Взаимосвязь между перемешиванием и биологическими превращениями

 

Характер течений и явления переноса влияют на кинетику клеточных процессов в различных масштабах. Так, эффекты, проявляюш,иеся при определенных масштабах длины (вспомните рис. 9.2), могут различными путями влиять на наблюдаемую кинетику роста популяции клеток. Эти влияния необходимо учитывать с тем, чтобы изучение кинетики и разработка моделей осуществлялись в условиях, аналогичных в основном условиям в большом реакторе. В настоящем разделе мы изучим некоторые стороны взаимосвязи между кинетикой клеточного роста и перемешиванием в биореакторах.

Изучение начнем с анализа наибольшего масштаба, включающего циркуляцию всей жидкой фазы, в результате которой клетки переносятся в различные зоны реактора, где, как мы уже отмечали, в случае больших аппаратов обычно имеются разные концентрации растворенного кислорода и различные уровни турбулентности. Влияние циркуляции жидкой фазы на общую кинетику клеточного роста можно понять, обратившись к простому примеру. Предположим, что кислород подается локально в какую-то определенную зону реактора (как обычно и бывает в случае реакторов с перемешиванием) и что утилизация кислорода происходит в изолированных элементах жидкости, циркулирующих в реакторе. Такая ситуация может возникнуть в высоковязких микробиологических системах. Если начальная концентрация кислорода в воде близка к уровню насыщения (0,3 моль/м³) и если кислород поглощается с обычной скоростью 10—100 моль/(ч-м³), то в отдельном элементе системы кислород истощится через 11—50 с. Эта величина имеет тот же порядок, что и время циркуляции в большом реакторе.

Для того чтобы оценить влияние циркуляции жидкой фазы с количественной стороны в более общем виде, а также чтобы учесть статистическое распределение времен циркуляции, рассмотрим работу реактора периодического действия с распределением времени циркуляции f_c(t). Допустим далее, что в полностью сегрегированных элементах жидкой фазы осуществляется реакция нулевого порядка. Распространение этой модели на другие типы локальной кинетики реакций, в том числе и на реакции, описываемые уравнением Михаэлиса — Ментен, не представляет принципиальных затруднений, а только немного усложняет соответствующие расчеты, но все выводы качественного характера при этом сохраняют свою силу. В реакции нулевого порядка, константа скорости которой равна k₀, при начальной концентрации реагента s₀ его концентрация в элементе жидкой фазы будет изменяться согласно уравнениям:

(9.90)

Здесь мы впервые ввели параметр времени истощения питательного вещества t_e, равный k₀/s₀. Далее символом F обозначим долю времени, которую элемент жидкости находится в условиях полного истощения питательного вещества. Эту долю можно рассчитать по уравнению:

(9.91)

где t — среднее время циркуляции. Уравнение (9.91) было решено при различных относительных величинах t, t_e и различных стандартных отклонениях σ распределения времен выравнивания концентраций при условии, что f_c(t)—логарифмически нормальное распределение. Представленные на рис. 9.20 результаты показывают, что время пребывания клеток в истощенной среде возрастает при увеличении как среднего времени циркуляции, так и стандартного отклонения времени циркуляции. Параметр 1—F можно интерпретировать как отношение реального выхода продукта процесса к выходу, который был бы достигнут при условии подачи питательного вещества ко всем точкам объема реактора. Эти расчеты показывают, что при данном времени циркуляции реактор должен иметь такую конструкцию, которая бы обеспечивала минимальную дисперсию времени выравнивания концентраций перемешиваемых веществ.

РИС. 9.20. Зависимость времени пребывания клеток в циркулирующих элементах жидкой фазы в условиях истощения питательных веществ от относительного времени циркуляциии стандартного отклонения временициркуляции (из работы [19]).

 

Описанная модель, хотя и обладает некоторой информативностью, но не учитывает того влияния, которое могут оказывать на кинетику клеточного роста изменения условий во времени, обусловленные циркуляцией культуральной жидкости в реакторе. Как мы уже видели на рис. 9.1, масштабы времени циркуляции в больших биореакторах сравнимы с масштабами времени некоторых метаболических превращений и адаптационных изменений. Это говорит о том, что модель, разработанная для специфических условий перемешивания в малом реакторе, может оказаться несостоятельной в случае большого аппарата, для которого характерны большое время выравнивания концентраций перемешиваемых компонентов и большие флуктуации условий процесса.

Эксперименты, выполненные с помощью встроенного непосредственно в реактор флуориметрического устройства, описываемого подробнее в разд. 10.2, наглядно показали близость времени выравнивания концентраций и биологического отклика системы. Время выравнивания концентраций в аэрируемом (0,5% по объему) 70-литровом реакторе с механическим перемешиванием (рабочий объем 40 л) определяли путем импульсного введения раствора хинина в 0,05 М H₂SO₄ и последующего

 

Таблица 9.3. Сравнение времени выравнивания концентраций в аэрируемом (0.5% по объему) реакторе объемом 70 л (рабочий объем 40 л) и времени отклика процесса утилизации глюкозы дрожжами (в секундах) при различных скоростях перемешивания^a

контроля изменения флуоресценции культуры во времени. Эти изменения позволили определить процессы циркуляции жидкой фазы и смешивания в реакторе. Затем флуоресценцию измеряли после импульсного введения глюкозы в культуру дрожжей. В этом случае источником флуоресценции являлись внутриклеточные восстановленные нуклеозиды, концентрации которых в большой степени зависят от скорости превращений глюкозы в клетке. Таким образом, результаты второго эксперимента дают ценную информацию о времени отклика полной последовательности процессов переноса (смешение с жидкой фазой → диффузия к клеткам → транспорт в клетки) и метаболических превращений, связанных с утилизацией питательного вещества.

В табл. 9.3 приведены время выравнивания концентраций и время отклика процесса утилизации субстрата, найденные для этого реактора при различных скоростях перемешивания. Интересно отметить, что время отклика процесса утилизации глюкозы, как и можно было предположить, практически одно и то же во всех трех случаях, а время выравнивания концентраций при повышении скорости перемешивания существенно снижается. Эти данные интересны и с еще одной точки зрения — обращает на себя внимание сходство порядка величин времени отклика процесса локального поглощения и утилизации глюкозы и времени выравнивания концентраций в растворе. Отсюда следует, что в ходе циркуляции клетки сталкиваются с различными условиями в разных зонах реактора и, вероятно, постоянно находятся в некотором переходном метаболическом состоянии, поскольку время отклика метаболизма мало отличается от характерного масштаба времени изменения условий в среде, обусловленного циркуляцией культуры.

В некоторых экспериментах наблюдалось заметное влияние неоднородности среды на метаболизм клеток. Так, в трубчатом реакторе с линией циркуляции, в которой наблюдаются колебания концентрации растворенного кислорода, в культуре Candida tropicalis повышается экономический коэффициент образования биомассы относительно субстрата, снижается скорость потребления кислорода, расходуемого на образование биомассы, понижается дыхательный коэффициент. При колебании концентрации растворенного кислорода в проточной культуре Pseudomonas methylotropha ASI, растущей на метаноле как источнике углерода и энергии, наблюдались противоположные эффекты — снижение скорости клеточного роста и экономического коэффициента образования биомассы по субстрату. В другом эксперименте в культуре Репісіllіит chrysogenum P1 концентрацию растворенного кислорода изменяли периодически (с периодом 2 мин), так что средняя концентрация О₂ составляла 30% от концентрации при насыщении воздухом. В данном случае удельная скорость биосинтеза пенициллина существенно снижалась, причем в общих чертах этот эффект напоминал влияние понижения средней концентрации растворенного кислорода, что свидетельствовало о нелинейном характере влияния изменений условий на биореакцию.

Если перейти к анализу более мелкомасштабных флуктуации скорости турбулентного течения жидкой фазы, то логично ожидать существенного влияния интенсивности турбулентных вихрей различных масштабов на морфологию (и, вероятно, на характер метаболизма) некоторых организмов. Можно далее предположить, что эта зависимость будет иметь наибольшее значение в случае организмов, вырастающих до размеров, масштаб которых сравним с ожидаемым масштабом турбулентных вихрей. Последние в свою очередь изменяются от крупномасштабных (соответствующих масштабу высоты лопасти мешалки, например 0,1 м) до самых мелкомасштабных, образующихся в каскаде передачи энергии турбулентного потока (разд. 8.3). В биореакторах с перемешиванием размер самых мелких вихрей равен примерно 20—100 мкм. Чтобы определить, на какие биологические системы флуктуации скоростей в этом масштабе будут влиять в наибольшей степени, можно обратиться к рис. 9.2. Нетрудно видеть, что размеры скоплений микроорганизмов (особенно мицелиальных) соответствуют среднемасштабным турбулентным вихрям, и, следовательно, интенсивность перемешивания и распределение зон турбулентности в реакторе будут оказывать влияние в основном именно на эти образования.

РИС. 9.21. Зависимость концентрации лимонной кислоты, образовавшейся через 7 сут в культуре Aspergillus niger, от скорости вращения турбинной мешалки (кривые 1, 2 и 3 отвечают штаммам S59, N233 и Е81 соответственно), а также зависимость количества сухой биомассы, образующейся в культуре штамма S59, от того же параметра (кривая 4). [Воспроизведено с разрешения из статьи; Ujcova Е., Fencl Z., Musi'lkova М., Siechert L, Dependence of Release of Nucleotides from Fungi on Fermentor Turbine Speed; Biotech. Bioeng., 22, 237 (1980).]

 

В предыдуш,их главах мы уже обсуждали связанное с диффузионными ограничениями влияние обш,его размера клеточных скоплений на обш,ие скорости процессов. Здесь же основное внимание мы уделим более скрытым эффектам, включая изменения морфологии и метаболического состояния организмов, в суш,ественной степени Блияюш,ие на микробиологические процессы. Интересным примером такого рода эффектов является влияние интенсивности перемешивания на рост, образование продуктов жизнедеятельности и секрецию нуклеотидов в среду в случае различных мутантов Aspergillus niger — эффективных продуцентов лимонной кислоты. Как показано на рис. 9.21, приповышении интенсивности перемешивания возрастает урожайбиомассы, однако зависимость скорости биосинтеза лимонной кислоты от интенсивности перемешивания носит более сложный характер и в случае всех трех изученных мутантов характеризуется наличием четко выраженных максимумов. Параллельное изучение зависимости процесса секреции нуклеотидов в среду от скорости перемешивания показало, что характер этой зависимости определяется природой штамма. Для ряда штаммов убыстрение вращения мешалки сопровождалось увеличением концентрации нуклеотидов в среде, а для другого штамма совершенно неожиданно была обнаружена обратная зависимость, когда при более высоких скоростях вращения мешалки скорость секреции нуклеотидов снижалась. Влияние скорости вращения мешалки на морфологию мицелия этого необычного мутанта представлено на рис. 9.22. На микрофотографиях видно, что при низких скоростях перемешивания мицелий имеет длинные, тонкие и мало разветвленные филаменты с небольшим числом септ, в то время как при высоких скоростях перемешивания преобладают толстые, в высшей степени септированные, более разветвленные и скрученные гифы. Этот пример показывает, что интенсивность перемешивания может оказывать на организмы большое влияние, в существенной степени определяющее кинетику всего процесса.

В обсуждении материала этого раздела и в приведенных примерах мы старались подчеркнуть потенциально сложнуюреакцию растущих клеток на физические и химические параметры окружения и невозможность разработки общей математической модели кинетики, применимой при любых обстоятельствах. Поэтому необходимы тщательный учет совместноговлияния химических и физических параметров среды в данном биореакторе и применение соответствующего математического описания кинетики процессов, необходимого именно в данной ситуации. Очевидны трудности, связанные с масштабным переходом в случае систем, кинетика которых отличается высокой чувствительностью к флуктуациям параметров окружения. В этих случаях нужно попытаться найти такую конструкцию реактора, которая обеспечивала бы определенные (но не обязательно одинаковые во всем объеме) параметры окружения, что может быть чрезвычайно трудной задачей, если речь идет о крупномасштабных реакторах. Выбрав реактор иной конструкции (см. разд. 9.7), иногда удается снизить разброс в значениях времени выравнивания концентраций и степени флуктуаций параметров окружения и тем самым получить более определенную картину смешения, для которой легче подыскать соответствующее математическое выражение, описывающее кинетику процесса. Однако в общем случае нельзя рассчитывать на успех рационального, заранее спланированного масштабирования биореакторов до тех пор, пока мы не будем лучше понимать процессы переноса в различных масштабах и кинетику биореакций на нескольких условиях сложности и пока не сможем объединить эти данные с тем, чтобы достаточно надежно рассчитать работу реактора на основе одних лишь теоретических данных.

 

РИС. 9.22. На этих микрофотографиях отчетливо видно различие в морфологии и септации клеток А. niger S59, выращенных при 400 (а) и 1200 (б) оборотах в минуту (увеличение Х400). [Воспроизведено с разрешения из статьи: Ujcova E., Fencl Z., Musi'lkova М., Siechert L., Dependence of Release of Nucleotides from Fungi on Fermentor Turbine Speed; Biotech. Bioeng., 22, 237 (1980).]

 

Пример 9.1. Моделирование и оптимизация процесса производства α-галактозидазы с помощью плесневого гриба Monascus sp.

РИС. 9П1.1. Результаты изучения роста периодической культуры плесневого гриба Monascus sp. на глюкозно-галактознон среде [начальный состав среды; 1% (по массе) глюкозы, 0,3% галактозы, 0,5% NH₄NO₃, 0,5% КН₂РО₄, 0,1% MgSO₄·7H₂O, 0,01% дрожжевого экстракта]. Посевной материал выращен на глюкозной среде. При расчете исходили из следующих начальных условий: x=5·10^-4 г/мл, s₁=1·10^-2 г/мл, s₂=3·10^-3 г/мл; s₂₁=0 мкг/(мг клеток), rs₂₁=0,9I0 мкг/(мг клеток), е=0 единиц/(мг клеток). [Воспроизведено из статьи; Imanaka Т. et al, Unsteady-State Analysis of a Kinetic Model for Cell Growth and α-Galactosidase Production in Mold; J. Ferment. Tech. (Japan), 51, 423 (1973).]

 

Фермент α-галактозидаза применяется в производстве сахара из сахарной свеклы благодаря его способности разрушать рафинозу — ингибитор кристаллизации сахарозы, В ряде интересных работ Иманака, Кайеда, Сато и Тагучи изучили процесс производства этого внутриклеточного фермента с помощью плесневого гриба, выделенного ими из почвы*. Опубликованные этими исследователями данные заслуживают тщательного анализа, мы же суммируем некоторые основные результаты.

 

* Приведенные в этом примере данные заимствованы главным образом из статей: Imanaka Т., Kaieda Т., Sato К-. Taguchi Н., a-Galactosidase Production in Batch and Continuous Culture and a Kinetic Model for Enzyme Production, J. Ferment. Technol. (Japan), 50, 633 (1972); Imanaka Т., Kaieda Т., Taguchi H., Optimization of α-Gaiactosidase Production by Mold II III- J Ferment. Technol. (Japan),51, 423. 431 (1973).

 

На первом этапе разработки высокоэффективного процесса биосинтеза фермента были изучены различные условия культивирования плесени в периодическом и непрерывном процессах. К числу основных результатов изучения периодической культуры относятся следующие:

1. Из 20 изученных источников углерода (в том числе глюкозы, фруктозы» маннита, крахмала) только четыре вещества углеводной природы доста точно эффективно индуцируют высокий

РИС. 9ПІ.2. Концентрации клеток и субстрата, а также удельная ферментативная активность в проточной культуре при 30 °С в стационарных состояниях после ступенчатого повышения скорости разведения. Начальные концентрацииглюкозы и галактозы составляли 2 и 0,5% соответственно. [Воспроизведена из статьи: Imanaka Т. et al.. Optimization of a-Galactosidase Production by Mold; J. Ferment. Tech. (Japan), 50, 633 (1972).]

 

уровень α-галактозидазной активности. Эффективными индукторами являются галактоза, мелибиоза, рафиноза и стахиоза.

2. Что касается источников азота, то большие концентрации фермента продуцируются в присутствии нитрата аммония; мочевина, KNO₃, (NH₄)₂S0₄ и пептон в этом отношении менее эффективны. Оптимальная концентрация NH₄NO₃ в среде составляет 0,3—0,5% (по массе).

3. При росте на галактозной среде урожай клеточной массы пропорционалена-галактозидазной активности. Если в качестве источника углерода используется смесь глюкозы и галактозы, то наблюдается явление диаукси» (рис. 9П1.1); до тех пор, пока не истощится почти вся глюкоза, галактоз» практически не утилизируется.

4. Как показано на рис. 9П1.1, продуцирование α-галактозидазы начинается только тогда, когда истощится почти вся глюкоза. В отдельных экспериментах было показано, что глюкоза в концентрациях, превышающих 0,05% (по массе), подавляет синтез фермента.

Изучению непрерывной культуры в стационарном состоянии были посвящены две серии экспериментов, которые были выполнены в одном ПРПП.В первой серии экспериментов скорость разведения вначале удерживали на очень низком уровне, a затем ступенчато повышали,

РИС. 9П1.3. Концентрации клеток и субстрата, а также удельная ферментативная активность в стационарных состояниях после ступенчатого снижения скорости разведения проточной культуры при 30 °С. Начальные концентрации глюкозы и галактозы составляли 2 и 0,5% соответственно. [Воспроизведено из статьи: Imanaka Т. et al., Optimization of α-Galactosidase Production bу Mold; J. Ferment. Tech. (Japan), 50, 633 (1972).]

 

определяя параметры системы в стационарном состоянии при каждом значении D. Полученные результаты приведены на рис. 9П1.2. Особенно интересно резкое изменение свойств системы при D=0,142 ч^-1. При скоростях разведения ниже этой величины происходит утилизация галактозы и синтез α-галактозидазы. Если же D превышает 0,142 ч^-1, то оба процесса прекращаются и начинается утилизация глюкозы как единственного источника углерода для плесени. Очевидно, это скачкообразное изменение обусловлено влиянием глюкозы, уже упоминавшимся при анализе поведения периодической культуры данного организма. При относительно большой удельной скорости роста (больших величинах D) плесень утилизирует преимущественно глюкозу.

На рис. 9П1.3 представлены результаты аналогичной серии опытов в ПРПП при высокой начальной скорости разведения, которую постепенно и также ступенчато уменьшали. В новой серии экспериментов снова обнаружено скачкообразное изменение параметров, хотя и менее резкое, чем в первой серии, причем на этот раз скачок наблюдался приблизительно при D = 0,008 ч^-1. Ниже этой критической скорости разведения ассимилируется галактоза и продуцируется фермент; при D>0,008 ч^-1 α-галактозидазной активности не наблюдалось, что не согласуется с результатами первой серии экспериментов, в которых фермент продуцировался вплоть до D = 0,142 ч^-1.

РИС. 9П1.4. Здесь еще раз воспроизведены некоторые кривые из рис. 9П1.2 и 9П1.3, отражающие наличие нескольких стационарных состояний и гистерезиса в проточной культуре. Два устойчивых стационарных состояния наблюдаются в диапазоне скоростей разведения от 0,008 до 0,142 ч^-1. Какое из этих стационарных состояний реализуется, зависит от начальных условий. [Воспроизведено из статьи: Imanaka Т. еі аі.. Optimization of α-Galactosidase Production by Mold, J. Ferment. Tech. (Japan), 50, 633 (1972).]

 

Ha рис. 9П1.4 воспроизведены также некоторые данные из двух предыдущих рисунков, которые достаточно наглядно показывают, что в диапазоне между D = 0,008 и D = 0,142 ч^-1 система имеет несколько устойчивых стационарных состояний. В этом диапазоне скоростей разведения способность системы продуцировать а-галактозидазу зависит от начальных условий работы реактора, причем синтез α-галактозидазы обеспечивается только при подходе к этому диапазону со стороны более низких скоростей разведения.

На базе этих и ряда других экспериментальных данных была разработана математическая модель, описывающая утилизацию субстрата, рост клеток и синтез фермента. Приведенные в табл. 9П1.1 индивидуальные параметры модели в общих чертах нам уже знакомы: так, например, удельная скорость клеточного роста μ₂ на галактозе описывается уравнением Моно, а уравнение

 

Таблица 9П1.1. Математическая модель процесса образования α-галактозидазы^{а, б}

удельной скорости роста клеток на глюкозе (μ_l включает член, учитывающий конкурентное ингибирование галактозой. Все константы, входящие в эти уравнения, были определены в экспериментах с непрерывной культурой в двух различных средах. В табл. 9П1.2 параметры с индексом G отвечают глюкозной среде (20 г глюкозы, 5 г NH₄NO₃, 5 г КН₂РО₄, 1 г MgSO₄-7H₂O, 0,1 г дрожжевого экстракта в 1000 мл водопроводной воды при рН 4,5), а индекс р отвечает галактозной среде (5 г галактозы, 5 г NH₄NO₃, 5 г КН₂РО₄, 1 г MgSO₄-7H₂O в 1000 мл водопроводной воды, рН 4,5), в которой преимущественно и осуществляется синтез фермента.

 

Таблица 9П1.2. Параметры математической модели биосинтеза α-галактозидазы^а

Находящиеся в правом столбце параметры определены экспериментально; другие параметры скорректированы таким образом, чтобы достигалось соответствие результатам экспериментального изучения периодической и непрерывной культур. Здесь индексами G и p обозначены параметры, относящиеся к глюкозной (30 °С) и галактозной (35 °С) средам соответственно

Модель биосинтеза фермента основана на оперонной теории индукции синтеза ферментов, рассмотренной нами в гл. 6. Считается, что удельная скорость синтеза α-галактозидазы пропорциональна внутриклеточной концентрации кодирующей этот фермент мРНК. Далее допускается, что эта мРНК разрушается в реакции первого порядка, а продуцируется только при условии, что внутриклеточная концентрация репрессора R меньше некоторого порогового значения r_c. Ниже этой пороговой величины удельная скорость синтеза мРНК повышается при снижении концентрации r. Репрессор образуется с постоянной удельной скоростью k₂ и разрушается по реакции первого порядка с удельной скоростью k₃r. Концентрация репрессора снижается также за счет его связывания с индуктором — внутриклеточной галактозой.

В уравнении материального баланса по внутриклеточной галактозе скорость транспорта галактозы в клетку описывается членом с коэффициентом U. Допускается, что при концентрации глюкозы s₁ выше некоторой критической величины s_1c (принимается равной 2,25-10^-4 г/мл) этот член равен нулю; таким образом учитывается влияние глюкозы.

Прямое определение констант скоростей в модели оперона затруднено из-за отсутствия соответствующих данных. Для оценки значений k₃ и k₇ сделано допущение, что периоды полураспада репрессора и мРНК составляют 40 и 5 мин соответственно. Приведенные в табл. 9П1.2 значения других параметров определены методом проб и ошибок так, чтобы в конце концов достигалось приемлемое соответствие экспериментальным данным.

Эта модель обладает рядом преимуществ, обусловленных высокой степенью структурирования, базирующейся в основном на хорошо известных биологических особенностях системы. С другой стороны, известные возражения может вызвать большое число корректируемых параметров. Для изучения диапазона применимости этой модели можно использовать несколько тестов.

 

РИС. 9П1.5. Переходное состояние в ПРПП, инициируемое изменением скорости разведения от D = 0,140 до D = 0,142 ч^-1. Среда содержит два источника углерода — глюкозу (2%) и галактозу (0,5%). В расчетах были приняты следующие начальные условия: x=1,30·10^-2 г/мл, s₁=2,23-10^-4 г/мл, s₂=5,01-10^-5 г/мл, s₂₁ = 2,5 мкг/(мг клеток), r=0,718 мкг/(мг клеток), rs₂₁ = 1,28 мкг/(мг клеток), m=1,04-10^-2 мкг/(мг клеток), е = 0,297 ед./(мг клеток). [Из статьи: Imanaka Т. et al., Unsteady-state Analysis of a Kinetic Model for Cell Growth and α-Galactosidase Production by Mold; J. Ferment. Tech., (Japan), 51, 423 (1973).]

Один из них сводится к ответу на вопрос, могут ли другие модели, основанные на иных допущениях и содержащие аналогичное число нуждающихся в корректировке параметров, так же хорошо соответствовать экспериментальным данным? Если это так, то у нас нет оснований предпочитать именно эту модель. Иманака и сотрудники провели несколько подобных тестов, включая варианты, когда внутриклеточная концентрация галактозы считается пропорциональной концентрации галактозы в среде, когда скорость образования репрессора принимается пропорциональной внутриклеточной концентрации глюкозы или когда скорость образования мРНК считается обратно пропорциональной концентрации репрессора. Любое из указанных изменений модели приводило к серьезному расхождению между расчетными и экспериментальными данными.

Другие тесты, рассмотренные Иманакой и сотрудниками, включали анализ соответствия моделй экспериментальным данным в широком диапазоне условий. Действительно, именно этот критерий определяет право на существование сложной высокоструктурированной кинетической модели, поскольку только достаточно универсальная модель может использоваться для определения оптимальных параметров процесса. Здесь описываемая модель также

 

Таблица 9П1.3. Оптимальные условия биосинтеза α-галактозидазы в реакторах шести различных типов. Во всех случаях среда содержала 2% глюкозы и 0,5% галактозы^а

дала отличные результаты. Кривые на рис. 9П1.1 были рассчитаны с помощью рассматриваемой модели при указанных начальных условиях, причем соответствие между расчетными данными н экспериментом оказалось очень хорошим.

Уравнения модели, отражающие нестационарное состояние в ПРПП, можно получить путем введения в каждое из уравнений, описывающих периодическую культуру (табл. 9П1.1), слагаемого, отвечающего скорости разведения D (разности концентраций в питательном растворе и реакционной смеси). Затем получают соответствующие уравнения для стационарного состояния в ПРПП, приняв, что все производные по времени равны нулю. С помощью таких уравнений, в частности, были рассчитаны кривые, изображенные на рис. 9П1.2 и 9П1.3.

РИС. 9П1.6. Вычисленная и экспериментально найденная зависимости скорости образования фермента в непрерывной культуре в системе из двух ПРПП (система 3 в табл. 9П1.3). [Из статьи: Imanaka Т. et аі, Optimization of a-Galactosidase Production in Multi-stage Continuous Culture of Mold; J. Ferment. Tech. (Japan), 51, 431 (1973).]

 

Модель хорошо воспроизводит наблюдаемые в эксперименте гистерезис и скачкообразные изменения параметров. В качествепоследнего теста, предшествовавшего работе по оптимизации реактора, модель применяли для расчета параметров переходного состояния в ПРПП в режиме повышения скорости разведения. Вычисленные на базе модели и соответствующие экспериментальные данные представлены на рис. 9П1.5; между найденными и вычисленными данными наблюдается очень хорошее соответствие, включая скачкообразные повышение концентрации глюкозы и снижение концентрации клеток. Детально разработанную описанным путем модель применяли затем для расчета выхода фермента в непрерывных реакторах различных конструкций (табл. 9П1.3), причем в каждом случае объемы отдельных сосудов корректировались с целью обеспечения максимального выхода фермента. Указанная в таблице общая скорость разведения D равна отношению общей скорости потока поступающей в систему питательной среды к общему объему всех сосудов системы.

Здесь несколько детальнее мы рассмотрим системы 3 н 4, в которых, как и в системах 5 и 6, первая часть (первый сосуд) системы служит для создания высокой концентрации клеток с участием одной лишь относительно дешевой глюкозы; позднее в систему вводят галактозу, индуцирующую биосинтез фермента. Поскольку процесс индукции происходит не мгновенно, а в течение какого-то времени, то необходимо учитывать и этот период адаптации внутриклеточных систем регуляции. В математической модели стадия индукции рассматривается изолированно, а ферментативная активность на выходе из реактора рассчитывается по уравнению (9.62), которое для данного случая можно записать в форме:

(9П1.10)

Здесь e_b(t) —концентрация фермента в момент времени t, рассчитанная с помощью математической модели периодической культуры. При расчете последней в качестве начальных условий принимаются значения концентраций компонентов питательной смеси перед стадией индукции.

РИС. 9П1.7. Скорость образования фермента в системе из ПРПП и трубчатого реактора (система 4 в табл. 9П1.3). [Из статьи: Ітаnaka Т. et al., Optimization of a-Galactosidase Production in Multi-stage Continuous Culture of Mold; J. Ferment Tech. (Japan), 51, 431 (1973).]

 

Описанным путем была рассчитана скорость образования фермента (De_ex) в двухстадийной системе 3; результаты расчетов представлены на рис. 9П1.6. Расчеты показали, что скорость образования фермента должна быть максимальной при D₁ = 0,20 ч^-1; результаты соответствующих экспериментов практически полностью совпадали с расчетной зависимостью выхода фермента от D₂. В системе 4 на второй стадии применялся бйореактор, приближенно соответствующий реактору полного вытеснения. И в этом случае (рис. 9П1.7) расчетные данные (сплошная линия) хорошо согласовались с результатами эксперимента (точки).

Приведенные в табл. 9П1.3 данные показывают, что соответствующим образом подобранная многостадийная система для культивирования организмов обеспечивает существенное повышение выхода фермента по сравнению с лучшим одностадийным процессом. Например, в системе 6 синтезируется на 55% больше фермента, чем в простом ПРПП. Наличие обоснованной кинетической модели и применение общих принципов расчета реакторов в этом случае, очевидно, оказались важнейшими взаимодополняющими элементами в создании и оптимизации высокоэкономичного непрерывного процесса.