Реферат Курсовая Конспект
Реакции ассоциации - Лекция, раздел Химия, Лекция 9. флуоресцентная спектроскопия Интенсивность поглощения света единицей объема вещества связана с экспериментально измеренными величинами известной формулой Ламберта-Бэра Измерение Поляризации Флуоресценции Или Анизотропии Широко Используется Для ...
|
Измерение поляризации флуоресценции или анизотропии широко используется для количественной оценки реакций ассоциации биологических макромолекул. Связывание антигена с антителом [21], ассоциация белков [22], ассоциации лигандов с белками и нуклеиновыми кислотами [23, 24] – вот только несколько примеров. Предположим, что флуорофор может находиться либо в свободном виде, либо может быть связан с макромолекулой. Наблюдаемое значение анизотропии флуоресценции, когда присутствуют обе формы, дается выражением
(5.53)
Где rсвоб и rсвяз— анизотропии свободного и связанного флуорофоров соответственно: fСВОб и fсвяз — доли от общей флуоресценции, соответствующие каждой форме флуорофора. Естественно, f своб + f связ = 1. Предположим далее, что для данного случая квантовый выход флуорофора не изменяется при связывании и f своб и f связ соответствуют долям от общего количества флуорофора, находящегося в свободном и связанном состоянии. Этой информации достаточно для вычисления константы диссоциации реакции.
Рассмотрим равновесие между лигандом L и белком Р.
(5.54)
Константа диссоциации для этой реакции записывается в виде
(5.55)
Доля связанного флуорофора равна
(5.56)
где [ L0] = [ L] + [ Р - L] - общая концентрация лиганда или флуорофора. Уравнение (5.53) легко преобразовать к виду
(5.57)
В общем случае можно получить значения rсвоб и rсвяз, исследуя флуорофор в отсутствие белка и при высоких концентрациях белка, достаточных для полного связывания флуорофора. По измеренному значению r можно вычислить fсвнз и fсвоб Эти значения затем используются для вычисления константы связывания. Наиболее удобная форма уравнения связывания определяется спецификой анализируемого объекта.
Ценность измерения анизотропии для изучения реакций ассоциации состоит в том, что нет необходимости в изменении интенсивности флуоресценции или спектра испускания флуорофора. Фактически если происходят такие изменения, то необходимо более сложное выражение для вычисления f связ из средних значений анизотропии. Если при связывании происходят изменения квантового выхода, анизотропия может изменяться значительно сильнее. Например, рассмотрим связывание профлавина с DNA [ 24]. Известно, что поляризация профлавина в воде почти равна нулю, а поляризация формы, связанной с DNA, близка к 0,37. Следовательно, даже если квантовый выход или спектр испускания профлавина при связывании остаются постоянными, анизотропия по-прежнему может быть использована для вычисления степени связывания.
Часто квантовый выход флуорофора при связывании изменяется. В этом случае необходимо использовать другую форму уравнения (5.57), учитывающую это изменение. Примем, что R = qсвяз/qсвоб - отношение квантовых выходов связанной и свободной форм. Среднее значение анизотропии связано с долей от общего количества флуорофора, находящегося в связанном состоянии, выражением
(5.58)
При К = 1 это выражение сводится к уравнению (5.57). Если же при связывании происходят значительные изменения в квантовом выходе, то их можно использовать для количественной характеристики реакции ассоциации. Когда изменения малы (в два раза или меньше), предпочтительнее использование анизотропии, особенно если при связывании сильно меняется r. Более того, измерения анизотропии не зависят от общей интенсивности флуоресценции, благодаря чему можно использовать анизотропию в тех случаях, когда трудно измерить интенсивность из-за свойств образца или особенностей прибора.
СВЯЗЫВАНИЕ ЛУМАЗИНА (2,4-ПТЕРИДИНДОЛА) С ЛУМАЗИНОВЫМ БЕЛКОМ.
Для того чтобы проиллюстрировать влияние связывания белка с лигандом на анизотропию флуоресценции, воспользуемся некоторыми результатами из работы [ 23]. Авторы работы изучили связывание лумазина (L) с лума-зиновым белком (Р) с молекулярной массой 22 000, образующим комплекс (L -Р). При связывании лумазина с белком квантовый выход флуоресценции лумазина увеличивается в~1,4 раза. В табл. 5.3 показаны стационарные анизотропии для комплекса L -P, измеренные при различных концентрациях. Из приведенных данных ясно, что анизотропия флуоресценции раствора уменьшается при разбавлении образца, Это уменьшение объясняется диссоциацией комплекса на белок и свободный лумазин, поэтому данные могут быть использованы для вычисления константы диссоциации комплекса. В этом частном случае концентрации L и Р равны. Ясно, что [LP] = [р]oбщfсвяз и [L] = [Р] = [Р]oбщ(1 - fсвяз). где [Р]общ - общая концентрация белка.
Константа диссоциации, таким образом, равна:
(5.59)
Доля связанного лумазина может быть вычислена из данных табл. 5.3. Предположим, что при общей концентрации 5,44 мкМ весь лумазин связан с белком. Тогда rсвяз = 0,153. Далее предположим, что анизотропия свободного лумазина была измерена и найдена равной 0,003. Это значение rсвоб. Используя эти числа и другие значения анизотропии из табл. 5.3, вычислим Кдисс, Например, при концентрации 0,69 мкМ и 21°С анизотропия равна 0,047. Подстановка в уравнение (5.58) дает fсвяз = 0,229, а при подстановке этого значения в уравнение (5.59) получим Кдисс = = 1,79 мкМ.
Концепции, описанные в предыдущем параграфе, приводятся в литературе в различных формах, обычно точно соответствующих конкретному набору экспериментальных условий. Не ставя целью рассмотрение сложности связывания лиганда с белком, мы хотим проиллюстрировать возможность применения среднего значения анизотропии для определения относительных количеств флуорофора в каждом из двух окружений. Если это известно, то вычисление соответствующих констант можно провести по любому приемлемому выражению, описывающему связывание лиганда с белком.
Представляется также интересным обсудить влияние несвязанного флуорофора на кинетику затухания анизотропии флуоресценции. Теория кинетики затухания анизотропии будет описана более детально в следующей главе. Здесь рассмотрим флуорофор, находящийся в двух состояниях -свободном и связанном. Кинетика затухания анизотропии дается выражением
(5.60)
где φсвоб и φсвяз - времена вращательной корреляции для флуорофоров в свободном и связанном виде соответственно. Выражение (5.60) справедливо только в том случае, если время жизни флуорофора одно и то же в обоих состояниях. Предположим, что φсвоб очень короткое (< 1 нс) из-за небольшого размера флуорофора. Тогда для наблюдаемого затухания можно записать:
(5.61)
Наблюдаемое затухание анизотропии будет одноэкспоненпиальным с временем, корреляции φсвяз. Несвязанный флуорофор не будет влиять на φсвяз но его присутствие будет сказываться па кажущемся значении r(t), равном гоfсвяз при t = 0, и понижать кажущееся значение начальной анизотропии.
Интересно проанализировать общий случай, когда время затухания флуоресценции флуорофора неодинаково в разных состояниях. Тогда кинетика затухания флуоресценции описывается уравнением
(5.62)
где αсвобτсвоб = fсвое и αсвязτсвяз = fсвяз Кинетика затухания анизотропии равна
(5.63)
Это выражение иллюстрирует потенциальную сложность природы r (t) при наличии двух классов флуорофоров. Например, примем, что время затухания связанной формы тсвяз больше, чем время затухания свободной формы τсвоб, что типично для зонда,чувствительного к растворителю в области гидрофобного связывания. При длительных временах после импульса возбуждения r(t) увеличивается из-за увеличения доли вклада интенсивности связанных форм флуорофора. Кинетика увеличения r(t) часто интерпретируется как результат анизотропного вращения флуорофора. Действительно, анизотропные вращения могут определять кинетику увеличения r(t), но, прежде чем давать такую интерпретацию необходимо убедиться, что причиной не является гетерогенность.
– Конец работы –
Эта тема принадлежит разделу:
Лекция флуоресцентная спектроскопия... Люминисценцией является излучение фотонов электронно возбужденными состояниями... В настоящее время метод собственной люминесценции широко используется в биофизике и биохимии благодаря относительной...
Если Вам нужно дополнительный материал на эту тему, или Вы не нашли то, что искали, рекомендуем воспользоваться поиском по нашей базе работ: Реакции ассоциации
Если этот материал оказался полезным ля Вас, Вы можете сохранить его на свою страничку в социальных сетях:
Твитнуть |
Новости и инфо для студентов