Реакции ассоциации

Измерение поляризации флуоресценции или анизотропии широко исполь­зуется для количественной оценки реакций ассоциации биологических макромолекул. Связывание антигена с антителом [21], ассоциация белков [22], ассоциации лигандов с белками и нуклеиновыми кислотами [23, 24] – вот только несколько примеров. Предположим, что флуорофор может нахо­диться либо в свободном виде, либо может быть связан с макромолекулой. Наблюдаемое значение анизотропии флуоресценции, когда присутствуют обе формы, дается выражением

(5.53)

 

Где rс_воб и r_связ— анизотропии свободного и связанного флуорофоров со­ответственно: f_СВОб и f_связ — доли от общей флуоресценции, соответствую­щие каждой форме флуорофора. Естественно, f _своб + f _связ = 1. Предполо­жим далее, что для данного случая квантовый выход флуорофора не изме­няется при связывании и f _своб и f _связ соответствуют долям от общего количества флуорофора, находящегося в свободном и связанном состоянии. Этой информации достаточно для вычисления константы диссоциации реак­ции.

Рассмотрим равновесие между лигандом L и белком Р.

(5.54)

Константа диссоциации для этой реакции записывается в виде

(5.55)

 

Доля связанного флуорофора равна

(5.56)

 

где [ L₀] = [ L] + [ Р - L] - общая концентрация лиганда или флуорофора. Уравнение (5.53) легко преобразовать к виду

(5.57)

 

В общем случае можно получить значения r_своб и r_связ, исследуя флуорофор в отсутствие белка и при высоких концентрациях белка, достаточных для полного связывания флуорофора. По измеренному значению r можно вычис­лить f_свнз и f_своб Эти значения затем используются для вычисления кон­станты связывания. Наиболее удобная форма уравнения связывания опреде­ляется спецификой анализируемого объекта.

Ценность измерения анизотропии для изучения реакций ассоциации сос­тоит в том, что нет необходимости в изменении интенсивности флуоресцен­ции или спектра испускания флуорофора. Фактически если происходят та­кие изменения, то необходимо более сложное выражение для вычисления f _связ из средних значений анизотропии. Если при связывании происходят изменения квантового выхода, анизотропия может изменяться значительно сильнее. Например, рассмотрим связывание профлавина с DNA [ 24]. Извест­но, что поляризация профлавина в воде почти равна нулю, а поляризация формы, связанной с DNA, близка к 0,37. Следовательно, даже если кванто­вый выход или спектр испускания профлавина при связывании остаются пос­тоянными, анизотропия по-прежнему может быть использована для вычисле­ния степени связывания.

Часто квантовый выход флуорофора при связывании изменяется. В этом случае необходимо использовать другую форму уравнения (5.57), учитывающую это изменение. Примем, что R = q_связ/q_своб - отноше­ние квантовых выходов связанной и свободной форм. Среднее значение анизотропии связано с долей от общего количества флуорофора, находящегося в связанном состоянии, выражением

(5.58)

 

При К = 1 это выражение сводится к уравнению (5.57). Если же при связывании происходят значительные изменения в квантовом выходе, то их можно использовать для количественной характеристики реакции ассо­циации. Когда изменения малы (в два раза или меньше), предпочтительнее использование анизотропии, особенно если при связывании сильно меняет­ся r. Более того, измерения анизотропии не зависят от общей интенсивнос­ти флуоресценции, благодаря чему можно использовать анизотропию в тех случаях, когда трудно измерить интенсивность из-за свойств образца или особенностей прибора.

СВЯЗЫВАНИЕ ЛУМАЗИНА (2,4-ПТЕРИДИНДОЛА) С ЛУМАЗИНОВЫМ БЕЛКОМ.

Для того чтобы проиллюстрировать влияние связывания белка с лигандом на анизотропию флуоресценции, воспользуемся некоторыми результатами из работы [ 23]. Авторы работы изучили связывание лумазина (L) с лума-зиновым белком (Р) с молекулярной массой 22 000, образующим комплекс (L -Р). При связывании лумазина с белком квантовый выход флуоресцен­ции лумазина увеличивается в~1,4 раза. В табл. 5.3 показаны стационар­ные анизотропии для комплекса L -P, измеренные при различных концен­трациях. Из приведенных данных ясно, что анизотропия флуоресценции раствора уменьшается при разбавлении образца, Это уменьшение объясня­ется диссоциацией комплекса на белок и свободный лумазин, поэтому дан­ные могут быть использованы для вычисления константы диссоциации комп­лекса. В этом частном случае концентрации L и Р равны. Ясно, что [LP] = [^р]oбщfсвяз и [L] = [Р] = [Р]oбщ(1 - fсвяз). где [Р]общ - общая концентрация белка.

Константа диссоциации, таким образом, равна:

(5.59)

 

Доля связанного лумазина может быть вычислена из данных табл. 5.3. Предположим, что при общей концентрации 5,44 мкМ весь лумазин связан с белком. Тогда r_связ = 0,153. Далее предположим, что анизо­тропия свободного лумазина была измерена и найдена равной 0,003. Это значение r_своб. Используя эти числа и другие значения анизотропии из табл. 5.3, вычислим К_дисс, Например, при концентрации 0,69 мкМ и 21°С анизотропия равна 0,047. Подстановка в уравнение (5.58) дает f_связ = 0,229, а при подстановке этого значения в уравнение (5.59) получим К_дисс = = 1,79 мкМ.

Концепции, описанные в предыдущем параграфе, приводятся в литературе в различных формах, обычно точно соответствующих конкретному набору экспериментальных условий. Не ставя целью рассмотрение сложности свя­зывания лиганда с белком, мы хотим проиллюстрировать возможность при­менения среднего значения анизотропии для определения относительных ко­личеств флуорофора в каждом из двух окружений. Если это известно, то вы­числение соответствующих констант можно провести по любому приемлемому выражению, описывающему связывание лиганда с белком.

Представляется также интересным обсудить влияние несвязанного флуорофора на кинетику затухания анизотропии флуоресценции. Теория кинетики затухания анизотропии будет описана более детально в следующей главе. Здесь рассмотрим флуорофор, находящийся в двух состояниях -свободном и связанном. Кинетика затухания анизотропии дается выражением

(5.60)

где φ_своб и φ_связ - времена вращательной корреляции для флуорофоров в свободном и связанном виде соответственно. Выражение (5.60) справедли­во только в том случае, если время жизни флуорофора одно и то же в обоих состояниях. Предположим, что φ_своб очень короткое (< 1 нс) из-за неболь­шого размера флуорофора. Тогда для наблюдаемого затухания можно за­писать:

(5.61)

Наблюдаемое затухание анизотропии будет одноэкспоненпиальным с временем, корреляции φ_связ. Несвязанный флуорофор не будет влиять на φ_связ но его присутствие будет сказываться па кажущемся значении r(t), равном г_оf_связ при t = 0, и понижать кажущееся значение начальной анизотропии.

Интересно проанализировать общий случай, когда время затухания флуоресценции флуорофора неодинаково в разных состояниях. Тогда кине­тика затухания флуоресценции описывается уравнением

(5.62)

где α_свобτ_своб = f_свое и α_связτ_связ = f_связ Кинетика затухания анизотро­пии равна

(5.63)

Это выражение иллюстрирует потенциальную сложность природы r (t) при наличии двух классов флуорофоров. Например, примем, что время зату­хания связанной формы т_связ больше, чем время затухания свободной формы τ_своб, что типично для зонда,чувствительного к растворителю в области гидрофобного связывания. При длительных временах после импуль­са возбуждения r(t) увеличивается из-за увеличения доли вклада интенсив­ности связанных форм флуорофора. Кинетика увеличения r(t) часто интер­претируется как результат анизотропного вращения флуорофора. Действи­тельно, анизотропные вращения могут определять кинетику увеличения r(t), но, прежде чем давать такую интерпретацию необходимо убедиться, что причиной не является гетерогенность.