Вращательная диффузия белков

Первым биохимическим применением метода поляризационной флуоресценции была оценка времен вращательной корреляции белков [16]. Общепри­нятым подходом является ковалентное маркирование белка внешним флуорофором. Флуорофор выбирают главным образом на основании времени затухания флуоресценции. Время затухания должно быть сравнимо с предпола­гаемым временем вращательной корреляции белка. Таким образом, анизотро­пия будет отражать изменение этого параметра [уравнения (5.44) и (5.49)]. Обычно поляризация флуоресценции определяется из ее зависимости от Т/η. Температуру изменяют обычным способом, а вязкость – путем добавления сахара. График строят в координатах либо (1/Р- 1/3), либо 1/r от Т/η (рис. 5.14). Экспериментально доступен только ограниченный диапазон значений T/η. При высокой температуре ограничение связано с нестабиль­ностью белков, а при низкой - с замерзанием и изменением растворимости. Отсекаемый отрезок на оси у должен быть равен (1/Р₀ - 1/3) или (1/r₀), где Р₀ и r ₀ – значения, получаемые для того же флуорофора в стеклообразном растворе. В первом приближении P_о(r_о) можно считать свойством флуорофора Ближайшее окружение может влиять на Р₀, но влияние обычно мало и срав­нимо по величине с влиянием растворителя на спектр поглощения флуорофо­ра. В следующем параграфе мы обсудим причины различий в экстраполиро­ванных значениях Р₀. Если время затухания флуоресценции известно, объем молекулы белка может быть вычислен из наклона и отсекаемого отрезка графика Перрена (рис. 5.14). Объем связан с временем вращательной корре­ляции белка уравнением (5.41).

Для глобулярных белков время вращательной корреляции приближенно связано с молекулярной массой М белка соотношением

где ν — удельный объем белка; h - величина гидратации (обычно 0,2 г Н₂0 на 1г белка).

РИС. 5.14. График Перрена для оценки молекулярных объемов. Штриховой линией показано влияние сегментальных движений зонда.

По уравнению (5.50) можно найти, что время корреляции гидратированного белка приблизительно на 12 % больше, чем предполагается для безводной сферы. Обычно наблюдаемые значения φ приблизительно в два раза больше, чем предполагаемые для безводной сферы [ 17]. Большие наблюдаемые значения являются, вероятно, результатом того, что боль­шинство белков имеет несферическую форму и эффективная оболочка растворителя больше для вращательной диффузии, чем для гидратации.

В реальных экспериментах часто получаются разные результаты в зави­симости от того, что именно варьируется - температура или вязкость. Ти­пичные результаты для иммуноглобулина G, маркированного диметиламино-нафталин-5-сульфохлоридом, приведены на рис. 5.15. Главным и в то же время вводящим в заблуждение свойством координат Перрена является увели­чение экстраполируемого значения 1/Р₀ (уменьшение значения Р₀) по мере увеличения температуры. Такое поведение обычно приписывают гибкости зонда на макромолекуле.

РИС. 5.15. Поляризация флуоресценции DNS-γ-иммуноглобулина [18].

а – прямые проведены через точки, полученные при одной и той же температуре. б – прямые проведены через точки, измеренные при разных температурах. На обо­их рисунках одни и те. же данные.

На вопрос, какое значение Р₀ следует использовать для вычисления вре­мени вращательной корреляции белка – экстраполированное (Р₀') или зна­чение для замороженного раствора (P₀), – полностью корректного ответа нет, и нужно рассматривать специфические особенности каждого отдельного экс­перимента. Обычно экстраполированное значение Р_о' дает лучшую оценку φ, поскольку в нем учитывается сегментальное движение зонда и частично вычи­тается влияние этого движения на вычисленное значение φ. Например, предпо­ложим, что сегментальное движение флуорофора значительно быстрее, чем вращательная диффузия белка. Тогда значение Р₀ эффективно снижается:

(5.51)

где штрихом отмечено экстраполированное значение, а β — угол, на который флуорофор свободно вращается (см. рис. 5.14). Подобным же образом сег­ментальные движения снижают экстраполированную анизотропию r'₀

(5.52)

РИС. 5.16. График Перрена для комплекса DNA с профлавином [24]

При очень быстром сегментальном движении (φ « τ) и наклон, и отсе­каемый отрезок на графике Перрена меняются. Член (1/Р₀' —1/3) сокращает­ся при расчете молекулярного объема, и вычисленное время корреляции отражает общую скорость вращения белка. Важно отметить, что если φ не намного меньше, чем τ, а это часто встречается, то кажущееся время корреляции может существенно изменяться под влиянием сегментальных движений [19, 20].

Не следует пренебрегать информацией, получаемой из сравнения зна­чений Р₀ и Р'₀. если P'₀ намного меньше, чем Р₀, то можно сделать вывод о существовании сегментальных движений зонда на макромолекуле. Протя­женность этих движений может быть оценена при использовании уравнений (5.51) - (5.52). Другое явление, часто встречающееся на графиках Перрена,— быстрое увеличение 1/Р- 1/3 при высоких температурах, как это показано на рис. 5.16 для денатурации двойной спирали DNA. Увеличение 1/Р обычно является результатом денатурации макромолекулы, приводящей к увеличению сегментальной подвижности флуорофора.