Микроскопические методы исследования - раздел Химия, «ОРГАНИЗАЦИЯ ДЕЯТЕЛЬНОСТИ ЛАБОРАНТА ХИМИКО-БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКОГО АНАЛИЗА» Учебное пособие Основными Задачами Микроскопии Являются Следующие:
...
Основными задачами микроскопии являются следующие:
• Выявление микроорганизмов в различных материалах.
• Ориентировочная идентификация микроорганизмов в исследуемом образце.
• Изучение некоторых морфологических признаков и структур микроорганизмов (например, капсул, жгутиков и т. д.).
• Изучение окрашенных мазков из колоний и чистых культур.
Светлопольная микроскопия позволяет исследовать объекты в проходящем свете в светлом поле. Данный вид микроскопии предназначен для исследования морфологии, размеров клеток, их взаимного расположения, структурной организации клеток и других особенностей. Максимальная разрешающая способность светового микроскопа составляет 0,2 мкм (минимальное расстояние, при котором различимы два объекта). Общее увеличение складывается из произведения увеличений объектива и окуляра. Разрешение микроскопа можно увеличить за счет увеличения коэффициента преломления (иммерсии). В микроскопии применяют несколько иммерсионных систем: масляную, глицериновую, водную.
При работе с микроскопом Биолам производят следующие действия:
1. Осветитель устанавливают под конденсором в специальном гнезде в основании микроскопа. При этом необходимо снять зеркало, поднять до упора конденсор, отвести в сторону дополнительную линзу конденсора. Затем, перемещая патрон осветителя, добиваются наиболее интенсивного и равномерного осветления поля зрения. Для этого используют суховоздушный объектив малого увеличения (×8).
2. В центральной части столика микроскопа устанавливают препарат.
3. Если дальнейшие исследования проводят с суховоздушным объективом (×40), то следует прикрыть диафрагму конденсора, перевести револьвер микроскопа на данное увеличение и опустить вниз тубус микроскопа с помощью микровинта до появления в поле зрения микроскопа исследуемых объектов.
4. Если исследования проводятся с помощью иммерсионной системы (увеличение ×90), то в центр препарата следует нанести каплю иммерсионного масла, осторожно перевести объектив микроскопа вниз таким образом, чтобы дотронуться до предметного стекла. Затем, глядя в окуляр, поднять объектив вверх с помощью макровинта до появления в поле зрения микроорганизмов. С помощью микровинта добиваются максимальной четкости изображения.
5. После просмотра всех препаратов следует снять масло с иммесионного объектива, перевести микроскоп на малое увеличение, снять осветитель, опустить конденсор и тубус микроскопа вниз до упора.
Хранить микроскоп следует в условиях, предотвращающих попадание пыли на линзы.
Фазово-контрастная микроскопия представляет ценность в том, что с ее помощью можно наблюдать живые объекты, которые имеют коэффициенты преломления, близкие к коэффициентам преломления среды. С точки зрения увеличения никакого выигрыша не происходит, однако прозрачные объекты видны более четко, чем в проходящем свете обычного светлопольного микроскопа. При отсутствии специального микроскопа обычный световой может быть оснащен специальным фазово-контрастным устройством, которое переводит фазовые изменения световых волн, которые проходят через объект, в амплитудные. В результате этого живые прозрачные объекты становятся контрастными и видными в поле зрения.
С помощью фазово-контрастной микроскопии изучают форму, размеры, взаимное расположение клеток, их подвижность, размножение, прорастание спор микроорганизмов и т. д.
Темнопольная микроскопия основана на освещении объекта косыми лучами света. При таком освещении лучи не попадают в объектив, поэтому поле зрения выглядит темным. Если в исследуемом препарате содержатся клетки микроорганизмов, то косые лучи отражаются от их поверхности, отклоняются от своего первоначального направления и попадают в объектив. На интенсивно черном фоне видны сияющие объекты. Такое освещение препарата достигается использованием специального темнопольного конденсора, которым заменяют обычный конденсор светлопольного микроскопа.
При микроскопировании в темном поле можно увидеть объекты, величина которых измеряется сотыми долями микрометра, что находится за пределами разрешающей способности обычного светлопольного микроскопа. Однако наблюдение за объектами в темном поле позволяет исследовать только контуры клеток и не дает возможности рассмотреть их внутреннюю структуру.
Люминесцентная микроскопия основана на способности ряда веществ биологического происхождения или некоторых красителей светиться под действием падающего на них света. Микроорганизмы, содержащие хлорофилл, витамин В12, алкалоиды, некоторые антибиотики, обладают первичной люминесценцией. Клетки микроорганизмов, в которых люминесценция слабо выражена или отсутствует, обрабатывают специальными красителями – флуорохромами (акридиновый оранжевый, примулин, родамин и др.) в виде сильно разбавленных водных растворов: 1:500 – 1:100000. Такие растворы слабо токсичны, что дает возможность изучать неповрежденную клетку. В зависимости от химического состава клеточные структуры в разной степени адсорбируют красители и люминесцируют различным образом. Кроме того, флуорохромы неодинаково адсорбируются живыми и мертвыми клетками. Это позволяет использовать данный вид микроскопии для цитологических и иммунологических исследований, определения жизнедеятельности клеток, изучения микроорганизмов в почве, воде и т. д. Проведение люминесцентной микроскопии предполагает использование специальных микроскопов (например, МЛ-2).
Разработанные на основе люминесцентной микроскопии иммуно-флюоресцентные методы используются для визуализации иммуно-химических реакций, основанных на специфическом взаимодействии антигена изучаемого объекта и меченых флюоресцентными красителями антител.
Электронная микроскопия позволяет обнаружить объекты, которые не разрешаются при использовании световых или ультрафиолетовых лучей. Короткая длина волны электронов, которая уменьшается в прямой зависимости от подаваемого ускоряющего напряжения, позволяет различить объекты размером 0,5 – 1,0 нм (или большие чем 0,0002 мкм). В современных электронных микроскопах достигается увеличение на экране или пленке 5000 – 15000. Благодаря столь высокому разрешению становится возможным выявление деталей бактериальных структур. Например, с помощью напыления солей тяжелых металлов, окружающих бактерию и проникающих в поверхностные неровности, получают контрастирование за счет дифференциальной задержки электронов. Этот эффект получил название негативного контрастирования.
Детали внутреннего строения выявляют на срезах бактерий, залитых в полимерный материал. Предварительно бактерии фиксируют и обрабатывают солями тяжелых металлов для получения необходимого контраста. Часть электронов проходит через образец, а другие рассеиваются компонентами структуры, в результате чего формируется изображение на экране или пленке. Электронный микроскоп, в котором изображение формируется благодаря прохождению (просвечиванию) электронов через образец, называют просвечивающим (или трансмиссионным).
В сканирующем (растровом) микроскопе, как следует из названия, пучок электронов быстро сканирует поверхность образца, вызывая излучение, которое формирует изображение на светящемся экране.
Сканирующий микроскоп дает картину поверхностей и позволяет получать сразу трехмерное изображение.
При методе сколов (замораживании–оттаивании) проводят изучение внутреннего строения клеточных мембран. Клетки замораживают при температуре жидкого азота ( – 196 °С) в присутствии криопротектора и используют для получения сколов. Плоскости скола проходят через гидрофобную середину двойного слоя липидов. Обнаженную внутреннюю поверхность мембран оттеняют платиной.
Полученные реплики изучают в сканирующем электронном микроскопе.
Помимо вышеуказанных разработаны также и другие методы визуализации:
• компъютерная интерференционная микроскопия позволяет получить высококонтрастное изображение при наблюдении субклеточных структур;
• лазерная конфокальная микроскопия дает возможность получить отчетливое изображение и наблюдать объекты в фокусе по всему полю. При сочетании с компъютерной техникой возможна пространственная реконструкция изучаемого объекта;
• рентгеновская микроскопия, позитронная эмиссионная томография позволяют наблюдать объекты не в вакууме, а в обычных условиях.
Все темы данного раздела:
И.С.Корешкова
«ОРГАНИЗАЦИЯ ДЕЯТЕЛЬНОСТИ ЛАБОРАНТА ХИМИКО-БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКОГО АНАЛИЗА»
Учебное пособие
для студентов СПО
Техника безопасности в химической лаборатории
1. Работать одному в лаборатории строго запрещается.
2. Нельзя работать в лаборатории без халата. Он должен быть сшит только из хлопчатобумажной ткани.
3.На лабора
Правила поведения при несчастных случаях
1. При ожоге концентрированными кислотами необходимо промыть
обожженное место струей воды, а затем — 2 — 3%- ным раствором соды.
2. При ожоге едкими щелочами постр
Требования к помещению химической лаборатории
Помещение лаборатории должно быть по возможности просторным и светлым. Лабораторию не следует устраивать в таком месте, где по тем или иным причинам происходит вибрация здания, так как это мешает р
Требования к помещению бактериологической лаборатории.
Помещение бактериологической лаборатории должно быть светлым и просторным. Необходимо исключить возможность сквозняков. Специальное место отводится для окраски препаратов. Обязательным оборудов
Организация рабочего места в лаборатории.
Правильная организация рабочего места — залог продуктивной работы лаборанта, от которой зависит точность и надежность выполняемых анализов. Чувство комфортности, устранение физического неудобства и
Химическая посуда, используемая в анализе
Химическую посуду, предназначенную для работы в аналитической лаборатории, можно условно разделить на две группы: посуда общего назначения и посуда специального назначения. К посуде общего назначен
Крепление бюретки для титрования
Бюксы стеклянные(рис.4)с притертыми крышками служат длявзвешивания твердых и жидких веществ, а также для их хранения.
Эрленмейера
Колбы для отсасывания (Бунзена) и воронки для фильтрования (Бюхнера) (рис.10).Колба Бунзена—толстостенная колба конической формы с отростком в верхней части (для соединения с
Центрифугата от осадка
Пипетки мерные(градуированные пипетки и пипетки Мора)длинные узкие трубки с расширением в середине (рис. 15). На узкой верхней части имеется специальная метка. Мерн
Пипеткой
Стеклянные палочки для перемешивания(рис.20).Обычнаядлина таких палочек 15 - 20 см, диаметр около 4 мм. На конце, который немного оттянут, имеется небольш
Химические
технический угловой.
Холодильники(рис.25)служат для охлаждения и конденсации пар
Работа с платиновой посудой
В аналитической практике широко используется платиновая посуда (тигли, чашки и т. д.). Но платина — драгоценный металл, поэтому при работе с платиновой посудой следует соблюдать спе
Правила работы с платиновой посудой
1.Не забывайте, что платина — очень мягкий металл. Поэтому при работе с платиновой посудой требуется особая осторожность, так как даже от незначительного усилия она легко деформируе
Требования к чистоте химической посуды
Приступать к выполнению химического анализа можно только тогда, когда под рукой у химика-аналитика будет необходимый набор химической посуды. Обязательно и другое требование: посуда всегда должна б
Химические методы очистки посуды
Мытье хромовой смесью. Очень часто в лабораториях для мытья посуды применяют хромовую смесь, так как хромовокислые соли в кислом растворе являются сильными окислителями. Для приготовления хромовой
Смешанные способы мытья посуды
Наилучшим примером сочетания различных способов очистки является мытье бюреток. Процесс мытья бюретки очень кропотливый и трудоемкий.
Сначала бюретку, если это необходимо, тщательно протир
Требования к чистоте бактериологической посуды
Посуда для бактериологических работ должна быть чистой, а для многих исследований — и стерильной, так как использование загрязненной, плохо вымытой посуды может привести к получению неправильных ре
Сушка химической посуды.
Иногда вымытая посуда должна быть хорошо высушена. Сухая посуда нужна, когда работу необходимо проводить в отсутствие следов влаги (очень многие органические реакции).
Различают: а) методы
Методы сушки при нагревании
Сушка горячим воздухом. Для ускорения сушки можно обдувать посуду горячим воздухом. Иногда посуду сушат над электроплиткой или над коптящим «холодным» пламенем горелки.
Нагревание следует
Виды стерилизации бактериологической посуды.
Стерилизация в отличие от дезинфекции предусматривает в стерилизуемом объекте уничтожение всех вегетативных и споровых, патогенных и непатогенных микроорганизмов. Стерилизацию производят различными
Тиндализация.
Тиндализация — дробная стерилизация с применением температуры ниже 100°С, предложенная Тиндалем. Прогревание стерилизуемого материала производят в водяной бане, снабженной терморегулятором, по часу
Дезинфекция
Уничтожение патогенных микробов в объектах внешней среды называется дезинфекцией. В микробиологических лабораториях дезинфекционные мероприятия используются очень широко. Оканчивая работу с заразны
Приборы, используемые в химическом анализе
Баня водяная(рис. 29) -применяется для нагревания растворов до100°С. Бани, бывают, различных конструкций (круглая или четырехугольная) со съемными кольцами для разм
Аналитические весы
Основным и наиболее точным измерительным инструментом лаборатории химических методов анализа являются аналитические весы. Они позволяют взвешивать вещества с точностью до 0,0001 - 0,0002 г (при мак
Основные правила при работе с весами модели ВЛР-200
1.Приступая к взвешиванию, постарайтесь удобно сесть перед весами. От этого во многом зависит точность взвешивания. Сидеть нужно строго напротив весов, но, не напрягаясь, иначе вы быстро устанете.
И ПРАВИЛА РАБОТЫ В НЕЙ
Микробиологические лаборатории обычно снабжены следующим оборудованием:
1. Биологическими иммерсионными микроскопами с дополнительными приспособлениями и наборами необходимых красителей.
Микробиологические боксы
Бокс (боксированные помещения или помещения, оснащенные боксами биологической безопасности) - защищенное от пыли рабочее место, оборудованное установкой для горизонтального или вертикального ламина
Обслуживание и контроль
рН-метр градуируют в соответствии с инструкциями изготовителя, используя не менее двух стандартных буферных растворов, не раньше, чем за день до применения. Значения рН стандартных растворов должны
Питательные среды.
Известно значительное количество питательных сред, используемых для культивирования и поддержания (сохранения) микроорганизмов.
Питательной средой в микробиологии называют среды, содержащи
Основы приготовления питательных сред.
Питательные среды служат для выделения из исследуемого материала чистых культур микробов и изучения их свойств. Питательные среды являются основой бактериологических работ, нередко определяя своим
Техника посева микроорганизмов в жидкие питательные среды.
Посев микроорганизмов осуществляется бактериологической петлей. Отбор клеток микроорганизмов производят следующим образом. В правую руку берут петлю и стерилизуют ее нагреванием в пламени спиртовки
Техника посева микроорганизмов на агаризованную среду
Посев на скошенный агар в пробирках проводят следующим образом. Клетки микроорганизмов отбирают бактериологической петлей (как описано выше) и вводят петлю в пробирку со скошенной агаризованной сре
Техника культивирования анаэробных микроорганизмов
Граница между аэробными и анаэробными микроорганизмами является относительно условной. Хотя облигатными анаэробами обычно считают бактерии, рост которых невозможен в присутствии растворенного кисло
Поддержание (хранение) культур микроорганизмов.
Основная задача хранения культур – поддержание их жизнеспособности, сохранение стабильности таксономически важных признаков, а также определенных свойств, представляющих интерес для науки и практик
Различных методов их хранения
Род
бактерий
Частота пере-
севов,
месяцы
Время выживания, годы
Под мине-
ральным
маслом
В
стерил
Морфология бактерий, структура и химический состав бактериальной клетки
Морфологические типы бактерий, в сравнении с высшими организмами, немногочисленны. Клетки большинства бактерий имеют сферическую, цилиндрическую или извитую форму, но существует небольшая группа ми
Эндоспоры бактерий
Спорообразование свойственно бактериям нескольких родов, к числу которых относятся Bacillus, Clostridium, Sporosarcina, Desufotomaculum, etc. Обычно внутри каждой клетки образуется одна спора, кото
Капсула бактерий
При определенных условиях культивирования многие виды бактерий различных таксономических групп образуют слизистое вещество, формирующее вокруг клетки структуру, которая называется капсулой. Колонии
Цитоплазматические включения
У многих бактерий, выращиваемых в определенных условиях, в результате обменных процессов в цитоплазме образуются отложения, которые называют включениями. Среди них – отложения жира, поли-β-гид
Подвижность бактерий
Поступательное движение бактерий за счет жгутиков можно наблюдать во влажных препаратах, применяя в большинстве случаев светлопольный микроскоп. Наиболее эффективно наблюдение за подвижностью в тем
Количественный учет микроорганизмов.
О росте микроорганизмов в естественных субстратах или питательных средах судят по количеству клеток в единице объема. Данная величина носит название титра клеток (или фаговых частиц). Выбор метода
Подсчет клеток на мембранных фильтрах
Этот метод используют для подсчета количества микроорганизмов в жидких материалах с низкой плотностью клеток. Метод основан на концентрировании клеток на поверхности фильтра в результате фильтрации
Определение количества микробных клеток нефелометрическим методом
Этот метод широко применяется в микробиологических исследованиях, так как позволяет достаточно точно и сравнительно быстро определить количество клеток в культуральной среде. В основе метода лежит
Микроскопия микроорганизмов в окрашенном виде
Для изучения микроорганизмов в окрашенном виде на предметном стекле делают мазок, высушивают, фиксируют его и после этого окрашивают. Приготовление мазков. Исследуемый материал распределяют тонким
V. Требования, предъявляемые к методам анализа.
1.Правильность – параметр, характеризующий близость экспериментальных и истинных значений измеряемой величины. Она характеризуется систематической погрешностью, которая зави
Отбор проб
Перед исследованием вещество предварительно подготавливают к анализу. Отбор средней пробы является одной из важнейших подготовительных операций. Его цель – получить относительно небольшое количеств
Отбор проб продуктов питания
По физическим свойствам продукты питания делятся на две основные группы: жидкие и твердые.
Последние по глубине проникновения ТХВ могут быть подразделены на плотные (хлеб, мясо, рыба и т.
Общие принципы подготовки проб к анализу
Пробы, поступающие в лабораторию, осматривают, вскрывают упаковку и регистрируют в журнале в соответствии с сопроводительной документацией, удостоверяющей объект. При этом в лабораторном журнале от
Физический метод анализа
Эти методы основаны на использовании зависимости физических свойств вещества от их химического состава. Наиболее распространены следующие физические методы анализа.
1. Спектраль
Физические свойства жира
Жир
Коэффициент
преломления
Плотность,
г/см³
Подсолнечное
масло
1,4748
0,91
Физико-химический метод анализа
Особенно велика их роль в экологическом мониторинге. Лишь современные методы анализа, как спектроскопические, электрохимические, хроматографические и другие (среди них отметим масс– спектрометрию),
Фотометрический метод анализа. Фотометрия
Фотометрический метод анализа (Фотометрия), совокупность методов абсорбционного спектрального анализа, основанных на избирательном поглощении электромагнитного излучения в видимой,
Методы определения рН
Для определения значения pH растворов широко используют несколько методик. Водородный показатель можно приблизительно оценивать с помощью индикаторов, точно измерять pH-метром или определять аналит
Техника приготовления растворов.
Независимо от того, какие (поточности) приготовляют растворы, применять следует только чистые растворители. Если растворителем служит вода, то можно применять только дистиллированную или деминерали
Расчеты при приготовлении водных растворов
Приблизительные растворы. При приготовлении приблизительных растворов количества веществ, которые должны быть взяты для этого, вычисляют с небольшой точностью. Атомные веса элемент
Растворы солей
Приблизительные растворы. Растворы солей готовят, как указано выше. Готовый раствор или отфильтровывают, или дают ему отстояться от нерастворимых в воде примесей,
Растворы щелочей
Приблизительные растворы. Наиболее употребительными растворами щелочей в лабораторной практике являются растворы едкого натра NaOH. Растворы едкого кали KOH готовят редко, растворы
Растворы кислот
Приблизительные растворы. В большинстве случаев в лаборатории приходится пользоваться соляной, серной и азотной кислотами. Кислоты имеются в продаже в виде концентрированных раство
Фиксаналы
Для быстрого приготовления точных растворов различных веществ (кислот, щелочей и солей) удобно применять фиксаналы. Это — заранее приготовленные и запаянные в стеклянных ампулах точно отвешенны
Индикаторы
Индикаторами называют вещества, применяемые при объемно-аналитических определениях и в некоторых других случаях для определения конца реакции.
Момент окончания реакции определяют или по из
Обесцвечивание растворов.
Растворы многих, преимущественно органических, веществ, приготовленные из технических препаратов, часто имеют окраску. Она вызывается присутствием в растворе примесей, главным образом смолистого ха
Новости и инфо для студентов