Параметры флуоресценции и их применение к исследованию биологических макромолекул

 

 

Спектры флуоресценции.

 

–   мера положения спектра

 

1. Интенсивность спектра флуоресценции (квантовый выход) белков зависит от близости собственных тушащих групп (COO^!, , S–S связь) и доступности внешним тушителям (I^!, Au⁺, Cu⁺, акриламид, Cs⁺).

Уравнение Штерна–Фольмера.

q₀ – квантовый выход (интенсивность) флуоресценции в отсутствие тушителя;

q – квантовый выход (интенсивность) флуоресценции в присутствие тушителя с концентрацией [Q];

K_SV – константа Штерна–Фольмера (определяется из зависимости I₀ / I = f ([Q])).

[Q]

Зависимость Штерна- Фольмера

нативный белок

развернутый белок

 

2. Положение спектра флуоресценции (l_max, А) для большинства флуорофоров зависит от полярности их окружения. Чем меньше полярность, тем более коротковолновое положение спектра флуоресценции. Положение спектра флуоресценции тирозина практически не зависит от полярности.

3. Миграция энергии возбуждения происходит в случае перекрывания спектра поглощения акцептора со спектром поглощения донора.

Различают два вида: 1) перепоглощение – излучение кванта света молекулой донора и его поглощение молекулой акцептора; 2) безызлучательный перенос энергии возбуждения от донора к акцептору благодаря прямому электродинамическому взаимодействия между возбужденной и не возбужденной молекулами. Определяется не только перекрыванием спектров поглощения акцептора со спектром поглощения донора, но и критическим расстоянием R₀ между донором и акцептором, на котором вероятность переноса равна вероятности спонтанной дезактивации.

Эффективность переноса энергии определяется как

 

или , где .

Перенос энергии возбуждения флуоресценции был использован для определения расстояний между хромофорами в различных биологических макромолекулах и их комплексах и показал себя как очень эффективная спектроскопическая линейка для измерения расстояний в интервале значений 20 – 100 Å.

Чтобы наблюдать явление переноса энергии и оценивать расстояния между биологическими молекулами в клетках широкое распространение получило семейство зеленых флуоресцентных белков. Во-первых, они могут экспрессироваться в различных клетках, где становятся спонтанно флуоресцирующими без ко-факторов. Во-вторых, эти белки могут быть пришиты к белку-хозяину сохраняя при этом способность к флуоресценции и функцию белка-хозяина. Мутагенез этого семейства дало в настоящее время достаточно большое количество мутантов с разными спектральными свойствами, которые могут быть использованы как доноры или акцепторы в методе резонансного переноса энергии.