Количественный учет микроорганизмов. - раздел Химия, «ОРГАНИЗАЦИЯ ДЕЯТЕЛЬНОСТИ ЛАБОРАНТА ХИМИКО-БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКОГО АНАЛИЗА» Учебное пособие О Росте Микроорганизмов В Естественных Субстратах Или Питательных Средах Судя...
О росте микроорганизмов в естественных субстратах или питательных средах судят по количеству клеток в единице объема. Данная величина носит название титра клеток (или фаговых частиц). Выбор метода для определения числа клеток зависит от цели исследования, свойств питательной среды или субстрата, а также особенностей роста и морфологии микроорганизмов. Существуют методы, позволяющие определять общее количество микроорганизмов в исследуемом материале или только количество жизнеспособных клеток. С другой стороны, методы подсчета могут быть разделены на методы прямого счета (микроскопические), методы подсчета колоний (методы высева) и методы оптические (нефелометрия, спектрофотометрия и т. д.).
Чтобы определить общее количество микроорганизмов в различных материалах, применяют методы прямого подсчета клеток под микроскопом (в специальных счетных камерах, в фиксированных мазках, на мембранных фильтрах). Такие методы широко применяются в исследованиях микрофлоры воды и почвы. Эффективность такого подсчета, как правило, в 10 – 10000 раз выше, чем при подсчете методом высева, так как многие микроорганизмы не растут на питательных средах и учесть их можно только под микроскопом. Метод дает возможность получить дополнительную информацию о размерах и морфологии изучаемого объекта. Кроме того, прямой подсчет микроорганизмов производится быстрее, более дешев, оборудование для его осуществления имеется в каждой лаборатории.
1. Подсчет клеток в окрашенных препаратах (метод Виноградского–Брида)
Преимущество метода заключается в том, что фиксированные окрашенные препараты хорошо сохраняются и подсчет можно проводить в удобное для исследователя время.
Техника: а) на хорошо обезжиренном предметном стекле маркером рисуют прямоугольник строго известной площади (2, 4 или 6 см²),
б) на стекло в прямоугольник микропипеткой (или автоматической пипеткой) наносят определенный объем суспензии клеток (0,01; 0,02 или 0,03 мл),
в) суспензию равномерно распределяют петлей по всей площади прямоугольника,
г) препарат высушивают на воздухе и фиксируют 15 мин 96 % этанолом,
д) проводят окрашивание фуксином Циля 1 – 2 мин,
е) краситель сливают, препарат промывают водой, последовательно погружая стекло в 5 – 6 стаканов с водой) и высушивают на воздухе.
Количество клеток микроорганизмов подсчитывают, используя иммерсионный объектив, в квадратах окулярной сетки, которую помещают в окуляр между собирательной и глазной линзами. При отсутствии сетки подсчитывают число клеток в поле зрения микроскопа.
Площадь квадрата сетки или поля зрения определяют с помощью объект микрометра. Последний помещают на столик микроскопа вместо препарата и при том же увеличении, при котором проводили подсчет, определяют длину стороны квадрата окулярной сетки или диаметр поля зрения.
Для получения достоверных результатов клетки микроорганизмов рекомендуется подсчитывать не менее чем в 50 – 100 полях зрения, а общее количество подсчитанных клеток не должно быть менее 600.
Количество клеток микроорганизмов, содержащихся в 1 мл исследуемого материала, вычисляют по формуле:
A x S
M = x n,
V x s
где М – количество клеток в 1 мл;
А – среднее число клеток в квадрате окулярной сетки (поле зрения);
s и S – площадь квадрата окулярной сетки (поля зрения) и приготовленного мазка в мкм² соответственно;
V – объем нанесенной на стекло суспензии в мл;
n– разведение исследуемого материала.
Все темы данного раздела:
И.С.Корешкова
«ОРГАНИЗАЦИЯ ДЕЯТЕЛЬНОСТИ ЛАБОРАНТА ХИМИКО-БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКОГО АНАЛИЗА»
Учебное пособие
для студентов СПО
Техника безопасности в химической лаборатории
1. Работать одному в лаборатории строго запрещается.
2. Нельзя работать в лаборатории без халата. Он должен быть сшит только из хлопчатобумажной ткани.
3.На лабора
Правила поведения при несчастных случаях
1. При ожоге концентрированными кислотами необходимо промыть
обожженное место струей воды, а затем — 2 — 3%- ным раствором соды.
2. При ожоге едкими щелочами постр
Требования к помещению химической лаборатории
Помещение лаборатории должно быть по возможности просторным и светлым. Лабораторию не следует устраивать в таком месте, где по тем или иным причинам происходит вибрация здания, так как это мешает р
Требования к помещению бактериологической лаборатории.
Помещение бактериологической лаборатории должно быть светлым и просторным. Необходимо исключить возможность сквозняков. Специальное место отводится для окраски препаратов. Обязательным оборудов
Организация рабочего места в лаборатории.
Правильная организация рабочего места — залог продуктивной работы лаборанта, от которой зависит точность и надежность выполняемых анализов. Чувство комфортности, устранение физического неудобства и
Химическая посуда, используемая в анализе
Химическую посуду, предназначенную для работы в аналитической лаборатории, можно условно разделить на две группы: посуда общего назначения и посуда специального назначения. К посуде общего назначен
Крепление бюретки для титрования
Бюксы стеклянные(рис.4)с притертыми крышками служат длявзвешивания твердых и жидких веществ, а также для их хранения.
Эрленмейера
Колбы для отсасывания (Бунзена) и воронки для фильтрования (Бюхнера) (рис.10).Колба Бунзена—толстостенная колба конической формы с отростком в верхней части (для соединения с
Центрифугата от осадка
Пипетки мерные(градуированные пипетки и пипетки Мора)длинные узкие трубки с расширением в середине (рис. 15). На узкой верхней части имеется специальная метка. Мерн
Пипеткой
Стеклянные палочки для перемешивания(рис.20).Обычнаядлина таких палочек 15 - 20 см, диаметр около 4 мм. На конце, который немного оттянут, имеется небольш
Химические
технический угловой.
Холодильники(рис.25)служат для охлаждения и конденсации пар
Работа с платиновой посудой
В аналитической практике широко используется платиновая посуда (тигли, чашки и т. д.). Но платина — драгоценный металл, поэтому при работе с платиновой посудой следует соблюдать спе
Правила работы с платиновой посудой
1.Не забывайте, что платина — очень мягкий металл. Поэтому при работе с платиновой посудой требуется особая осторожность, так как даже от незначительного усилия она легко деформируе
Требования к чистоте химической посуды
Приступать к выполнению химического анализа можно только тогда, когда под рукой у химика-аналитика будет необходимый набор химической посуды. Обязательно и другое требование: посуда всегда должна б
Химические методы очистки посуды
Мытье хромовой смесью. Очень часто в лабораториях для мытья посуды применяют хромовую смесь, так как хромовокислые соли в кислом растворе являются сильными окислителями. Для приготовления хромовой
Смешанные способы мытья посуды
Наилучшим примером сочетания различных способов очистки является мытье бюреток. Процесс мытья бюретки очень кропотливый и трудоемкий.
Сначала бюретку, если это необходимо, тщательно протир
Требования к чистоте бактериологической посуды
Посуда для бактериологических работ должна быть чистой, а для многих исследований — и стерильной, так как использование загрязненной, плохо вымытой посуды может привести к получению неправильных ре
Сушка химической посуды.
Иногда вымытая посуда должна быть хорошо высушена. Сухая посуда нужна, когда работу необходимо проводить в отсутствие следов влаги (очень многие органические реакции).
Различают: а) методы
Методы сушки при нагревании
Сушка горячим воздухом. Для ускорения сушки можно обдувать посуду горячим воздухом. Иногда посуду сушат над электроплиткой или над коптящим «холодным» пламенем горелки.
Нагревание следует
Виды стерилизации бактериологической посуды.
Стерилизация в отличие от дезинфекции предусматривает в стерилизуемом объекте уничтожение всех вегетативных и споровых, патогенных и непатогенных микроорганизмов. Стерилизацию производят различными
Тиндализация.
Тиндализация — дробная стерилизация с применением температуры ниже 100°С, предложенная Тиндалем. Прогревание стерилизуемого материала производят в водяной бане, снабженной терморегулятором, по часу
Дезинфекция
Уничтожение патогенных микробов в объектах внешней среды называется дезинфекцией. В микробиологических лабораториях дезинфекционные мероприятия используются очень широко. Оканчивая работу с заразны
Приборы, используемые в химическом анализе
Баня водяная(рис. 29) -применяется для нагревания растворов до100°С. Бани, бывают, различных конструкций (круглая или четырехугольная) со съемными кольцами для разм
Аналитические весы
Основным и наиболее точным измерительным инструментом лаборатории химических методов анализа являются аналитические весы. Они позволяют взвешивать вещества с точностью до 0,0001 - 0,0002 г (при мак
Основные правила при работе с весами модели ВЛР-200
1.Приступая к взвешиванию, постарайтесь удобно сесть перед весами. От этого во многом зависит точность взвешивания. Сидеть нужно строго напротив весов, но, не напрягаясь, иначе вы быстро устанете.
И ПРАВИЛА РАБОТЫ В НЕЙ
Микробиологические лаборатории обычно снабжены следующим оборудованием:
1. Биологическими иммерсионными микроскопами с дополнительными приспособлениями и наборами необходимых красителей.
Микробиологические боксы
Бокс (боксированные помещения или помещения, оснащенные боксами биологической безопасности) - защищенное от пыли рабочее место, оборудованное установкой для горизонтального или вертикального ламина
Обслуживание и контроль
рН-метр градуируют в соответствии с инструкциями изготовителя, используя не менее двух стандартных буферных растворов, не раньше, чем за день до применения. Значения рН стандартных растворов должны
Питательные среды.
Известно значительное количество питательных сред, используемых для культивирования и поддержания (сохранения) микроорганизмов.
Питательной средой в микробиологии называют среды, содержащи
Основы приготовления питательных сред.
Питательные среды служат для выделения из исследуемого материала чистых культур микробов и изучения их свойств. Питательные среды являются основой бактериологических работ, нередко определяя своим
Техника посева микроорганизмов в жидкие питательные среды.
Посев микроорганизмов осуществляется бактериологической петлей. Отбор клеток микроорганизмов производят следующим образом. В правую руку берут петлю и стерилизуют ее нагреванием в пламени спиртовки
Техника посева микроорганизмов на агаризованную среду
Посев на скошенный агар в пробирках проводят следующим образом. Клетки микроорганизмов отбирают бактериологической петлей (как описано выше) и вводят петлю в пробирку со скошенной агаризованной сре
Техника культивирования анаэробных микроорганизмов
Граница между аэробными и анаэробными микроорганизмами является относительно условной. Хотя облигатными анаэробами обычно считают бактерии, рост которых невозможен в присутствии растворенного кисло
Поддержание (хранение) культур микроорганизмов.
Основная задача хранения культур – поддержание их жизнеспособности, сохранение стабильности таксономически важных признаков, а также определенных свойств, представляющих интерес для науки и практик
Различных методов их хранения
Род
бактерий
Частота пере-
севов,
месяцы
Время выживания, годы
Под мине-
ральным
маслом
В
стерил
Микроскопические методы исследования
Основными задачами микроскопии являются следующие:
• Выявление микроорганизмов в различных материалах.
• Ориентировочная идентификация микроорганизмов в исследуем
Морфология бактерий, структура и химический состав бактериальной клетки
Морфологические типы бактерий, в сравнении с высшими организмами, немногочисленны. Клетки большинства бактерий имеют сферическую, цилиндрическую или извитую форму, но существует небольшая группа ми
Эндоспоры бактерий
Спорообразование свойственно бактериям нескольких родов, к числу которых относятся Bacillus, Clostridium, Sporosarcina, Desufotomaculum, etc. Обычно внутри каждой клетки образуется одна спора, кото
Капсула бактерий
При определенных условиях культивирования многие виды бактерий различных таксономических групп образуют слизистое вещество, формирующее вокруг клетки структуру, которая называется капсулой. Колонии
Цитоплазматические включения
У многих бактерий, выращиваемых в определенных условиях, в результате обменных процессов в цитоплазме образуются отложения, которые называют включениями. Среди них – отложения жира, поли-β-гид
Подвижность бактерий
Поступательное движение бактерий за счет жгутиков можно наблюдать во влажных препаратах, применяя в большинстве случаев светлопольный микроскоп. Наиболее эффективно наблюдение за подвижностью в тем
Подсчет клеток на мембранных фильтрах
Этот метод используют для подсчета количества микроорганизмов в жидких материалах с низкой плотностью клеток. Метод основан на концентрировании клеток на поверхности фильтра в результате фильтрации
Определение количества микробных клеток нефелометрическим методом
Этот метод широко применяется в микробиологических исследованиях, так как позволяет достаточно точно и сравнительно быстро определить количество клеток в культуральной среде. В основе метода лежит
Микроскопия микроорганизмов в окрашенном виде
Для изучения микроорганизмов в окрашенном виде на предметном стекле делают мазок, высушивают, фиксируют его и после этого окрашивают. Приготовление мазков. Исследуемый материал распределяют тонким
V. Требования, предъявляемые к методам анализа.
1.Правильность – параметр, характеризующий близость экспериментальных и истинных значений измеряемой величины. Она характеризуется систематической погрешностью, которая зави
Отбор проб
Перед исследованием вещество предварительно подготавливают к анализу. Отбор средней пробы является одной из важнейших подготовительных операций. Его цель – получить относительно небольшое количеств
Отбор проб продуктов питания
По физическим свойствам продукты питания делятся на две основные группы: жидкие и твердые.
Последние по глубине проникновения ТХВ могут быть подразделены на плотные (хлеб, мясо, рыба и т.
Общие принципы подготовки проб к анализу
Пробы, поступающие в лабораторию, осматривают, вскрывают упаковку и регистрируют в журнале в соответствии с сопроводительной документацией, удостоверяющей объект. При этом в лабораторном журнале от
Физический метод анализа
Эти методы основаны на использовании зависимости физических свойств вещества от их химического состава. Наиболее распространены следующие физические методы анализа.
1. Спектраль
Физические свойства жира
Жир
Коэффициент
преломления
Плотность,
г/см³
Подсолнечное
масло
1,4748
0,91
Физико-химический метод анализа
Особенно велика их роль в экологическом мониторинге. Лишь современные методы анализа, как спектроскопические, электрохимические, хроматографические и другие (среди них отметим масс– спектрометрию),
Фотометрический метод анализа. Фотометрия
Фотометрический метод анализа (Фотометрия), совокупность методов абсорбционного спектрального анализа, основанных на избирательном поглощении электромагнитного излучения в видимой,
Методы определения рН
Для определения значения pH растворов широко используют несколько методик. Водородный показатель можно приблизительно оценивать с помощью индикаторов, точно измерять pH-метром или определять аналит
Техника приготовления растворов.
Независимо от того, какие (поточности) приготовляют растворы, применять следует только чистые растворители. Если растворителем служит вода, то можно применять только дистиллированную или деминерали
Расчеты при приготовлении водных растворов
Приблизительные растворы. При приготовлении приблизительных растворов количества веществ, которые должны быть взяты для этого, вычисляют с небольшой точностью. Атомные веса элемент
Растворы солей
Приблизительные растворы. Растворы солей готовят, как указано выше. Готовый раствор или отфильтровывают, или дают ему отстояться от нерастворимых в воде примесей,
Растворы щелочей
Приблизительные растворы. Наиболее употребительными растворами щелочей в лабораторной практике являются растворы едкого натра NaOH. Растворы едкого кали KOH готовят редко, растворы
Растворы кислот
Приблизительные растворы. В большинстве случаев в лаборатории приходится пользоваться соляной, серной и азотной кислотами. Кислоты имеются в продаже в виде концентрированных раство
Фиксаналы
Для быстрого приготовления точных растворов различных веществ (кислот, щелочей и солей) удобно применять фиксаналы. Это — заранее приготовленные и запаянные в стеклянных ампулах точно отвешенны
Индикаторы
Индикаторами называют вещества, применяемые при объемно-аналитических определениях и в некоторых других случаях для определения конца реакции.
Момент окончания реакции определяют или по из
Обесцвечивание растворов.
Растворы многих, преимущественно органических, веществ, приготовленные из технических препаратов, часто имеют окраску. Она вызывается присутствием в растворе примесей, главным образом смолистого ха
Новости и инфо для студентов