рефераты конспекты курсовые дипломные лекции шпоры

Реферат Курсовая Конспект

Оценка микровязкости клеточных мембран

Оценка микровязкости клеточных мембран - Лекция, раздел Химия, Флуоресцентная спектроскопия интенсивность поглощения света единицей объема вещества связана с экспериментально измеренными величинами известной формулой Ламберта-Бэра В Предыдущем Разделе Указывалось, Что Анизотропия Флуоресценции Сильно Зависи...

В предыдущем разделе указывалось, что анизотропия флуоресценции сильно зависит от вязкости раствора, в котором растворен флуорофор. Именно эта зависимость привела к использованию измерения анизотропии для оценки микровязкости в области ацильных боковых цепей клеточных мембран. Выбирают флуорофор, который распределяется в такое неполярное окружение. Как правило, для этой цели служат перилен, 9-винилантрацен, 2-метилантрацен [ 4, 12] и дифенилгексатриен [ 13]. Последнее из указанных веществ наиболее широко используется в настоящее время по соображениям, которые будут обсуждены ниже. Первоначально выбирают подходящий растворитель сравнения и строят градуировочную кривую — зависимость измеренных значений анизотропии флуоресценции от известной вязкости растворителя сравнения. Типичная градуировочная кривая приведена на рис. 5.11.

 

РИС. 5.11. Градуировочная кривая для оценки микровязкости мембран [12].

Приведены данные по анизотропии перилена (1), 2-метилантрацена (2) и 9-винилантрацена (3) в минеральном масле.

Затем измеряют анизотропию флуоресценции для того же флуорофора, распределенного в области ацильных боковых цепей липидного бислоя. Внутренняя вязкость бислоя оценивается при сравнении с градуировочной кривой. Для малых ароматических молекул, по-видимому, наиболее вероятно то, что их эффективный молекулярный объем V будет один и тот же в растворителе и в липидном бислое. В результате градуировочная кривая зависимости r от η в растворителе известной вязкости позволяет связать анизотропию мембранно-связанного флуорофора с микровязкостью мембраны.

Типичные результаты по микровязкости, полученные при использовании перилена, показаны на рис. 5.12. Яичный фосфатидилхолин представляет собой смесь ненасыщенных фосфолипидов, которые не претерпевают фазовых переходов в изученном температурном диапазоне. Кажущаяся микровязкость низка (кривая 2) и монотонно возрастает с изменением К-1, Дипальмитоилфосфатидилхолин – насыщенный фосфолипид, фазовый переход которого отражается в резком уменьшении микровязкости, наблюдаемом вблизи 37 °С (кривая 1).

 

 

РИС. 5.12. Результаты определения микровязкости диспергированных фосфолипидных мембран по измерению анизотропии перилена [12].

Приведены кажущиеся микровязкости для дипальмитоилфосфатидилхопина (1), яичного фосфатидилхолина (2) и смесей DPPC + холестерин (3, 4), для которых указаны молярные соотношения.

 

Ниже температуры перехода липидные бислои, состоящие из насыщенных липидов, должны быть довольно вязкими. На рис. 5.12 также показана кажущаяся микровязкость смесей DPPC + холестерин (кривые 3, 4). Холестерин обычно увеличивает кажущуюся микровязкость мембран. Для определения микровязкостей, приведенных на рис. 5.11 для всех трех флуорофоров, в качестве растворителя сравнения было применено минеральное масло. Эквивалентные микровязкости были получены для каждой из этих систем, что увеличивает достоверность полученных значений. Однако было бы более желательно использовать три разных растворителя сравнения, чем изучать три разные системы, так как в этом случае эксперименты выявили бы связь между скоростью вращения флуорофоров и макроскопической вязкостью растворителей [14].

После этих начальных наблюдений измерения анизотропии флуоресценции стали широко использоваться для исследования динамики мембран. Некоторые благоприятные характеристики метода, а именно относительно простая теоретическая основа, несложное и сравнительно недорогое оборудование и высокая чувствительность измерений, способствовали его широкому распространению. Благодаря высокой чувствительности появилась возможность проведения экспериментов в разбавленных суспензиях мембран, содержащих только следовые количества зондов. Типичное молярное соотношение липид/зонд находится в диапазоне 200 : 1 — 2000 : 1, а типич­ная концентрация липидов составляет 0,1 - 10 мг/мл.

На протяжении последнего десятилетия наиболее широкоиспользуемым зондом для оценки вязкости мембран был DPH. Это, по-видимому, вызвано несколькими причинами. У DPH высокий коэффициент экстинкции (~80000 М-1 . см-1), что позволяет исследовать разбавленные растворы, а предельная анизотропия постоянна в диапазоне 320 — 380 нм, что определяет выбор длины волны возбуждения. Деполяризационные вращения DPH, по-видимому, изотропны. Вращение вокруг длинной оси молекулы может быть быстрым, но оно не смещает момента перехода, и, следовательно, такое вращение неактивно в деполяризации. (Искривления, заметные на рис. 5.11 для других зондов, происходят частично из-за анизотропных вращений несимметричных молекул.) И наконец, отчетливо проявляются фазовые переходы мембран. Этот факт иллюстрирует рис. 5.13, на котором приведены микровязкости, определенные с помощью DPH, для фосфолипидных везикул различного химического состава [15]. Из полученных данных видно, что кажущаяся микровязкость бислоев сильно зависит от их фазового состояния. Интересно отметить, что с другими флуорофорами, такими, как 12-антроилоксистеарат, 1-анилино-8-нафталинсульфонат, N-фенил-1-нафтил-амин, перилен и 9-винилантрацен, наблюдаются менее резкие изменения.

РИС. 5.13. Значения кажущейся микровязкости, полученные из измерений анизотропии DPH [15].

Приведены значения натурального логарифма кажущейся микровязкости от обратной температуры для малых однослойных везикул, приготовленных из DOPC (1), DMPC (2), DPPC (3), DSPC (4).

Очевидно, что измерения анизотропии флуоресценции могут значи­тельно расширить возможности изучения физико-химических свойств липидных бислоев. Однако важно понять и запомнить допущения, которые были сделаны при оценке микровязкости. Главное из них состоит в том, что градуировочная кривая, построенная при использовании изотропного растворителя сравнения, пригодна для флуорофоров, распределенных в анизотропное окружение липидных бислоев. Приходится принимать, что деполяризационные движения флуорофора идентичны в таком разном окружении. Это предположение было проверено несколькими другими методами (разд. 6.2.1), и в настоящее время известно, что оно некорректно: в липидных бислоях диффузионные движения флуорофоров обычно затруднены, т.е. флуорофоры не могут вращаться больше чем на определенный угол. В изотропном растворителе сравнения подобных угловых ограничений нет. Это не умаляет пользы измерений анизотропии для изучения клеточных мембран, но показывает, что нужно быть осторожным в интерпретации получаемых значений микровязкости.

 

– Конец работы –

Эта тема принадлежит разделу:

Флуоресцентная спектроскопия интенсивность поглощения света единицей объема вещества связана с экспериментально измеренными величинами известной формулой Ламберта-Бэра

Лекция флуоресцентная спектроскопия.. Люминисценцией является излучение фотонов электронно возбужденными состояниями.. В настоящее время метод собственной люминесценции широко используется в биофизике и биохимии благодаря относительной..

Если Вам нужно дополнительный материал на эту тему, или Вы не нашли то, что искали, рекомендуем воспользоваться поиском по нашей базе работ: Оценка микровязкости клеточных мембран

Что будем делать с полученным материалом:

Если этот материал оказался полезным ля Вас, Вы можете сохранить его на свою страничку в социальных сетях:

Все темы данного раздела:

Параметры флуоресценции и их применение к исследованию биологических макромолекул
    Спектры флуоресценции.   –   мера положения спектра

Поляризация флуоресценции.
При возбуждении поляризованным светом испускание флуоресцирующего образца также поляризовано. Поляризация является результатом фотоотбора флуорофоров в соответствии с их ориентацией по отношению к

Определения поляризации и анизотропии
Принцип измерения поляризации флуоресценции или анизотропии иллюстрирует рис. 5.1. Образец возбуждается вертикально поляризованным светом, причем электрический вектор возбуждающего пучка ориентиров

Влияние вращательной диффузии на анизотропию флуоресценции. Уравнение Перрена
  Главная причина деполяризации флуоресценции – вращательная диффузия флуорофоров. Этот вид деполяризации описывается уравнением Перрена которое может быть выведено несколькими способ

Вращательная диффузия белков
Первым биохимическим применением метода поляризационной флуоресценции была оценка времен вращательной корреляции белков [16]. Общепри­нятым подходом является ковалентное маркирование белка внешним

Реакции ассоциации
Измерение поляризации флуоресценции или анизотропии широко исполь­зуется для количественной оценки реакций ассоциации биологических макромолекул. Связывание антигена с антителом [21], ассоциация бе

Хотите получать на электронную почту самые свежие новости?
Education Insider Sample
Подпишитесь на Нашу рассылку
Наша политика приватности обеспечивает 100% безопасность и анонимность Ваших E-Mail
Реклама
Соответствующий теме материал
  • Похожее
  • Популярное
  • Облако тегов
  • Здесь
  • Временно
  • Пусто
Теги