содержание стр.Список сокращенийвведение1. обзор литературы1. Использование Ti-плазмид агробактерий в генетической инженерии1. Краткая характеристика Agrobacterium tumefaciens2. Cоздание векторов на основе Ti-плазмид3. Процессинг тДНК в бактериальной клетке и ее перенос в клетки растений4. Разработка система трансформаций растений с помощью Agrobacterium tumefaciens5. Проблема сохранения чужеродных генов, перенесенных в растение6. Анализ экспрессии чужеродных генов в трансформированных растениях2. Использование метода генетической инженерии для трансформации однодольных растений1. Краткие характеристики ряски3. Сигнальные молекулы, их способность индуцировать процессинг тДНК2. Материалы и методы1. Материалы1. Оборудование2.1.2. Бактериальные штаммы и плазмиды3. Растения4. Среды микробиологические для культивирования растений5. Другие растворы6. Ферменты, используемые в генной инженерии7. Антибиотики2. Методы1. Инкубация Agrobacterium tumefaciens с экссудатами тканей растений2. Выделение тотальной ДНК Agrobacterium tumefaciens2.2.3. Блод-гибридизация тДНК по Саузерну4. Трансформация клеток Esherichia coli3. результаты4. обсуждение5. выводылитературыприложениеСПИСОК СОкРАЩЕНИЙ НУК нафтиуксусная кислота БАП бензиламинопурин MS LB тДНК Ар ампицилин Cs цефотоксин ВВЕДЕНИЕ Актуальность работы Свойство бактерий вида Agrobacterium tumefaciens вызывать у растений корончато-галловую болезнь связано с присутствием в их клетках крупных 95-156 мДа конъюгированных Ti-плазмид от англ. tumor-inducing вызывающий опухоль.
В процессе идентифицирования растений часть генетического материала Ti-плазмид тДНК от англ. transferred DNA передаваемая перемещается в растительные клетки и интегрируется в хромосомы, оставаясь частью наследственного материала. Гены тДНК экспрессируются в трансформарованных растительных клетках, нарушают их фитогормональный баланс и определяют синтез специфических соединений.
Таким образом, агробактерии являются природными генными инженерами, осуществляющий поразительный по филогенетической дальности перенос генетической информации.
На основе агробактерий сконструированы эффективные векторные системы для генетической инженерии растений.
Агробактириальная трансформация происходит в результате сложного процесса взаимодействия между бактериальными и растительными клетками.
В этом процессе одной из решающих стадий является рецепция агробактериями особых сигнальных молекул, присутствующих в экссудатах поврежденных тканей растений. Сигнальные молекулы индуцируют экспрессию генов области vir агробактериальных Ti-плазмид, контролирующих вырезание тДНК и ее перенос в клетки растений.
Агробактерильная трансформация наблюдается у широкого круга голосеменных и двудольных растений, однако, она отмечена лишь у весьма незначительного числа однодольных растений. Одной из причин ограничений агробактериальной трансформации однодольных считается присутствие в их клетках сигнальных молекул, индуцирующих процессинг и перенос тДНК. Цель работы В настоящее время имеются противоречивые данные относительно наличия таких сигнальных молекул у однодольных растений.
В связи с этим, целью данной работы был анализ ряски на присутствие у них сигнальных молекул, индуцирующих процессинг тДНК. 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 1.
Использование Ti-плазмид агробактерий в генетической инженерии растений 1.
Мутации в вирулентных генах агробактерий. Ранние этапы взаимодействия агробактерий с растениями, так же как хемо... В результате транспозонного мутагенеза этих областей получают авирулен... бинарные векторы. Схемы А и бинарной Б векторных систем.
Причем кольцевая форма, образующаяся за счет гомологичной рекомбинации... Появление этого интермедиата обнаруживается через восемь часов после д... Формы процессированной тДНК. . 1.1.4.
Большинство первоначальных экспериметнов по генетической трансформации... Однако, все перечисленные методы пригодны только для трансформации рас... Markis, 1987. В большинстве случаев последовательности чужеродной ДНК встраиваются в... В связи с этим во многих случах была получена контрансформация физичес...
Schilperoort, 1987 Gorman et al 1982. Анализ экспрессии чужеродных генов в трансформированных растениях. . Кроме того, изучают фенотипические признаки такие как, устойчивость к ... Для качественного и количественного анализа экспрессии чужеродных гено...
Использование метода генетической инженерии для трансформации однодольных растений 1.2.1.
Семейство рясковые, Lemnaceae включает 6 родов и 30 видов, встречающих... В результате гидрофильной эволюции они достигли крайней степени редукц... Рясковые водные, свободноплавающие, большей частью многолетние травяни... Этот мембранный хеморецептор после принятия внешнего сигнала активируе... Кроме позитивной регуляторной системы vir A vir G, локализованной на T...
Материалы и методы 2.1. Материалы 2.1.1.
Оборудование Копалка, термомиксер 5436, центрифуга Эппиндорф, прибор для горизонтального электрофореза, источник питания 2197, термостат ТС 80 Мг. 2.1.2.
ШтаммEscherichia coli HB 101 Agrobacterium tumefaciens C58C1ПлазмидырG... . Стерилизацию проводили гипохлоридом натрия в течение 5 10 минут, а зат... 2.1.4. Для анализа брали стерильные ткани листьев.
Среды микробиологические для культивирования растений В работе использовали среды 1. Для микроорганизмов LB Лурия Бертани NaCl Дрожжевой экстракт Бантотриптон10 мгл 5 гл 5 глрН 7,5 Температура 240 С Длина светового дня 16 часов На чашку Петри LB штамм10 мл 1 мл2. Для культивирования растений среда MS Мурасиге Скуча приведена в таблице. 2.1.5.
2.1.7. Стерилизовали фильтрованием через фильтры В 485. 2.1.6. Фосфатный буфер ТЕ буфер 10 мМТрис HCl pH 8.0, 1 мМ ЭДТА Саркозилат Na... .
Антибиотики Ампицилин 50, Н2О 50. Для селекции бактерий с определенными плазмидами. 2.2. Методы 2.2.1.
Каждый вариант опытов проводили в трех повторностях. tumefaciens С58С1 pGV3850, выращенную на ротационном шейкере 20 циклов... . После 5 часов роста в бактериальную культуру добавляли мелконарезанные... Инкубация Agrobacterium tumefaciens с экссудатами тканей растений.
Выделение тотальной ДНК Agrobacterium tumefaciens. ДНК выделяли по модифицированному методу Draper с соавт. Осадок, полученый из 10 мл инкубационной среды лизировали в течение 45... ДНК осаждали спиртом и растворяли в ТЕ буфере. 2.2.3.
В целях дополнительной проверки наличия индукции процессинга и присутс... . Блод-гибридизация тДНК по Саузерну. Блод гибридизацию проводили на фильтрах. 2.2.4.
3. Этот метод основан на использовании модифицированной Ti-плазмиды pGV38... Таким образом, индуцирование процессинга тДНК в модифицированной Ti-пл... Этот процесс можно тестировать различными методами. Один из них это тр... perpusilla ряска Ацетосирингон контроль Лен долгунец Nicotiana tabacum...
Список литературы 1. 2. 3. 4. 5 6. 7. 8. 9. 10.Анализ генома. Методы. Под ред. Н. Дейвиса. М. Мир, 1990. 247 с. Великов В.А Бурьянов Я.И. Образование делеционных производных Ti-плазмиды pGV3850 при конъюгационном переносе из Agrobacterium tumefaciens в Escherichia coli. Генетика.1998. 8. т. 34. с. 1056-1062. Великов В.А Бурьянов Я.И. Изучение конъюгационного транспорта Ti-плазмиды pGV3850 из Agrobacterium tumefaciens в Escherichia coli. Тезисы докладов III Пущинской конференции молодых ученых. Пущино, 27-30 апреля 1998 г, с. 49. Генная инженерия растений.
Лабораторное руководство. М. Мир, 1991. 408 с. Клонирование ДНК. Методы. Под ред. Д. Гловера. М. Мир, 1988. 538 с. Малиатис Т Фрич Э Сэмбрук Дж. Молекулярное клонирование. Методы генетической инженерии. М.Мир, 1984. 463 с. Методы молекулярной генетики и генной инженерии. Под ред. А.И. Новосибирск Наука, 1990. 248 с. Мобильность генома растений.
Под ред. Б. Хол и Е.С. Делинс. М. Агропромиздат, 1990. 272 с. Плазмиды. Методы. Под ред. Д. Хорда. М. Агропромиздат, 1990. 272 с. Пехов А.П. Основы плазмидологии М. 1996. 231 с. Сельскохозяйственная биотехнология. Векторные системы молекулярного клонирования. Под ред. Р.Л. Подреперс и Д.Т. Денхардт. М. Агропромиздат, 1991. 535 с. Солова Г.К Кривопалов Ю.В Великов В.А Чумаков М.И. Прикрепление Agrobacterium к корням пшеницы. Микробиология. 1995. т. 64. 4, с. 526-530. Захарченко Н.С Комиви М.А Бурьянов Я.И. Индуцирование процессинга тДНК. Физиология растений. 1999. т. 46. 2 с. 282-291. Baker R.F Idler I.B. and al. Nucleotide sequence of the tDNA region from Agrobacterium tumefaciens Ti plasmid pTi 5955. Plant Mol. Biol 1983, V.2, pp. 335-350. Douglas C.J and al. Identification and genetic analisys of an Agrobacterium tumefaciens chromosomal virulence rigion.
J. Bacteriol 1985, v. 161, pp. 850-860. Holster S.M Villaroel and al. An analisys of the boundaries of the octopine TL DNA intumors induced by Agrobacterium tumefacies.
Mol. Gen. Genet 1983, v. 190, pp. 35-38. Howord E. A Zupan J.R. and al. The vir Dr protein of A. Tumefaciens contaen sal-terminal bipartite nuclear localization sygnal implication for nuclear uptake of DNA in plant cells. Cell, 1992, v. 68, pp. 109-119. Janssens A Engler Zambryski P. The nopaline c58 tDNA region is teansribed in Agrobacterium tumefaciens Mol. Gen. Genet 1984, v. 195, pp. 341-350. Melchers L.S Hooykaas P.J.J virulence in Agrobacterium tumefaciens.
Oxford Surv. Plant Mol. Cell Biol 1987. 4. pp. 167-170. Stachel S.E Nester E.W. The genetic and transcriptional organization of the vir regulon of the A6 Ti plasmid of Agrobacterium tumefaciens. EMBO J v. 5, pp. 1145-1454. Zambryski P Joos N Genetello G Leemans. Ti plasmid veefof for the introduction of DNA in to plant cells without alteration of their normal regeneration Capacity. EMBO J 1983. v. 2, pp. 2143-2150.