рефераты конспекты курсовые дипломные лекции шпоры

Реферат Курсовая Конспект

Вращательная диффузия белков

Вращательная диффузия белков - Лекция, раздел Химия, Флуоресцентная спектроскопия интенсивность поглощения света единицей объема вещества связана с экспериментально измеренными величинами известной формулой Ламберта-Бэра Первым Биохимическим Применением Метода Поляризационной Флуоресценции Была Оц...

Первым биохимическим применением метода поляризационной флуоресценции была оценка времен вращательной корреляции белков [16]. Общепри­нятым подходом является ковалентное маркирование белка внешним флуорофором. Флуорофор выбирают главным образом на основании времени затухания флуоресценции. Время затухания должно быть сравнимо с предпола­гаемым временем вращательной корреляции белка. Таким образом, анизотро­пия будет отражать изменение этого параметра [уравнения (5.44) и (5.49)]. Обычно поляризация флуоресценции определяется из ее зависимости от Т/η. Температуру изменяют обычным способом, а вязкость – путем добавления сахара. График строят в координатах либо (1/Р- 1/3), либо 1/r от Т/η (рис. 5.14). Экспериментально доступен только ограниченный диапазон значений T/η. При высокой температуре ограничение связано с нестабиль­ностью белков, а при низкой - с замерзанием и изменением растворимости. Отсекаемый отрезок на оси у должен быть равен (1/Р0 - 1/3) или (1/r0), где Р0 и r 0 – значения, получаемые для того же флуорофора в стеклообразном растворе. В первом приближении Pо(rо) можно считать свойством флуорофора Ближайшее окружение может влиять на Р0, но влияние обычно мало и срав­нимо по величине с влиянием растворителя на спектр поглощения флуорофо­ра. В следующем параграфе мы обсудим причины различий в экстраполиро­ванных значениях Р0. Если время затухания флуоресценции известно, объем молекулы белка может быть вычислен из наклона и отсекаемого отрезка графика Перрена (рис. 5.14). Объем связан с временем вращательной корре­ляции белка уравнением (5.41).

Для глобулярных белков время вращательной корреляции приближенно связано с молекулярной массой М белка соотношением


(5.50)

 

где ν — удельный объем белка; h - величина гидратации (обычно 0,2 г Н20 на 1г белка).

РИС. 5.14. График Перрена для оценки молекулярных объемов. Штриховой линией показано влияние сегментальных движений зонда.

 

По уравнению (5.50) можно найти, что время корреляции гидратированного белка приблизительно на 12 % больше, чем предполагается для безводной сферы. Обычно наблюдаемые значения φ приблизительно в два раза больше, чем предполагаемые для безводной сферы [ 17]. Большие наблюдаемые значения являются, вероятно, результатом того, что боль­шинство белков имеет несферическую форму и эффективная оболочка растворителя больше для вращательной диффузии, чем для гидратации.

В реальных экспериментах часто получаются разные результаты в зави­симости от того, что именно варьируется - температура или вязкость. Ти­пичные результаты для иммуноглобулина G, маркированного диметиламино-нафталин-5-сульфохлоридом, приведены на рис. 5.15. Главным и в то же время вводящим в заблуждение свойством координат Перрена является увели­чение экстраполируемого значения 1/Р0 (уменьшение значения Р0) по мере увеличения температуры. Такое поведение обычно приписывают гибкости зонда на макромолекуле.

РИС. 5.15. Поляризация флуоресценции DNS-γ-иммуноглобулина [18].

а – прямые проведены через точки, полученные при одной и той же температуре. б – прямые проведены через точки, измеренные при разных температурах. На обо­их рисунках одни и те. же данные.

 

На вопрос, какое значение Р0 следует использовать для вычисления вре­мени вращательной корреляции белка – экстраполированное (Р0') или зна­чение для замороженного раствора (P0), – полностью корректного ответа нет, и нужно рассматривать специфические особенности каждого отдельного экс­перимента. Обычно экстраполированное значение Ро' дает лучшую оценку φ, поскольку в нем учитывается сегментальное движение зонда и частично вычи­тается влияние этого движения на вычисленное значение φ. Например, предпо­ложим, что сегментальное движение флуорофора значительно быстрее, чем вращательная диффузия белка. Тогда значение Р0 эффективно снижается:

(5.51)

 

 

где штрихом отмечено экстраполированное значение, а β — угол, на который флуорофор свободно вращается (см. рис. 5.14). Подобным же образом сег­ментальные движения снижают экстраполированную анизотропию r'0

(5.52)

РИС. 5.16. График Перрена для комплекса DNA с профлавином [24]

 

При очень быстром сегментальном движении (φ « τ) и наклон, и отсе­каемый отрезок на графике Перрена меняются. Член (1/Р0' —1/3) сокращает­ся при расчете молекулярного объема, и вычисленное время корреляции отражает общую скорость вращения белка. Важно отметить, что если φ не намного меньше, чем τ, а это часто встречается, то кажущееся время корреляции может существенно изменяться под влиянием сегментальных движений [19, 20].

Не следует пренебрегать информацией, получаемой из сравнения зна­чений Р0 и Р'0. если P'0 намного меньше, чем Р0, то можно сделать вывод о существовании сегментальных движений зонда на макромолекуле. Протя­женность этих движений может быть оценена при использовании уравнений (5.51) - (5.52). Другое явление, часто встречающееся на графиках Перрена,— быстрое увеличение 1/Р- 1/3 при высоких температурах, как это показано на рис. 5.16 для денатурации двойной спирали DNA. Увеличение 1/Р обычно является результатом денатурации макромолекулы, приводящей к увеличению сегментальной подвижности флуорофора.

– Конец работы –

Эта тема принадлежит разделу:

Флуоресцентная спектроскопия интенсивность поглощения света единицей объема вещества связана с экспериментально измеренными величинами известной формулой Ламберта-Бэра

Лекция флуоресцентная спектроскопия.. Люминисценцией является излучение фотонов электронно возбужденными состояниями.. В настоящее время метод собственной люминесценции широко используется в биофизике и биохимии благодаря относительной..

Если Вам нужно дополнительный материал на эту тему, или Вы не нашли то, что искали, рекомендуем воспользоваться поиском по нашей базе работ: Вращательная диффузия белков

Что будем делать с полученным материалом:

Если этот материал оказался полезным ля Вас, Вы можете сохранить его на свою страничку в социальных сетях:

Все темы данного раздела:

Параметры флуоресценции и их применение к исследованию биологических макромолекул
    Спектры флуоресценции.   –   мера положения спектра

Поляризация флуоресценции
При возбуждении поляризованным светом испускание флуоресцирующего образца также поляризовано. Поляризация является результатом фотоотбора флуорофоров в соответствии с их ориентацией по отношению к

Определения поляризации и анизотропии
Принцип измерения поляризации флуоресценции или анизотропии иллюстрирует рис. 5.1. Образец возбуждается вертикально поляризованным светом, причем электрический вектор возбуждающего пучка ориентиров

Влияние вращательной диффузии на анизотропию флуоресценции. Уравнение Перрена
  Главная причина деполяризации флуоресценции – вращательная диффузия флуорофоров. Этот вид деполяризации описывается уравнением Перрена которое может быть выведено несколькими способ

Оценка микровязкости клеточных мембран
В предыдущем разделе указывалось, что анизотропия флуоресценции сильно зависит от вязкости раствора, в котором растворен флуорофор. Именно эта зависимость привела к использованию измерения анизотро

Реакции ассоциации
Измерение поляризации флуоресценции или анизотропии широко исполь­зуется для количественной оценки реакций ассоциации биологических макромолекул. Связывание антигена с антителом [21], ассоциация бе

Хотите получать на электронную почту самые свежие новости?
Education Insider Sample
Подпишитесь на Нашу рассылку
Наша политика приватности обеспечивает 100% безопасность и анонимность Ваших E-Mail
Реклама
Соответствующий теме материал
  • Похожее
  • Популярное
  • Облако тегов
  • Здесь
  • Временно
  • Пусто
Теги