактерій з роду Propionibacterium, - пропіонова (CH₃CH₂OH) і оцетова кислоти і CO₂. Хімізм пропіоновокислого бродіння сильно змінюється залежно від умов. Це, мабуть, пояснюється здатністю пропіонових бактерій перебудовувати обмін речовин, наприклад залежно від аерації. При доступі кисню вони ведуть окислювальний процес, а в його відсутності розщеплюють гексози шляхом бродіння Пропіонові бактерії здатні фіксувати CO₂, при цьому з піровиноградної к-ти і CO₂ утворюється щавлевооцетова к-та, що перетворюється на янтарну к-ту, з якої декарбоксилюванням утворюється пропіонова к-та:

Існують бродіння, які супроводжуються і відновними процесами. Прикладом такого «окислювального» бродіння служить лимоннокисле бродіння. Багато цвілевих грибів зброджують цукру з утворенням лимонної кислоти. Найбільш активні штами Aspergillus niger перетворюють до 90% спожитого цукру в лимонну кислоту. Значна частина лимонної кислоти, використовуваної в харчовій промисловості, проводиться мікробіологічним шляхом - глибинним і поверхневим культивуванням цвілевих грибів.

Іноді за традицією і чисто окислювальні процеси, здійснювані мікроорганізмами, називається бродіння. Прикладами таких процесів можуть служити оцтовокисле та глюконовокисле бродіння.

Оцтовокисле бродіння. Бактерії, що відносяться до роду Acetobacter, окисляють етиловий спирт в оцетову кислоту відповідно до сумарної реакції:

Проміжне з'єднання при окисленні спирту в оцетову кислоту - оцетовий альдегід. Багато оцтовокислих бактерій, окрім окислення спирту в оцетову кислоту, здійснюють окислення глюкози в глюконову і кетоглюконову кислоти.

Глюконовокисле бродіння здійснюють і деякі цвілеві гриби, здатні окисляти альдегідну групу глюкози, перетворюючи останню на глюконову кислоту:

Кальцієва сіль глюконової кислоти служить хорошим джерелом кальцію для людей і тварин.

 

 

Аеробне окислення вуглеводів.

Анаеробне та аеробне перетворення вуглеводів тісно пов’язані між собою. Це виявляється у тому, що обидва процеси проходять однаково до стадії утворення ПВК; в них беруть участь одні і ті самі ферменти та утворюються однакові проміжні продукти. Відмінності між цими перетвореннями вуглеводів починаються з перетворення ПВК. В аеробних умовах піруват окисляється до вуглекислого газу та води в аеробній стадій катаболізму, яка називається диханням.Спершу піруват окисляється до ацетил-КоА та вуглекислого газу. Це відбувається під впливом ферментів, об’єднаних структурно в піруватдегідрогеназний комплекс. Це мультиферментна система, що знаходиться в еукаріотичних клітинах в мітохондріях, в прокаріотичних - в цитоплазмі.

СН₃–СО–СООН + НАД + КоА–SН ®СН₃СО~S–КоА + НАД×Н₂ + СО₂

Ця реакція проходить в декілька стадій. В ході її відбувається окислювальне декарбоксилювання пірувату, в результаті якого карбоксильна група пірувату видаляється у вигляді молекули вуглекислого газу, а його ацетильна група включається до складу ацетил-СоА. Утворений НАДН₂ передає водень в дихальний ланцюг. Утворений ацетил-СоА вступає в цикл лимонної кислоти (цикл трикарбонових кислот, цикл Кребса), який, на відміну від гліколізу, що включає лінійну послідовність ферментативних реакцій, працює в циклічному режимі.

Реакції цикл Кребсу відбуваються у мітохондріях. Цикл трикарбонових кислот був відкритий англійським біохіміком Гансом Кребсом. За це видатне відкриття Кребс отримав Нобелівську премію в 1953 р. разом з Ф. Ліпманом. Цикл Кребсу є центром, в якому сходяться практично всі метаболітичні шляхи, це кінцевий шлях окислення вуглеводів, жирних кислот, амінокислот. Реакція, що каталізується цитрат-синтазою, представляє собою конденсацію ацетил-КоА та ЩОК, утворюється лимонна кислота, відбувається розщеплення тіоефірного зв’язку та вивільнення коферменту А. Звільнений SH-КоА може тепер брати участь у окислювальному декарбоксилюванні нової молекули пірувату з утворенням нової молеку

ли ацетил-КоА.

 

Схема циклу Кребса

Фермент аконітаза каталізує оборотне перетворення лимонної кислоти в ізолимонну. Як проміжний продукт (в нормі він не відділяється від активного центру ферменту) утворюється трикарбонова цисаконітова кислота. В клітині ця реакція протікає зліва направо, оскільки продукт реакції (ізолимонна кислота) швидко захоплюється в наступні стадії циклу. Аконітаза містить залізо та кислотолабільні атоми сірки, згруповані в залізо-сірчистий центр. На наступній стадії циклу ізолимонна кислота дегідрується з утворенням a-кетоглутарової кислоти та вуглекислого газу під дією ізоцитратдегідрогенази. Існує два типи ізоцитратдегідрогенази: одна використовує як акцептор електронів НАД, а інша - НАДФ. Перший тип ферменту зустрічається лише в мітохондріях, другий в мітохондріях та в цитозолі. В циклі Кребса беруть участь обидва типи ферменту, але переважає НАД-залежна ізоцитратдегідрогеназа. Для її дії необхідні іони магнію або марганцю, а також специфічний активатор АДФ. Потім відбувається окислювальне декарбоксилювання a-кетоглутарової кислоти з утворенням високоенергетичної сполуки сукциніл-КоА та СО₂, що каталізується a-кетоглутаратдегідрогеназним комплексом. Наступна реакція каталізується ферментом сукциніл-КоА-синтетазою. В ході цієї реакції сукциніл-КоА за участі ГДФ та неорганічного фосфату перетворюється в янтарну кислоту (сукцинат). Одночасно відбувається утворення високоергічного зв’язку ГТФ за рахунок високоергічного тіоефірного зв’язку сукциніл-КоА. Утворення ГТФ в даному випадку називається фосфорилювання на рівні субстрату, тому що джерелом необхідної енергії є окислення одного з органічних субстратів. ГТФ може потім передавати свою кінцеву фосфатну групу на АДФ з утворенням АТФ, ця оборотна реакція каталізується нуклеозид-дифосфат-кіназою. Потім янтарна кислота дегідрується з утворенням фумарової кислоти, що каталізується сукцинатдегідрогеназою, в молекулі якої з білком міцно (ковалентно) зв’язаний кофермент ФАД. Сам фермент міцно зв’язаний з внутрішньою мітохондріальною мембраною. Оборотна гідратація фумарату, внаслідок чого утворюється яблучна кислота (L-малат), каталізується фумарат-гідратазою (або ще відомий як фумараза). Фумараза високоспецифічна: вона гідратує лише транс-форму подвійного зв’язку фумарату і не діє на його цис-форму, а також ні на цис-, ні на транс-форму монокарбонових ненасичених кислот. В оборотній реакції фумараза проявляє специфічність у відношенні оптичних ізомерів; вона не здатна каталізувати дегідратацію D-малату. Кофермент для фумарази не потрібен. На останній стадій циклу лимонної кислоти НАД-залежна L-малатдегідрогеназа, що міститься в матриксі мітохондрій, каталізує дегідрування L-малату з утворенням ЩОК (оксалоацетату). Рівновага цієї реакції при стандартних умовах (тобто при концентраціях всіх компонентів 1 М та рН 7) сильно здвинута вліво. Але в клітині реакція іде зліва направо, тому що продукт реакції (оксалоацетат) швидко видаляється (витрачається в цитрат-синтазній реакції) і його реальна концентрація в клітині залишається весь час надзвичайно низькою. За один оборот циклу, що складається з восьми ферментативних реакцій, відбувається повне окислення (“згоряння”) однієї молекули ацетил-КоА. Для безперервної роботи циклу необхідне постійне поступання в систему ацетил-КоА, а коферменти (НАД і ФАД), що перейшли у відновлений стан, повинні знову окислятись. Окислення НАД^.Н₂ і ФАД^.Н₂ здійснюється в дихальному ланцюзі. Енергетика процесу: утворилося 4НАД×Н₂ (з них 1НАДФН₂), одній молекулі НАД×Н₂ відповідає три молекули АТФ; 4´3=12молекул АТФ, 1ДАДН₂=2 молекули АТФ, 1 молекула АТФ. Отже: 15 молекул АТФ´2 (бо 2 молекули ПВК)=30молекул АТФ.

Енергетичний ефект повного розщеплення глюкози:

 

 

Пентозний цикл (пентозофосфатний або гексозомонофосфатний шунт).Цей цикл забезпечує організм пентозами, які необхідні для синтезу нуклеїнових кислот тощо. У ссавців активність пентозного циклу відносно висока у печінці, серці, надниркових залозах, ембріональній тканині. Пентозний шлях активно реалізується в еритроцитах людини. Існує група спадкових хвороб людини, при яких активність деяких ферментів цього шляху знижена або взагалі відсутня. У таких хворих спостерігається гемоліз – руйнування еритроцитів з виділенням з них гемоглобіну, що веде до розвитку анемії. Стан різко погіршується під впливом деяких ліків (протималярійних препаратів). В Африці та Азії від цих хвороб страждають мільйони людей. Гексоза, перетворюючись в монофосфат, зразу окислюється в глюконову кислоту. Потім через ряд проміжних стадій утворюються фруктозомонофосфат та фосфогліцериновий альдегід. У подальшому ці продукти піддаються тим же перетворенням, що і при гліколітичному розпаді:

 

Основне призначення пентозофосфатного циклу:

· регенерувати у цитоплазмі відновлювач у формі НАДФ×Н₂, що використовується при синтезі жирних кислот і стероїдів;

· в ньому синтезуються пентози, особливо D-рибоза, яка необхідна для синтезу нуклеїнових кислот;

· участь в утворенні глюкози з СО₂ в темновій фазі фотосинтезу.

Важливе значення ферментів пентозофосфатного циклу полягає в тому, що вони разом з ферментами гліколізу створюють умови для взаємоперетворень 3-х, 4-х, 5-ти, 6-ти і 7-вуглецевих сахарів шляхом оборотного перенесення дво- або тривуглецевих фрагментів (глікоальдегідних або діоксіацетонових груп).

Отже, глюкозофосфатний шлях (пентозофосфатного циклу) є місцем перехрещення метаболічних шляхів, де утворюється значна кількість різних продуктів обміну речовин.

Ферментами фосфоглюконатного шляху може здійснюватися повне окислення глюкозо-6-фосфату до СО₂ за таким рівнянням: