рефераты конспекты курсовые дипломные лекции шпоры

Реферат Курсовая Конспект

Реакции ассоциации

Реакции ассоциации - Лекция, раздел Химия, Лекция 9. флуоресцентная спектроскопия Интенсивность поглощения света единицей объема вещества связана с экспериментально измеренными величинами известной формулой Ламберта-Бэра Измерение Поляризации Флуоресценции Или Анизотропии Широко Исполь­Зуется Для ...

Измерение поляризации флуоресценции или анизотропии широко исполь­зуется для количественной оценки реакций ассоциации биологических макромолекул. Связывание антигена с антителом [21], ассоциация белков [22], ассоциации лигандов с белками и нуклеиновыми кислотами [23, 24] – вот только несколько примеров. Предположим, что флуорофор может нахо­диться либо в свободном виде, либо может быть связан с макромолекулой. Наблюдаемое значение анизотропии флуоресценции, когда присутствуют обе формы, дается выражением

(5.53)

 

Где rсвоб и rсвяз— анизотропии свободного и связанного флуорофоров со­ответственно: fСВОб и fсвяз — доли от общей флуоресценции, соответствую­щие каждой форме флуорофора. Естественно, f своб + f связ = 1. Предполо­жим далее, что для данного случая квантовый выход флуорофора не изме­няется при связывании и f своб и f связ соответствуют долям от общего количества флуорофора, находящегося в свободном и связанном состоянии. Этой информации достаточно для вычисления константы диссоциации реак­ции.

Рассмотрим равновесие между лигандом L и белком Р.

(5.54)

Константа диссоциации для этой реакции записывается в виде

(5.55)

 

Доля связанного флуорофора равна

(5.56)

 

где [ L0] = [ L] + [ Р - L] - общая концентрация лиганда или флуорофора. Уравнение (5.53) легко преобразовать к виду

(5.57)

 

В общем случае можно получить значения rсвоб и rсвяз, исследуя флуорофор в отсутствие белка и при высоких концентрациях белка, достаточных для полного связывания флуорофора. По измеренному значению r можно вычис­лить fсвнз и fсвоб Эти значения затем используются для вычисления кон­станты связывания. Наиболее удобная форма уравнения связывания опреде­ляется спецификой анализируемого объекта.

Ценность измерения анизотропии для изучения реакций ассоциации сос­тоит в том, что нет необходимости в изменении интенсивности флуоресцен­ции или спектра испускания флуорофора. Фактически если происходят та­кие изменения, то необходимо более сложное выражение для вычисления f связ из средних значений анизотропии. Если при связывании происходят изменения квантового выхода, анизотропия может изменяться значительно сильнее. Например, рассмотрим связывание профлавина с DNA [ 24]. Извест­но, что поляризация профлавина в воде почти равна нулю, а поляризация формы, связанной с DNA, близка к 0,37. Следовательно, даже если кванто­вый выход или спектр испускания профлавина при связывании остаются пос­тоянными, анизотропия по-прежнему может быть использована для вычисле­ния степени связывания.

Часто квантовый выход флуорофора при связывании изменяется. В этом случае необходимо использовать другую форму уравнения (5.57), учитывающую это изменение. Примем, что R = qсвяз/qсвоб - отноше­ние квантовых выходов связанной и свободной форм. Среднее значение анизотропии связано с долей от общего количества флуорофора, находящегося в связанном состоянии, выражением

(5.58)

 

При К = 1 это выражение сводится к уравнению (5.57). Если же при связывании происходят значительные изменения в квантовом выходе, то их можно использовать для количественной характеристики реакции ассо­циации. Когда изменения малы (в два раза или меньше), предпочтительнее использование анизотропии, особенно если при связывании сильно меняет­ся r. Более того, измерения анизотропии не зависят от общей интенсивнос­ти флуоресценции, благодаря чему можно использовать анизотропию в тех случаях, когда трудно измерить интенсивность из-за свойств образца или особенностей прибора.

СВЯЗЫВАНИЕ ЛУМАЗИНА (2,4-ПТЕРИДИНДОЛА) С ЛУМАЗИНОВЫМ БЕЛКОМ.

Для того чтобы проиллюстрировать влияние связывания белка с лигандом на анизотропию флуоресценции, воспользуемся некоторыми результатами из работы [ 23]. Авторы работы изучили связывание лумазина (L) с лума-зиновым белком (Р) с молекулярной массой 22 000, образующим комплекс (L -Р). При связывании лумазина с белком квантовый выход флуоресцен­ции лумазина увеличивается в~1,4 раза. В табл. 5.3 показаны стационар­ные анизотропии для комплекса L -P, измеренные при различных концен­трациях. Из приведенных данных ясно, что анизотропия флуоресценции раствора уменьшается при разбавлении образца, Это уменьшение объясня­ется диссоциацией комплекса на белок и свободный лумазин, поэтому дан­ные могут быть использованы для вычисления константы диссоциации комп­лекса. В этом частном случае концентрации L и Р равны. Ясно, что [LP] = [р]oбщfсвяз и [L] = [Р] = [Р]oбщ(1 - fсвяз). где [Р]общ - общая концентрация белка.

Константа диссоциации, таким образом, равна:

(5.59)


 

Доля связанного лумазина может быть вычислена из данных табл. 5.3. Предположим, что при общей концентрации 5,44 мкМ весь лумазин связан с белком. Тогда rсвяз = 0,153. Далее предположим, что анизо­тропия свободного лумазина была измерена и найдена равной 0,003. Это значение rсвоб. Используя эти числа и другие значения анизотропии из табл. 5.3, вычислим Кдисс, Например, при концентрации 0,69 мкМ и 21°С анизотропия равна 0,047. Подстановка в уравнение (5.58) дает fсвяз = 0,229, а при подстановке этого значения в уравнение (5.59) получим Кдисс = = 1,79 мкМ.

Концепции, описанные в предыдущем параграфе, приводятся в литературе в различных формах, обычно точно соответствующих конкретному набору экспериментальных условий. Не ставя целью рассмотрение сложности свя­зывания лиганда с белком, мы хотим проиллюстрировать возможность при­менения среднего значения анизотропии для определения относительных ко­личеств флуорофора в каждом из двух окружений. Если это известно, то вы­числение соответствующих констант можно провести по любому приемлемому выражению, описывающему связывание лиганда с белком.

Представляется также интересным обсудить влияние несвязанного флуорофора на кинетику затухания анизотропии флуоресценции. Теория кинетики затухания анизотропии будет описана более детально в следующей главе. Здесь рассмотрим флуорофор, находящийся в двух состояниях -свободном и связанном. Кинетика затухания анизотропии дается выражением

(5.60)

где φсвоб и φсвяз - времена вращательной корреляции для флуорофоров в свободном и связанном виде соответственно. Выражение (5.60) справедли­во только в том случае, если время жизни флуорофора одно и то же в обоих состояниях. Предположим, что φсвоб очень короткое (< 1 нс) из-за неболь­шого размера флуорофора. Тогда для наблюдаемого затухания можно за­писать:

(5.61)

Наблюдаемое затухание анизотропии будет одноэкспоненпиальным с временем, корреляции φсвяз. Несвязанный флуорофор не будет влиять на φсвяз но его присутствие будет сказываться па кажущемся значении r(t), равном гоfсвяз при t = 0, и понижать кажущееся значение начальной анизотропии.

Интересно проанализировать общий случай, когда время затухания флуоресценции флуорофора неодинаково в разных состояниях. Тогда кине­тика затухания флуоресценции описывается уравнением

(5.62)

где αсвобτсвоб = fсвое и αсвязτсвяз = fсвяз Кинетика затухания анизотро­пии равна

(5.63)

Это выражение иллюстрирует потенциальную сложность природы r (t) при наличии двух классов флуорофоров. Например, примем, что время зату­хания связанной формы тсвяз больше, чем время затухания свободной формы τсвоб, что типично для зонда,чувствительного к растворителю в области гидрофобного связывания. При длительных временах после импуль­са возбуждения r(t) увеличивается из-за увеличения доли вклада интенсив­ности связанных форм флуорофора. Кинетика увеличения r(t) часто интер­претируется как результат анизотропного вращения флуорофора. Действи­тельно, анизотропные вращения могут определять кинетику увеличения r(t), но, прежде чем давать такую интерпретацию необходимо убедиться, что причиной не является гетерогенность.

 

– Конец работы –

Эта тема принадлежит разделу:

Лекция 9. флуоресцентная спектроскопия Интенсивность поглощения света единицей объема вещества связана с экспериментально измеренными величинами известной формулой Ламберта-Бэра

Лекция флуоресцентная спектроскопия... Люминисценцией является излучение фотонов электронно возбужденными состояниями... В настоящее время метод собственной люминесценции широко используется в биофизике и биохимии благодаря относительной...

Если Вам нужно дополнительный материал на эту тему, или Вы не нашли то, что искали, рекомендуем воспользоваться поиском по нашей базе работ: Реакции ассоциации

Что будем делать с полученным материалом:

Если этот материал оказался полезным ля Вас, Вы можете сохранить его на свою страничку в социальных сетях:

Все темы данного раздела:

Параметры флуоресценции и их применение к исследованию биологических макромолекул
    Спектры флуоресценции.   –   мера положения спектра

Поляризация флуоресценции.
При возбуждении поляризованным светом испускание флуоресцирующего образца также поляризовано. Поляризация является результатом фотоотбора флуорофоров в соответствии с их ориентацией по отношению к

Определения поляризации и анизотропии
Принцип измерения поляризации флуоресценции или анизотропии иллюстрирует рис. 5.1. Образец возбуждается вертикально поляризованным светом, причем электрический вектор возбуждающего пучка ориентиров

Влияние вращательной диффузии на анизотропию флуоресценции. Уравнение Перрена
  Главная причина деполяризации флуоресценции – вращательная диффузия флуорофоров. Этот вид деполяризации описывается уравнением Перрена которое может быть выведено несколькими способ

Оценка микровязкости клеточных мембран
В предыдущем разделе указывалось, что анизотропия флуоресценции сильно зависит от вязкости раствора, в котором растворен флуорофор. Именно эта зависимость привела к использованию измерения анизотро

Вращательная диффузия белков
Первым биохимическим применением метода поляризационной флуоресценции была оценка времен вращательной корреляции белков [16]. Общепри­нятым подходом является ковалентное маркирование белка внешним

Хотите получать на электронную почту самые свежие новости?
Education Insider Sample
Подпишитесь на Нашу рассылку
Наша политика приватности обеспечивает 100% безопасность и анонимность Ваших E-Mail
Реклама
Соответствующий теме материал
  • Похожее
  • Популярное
  • Облако тегов
  • Здесь
  • Временно
  • Пусто
Теги