Влияние вращательной диффузии на анизотропию флуоресценции. Уравнение Перрена

 

Главная причина деполяризации флуоресценции – вращательная диффузия флуорофоров. Этот вид деполяризации описывается уравнением Перрена которое может быть выведено несколькими способами [3, 8]. Мы предпочитаем прямой вывод, основанный на том факте, что после возбуждения 5-импульсом кинетика затухания анизотропии r(t) для сферической молекулы описывается одноэкспоненциальным уравнением:

 

(5.40)

 

В этом уравнении ф – время вращательной корреляции флуорофора, которое зависит от вязкости η, температуры Т раствора и объема вращающейся области V;

 

(5.41)

 

Одноэкспоненциальное затухание r(t) верно только для сферических молекул. Для несимметричных частиц или молекул предсказываются более сложные выражения.

Пусть I(t) отображает кинетику затухания общей интенсивности флуоресценции [I₁₁(t) + 2 I₁(t)]. Стационарное измерение анизотропии является в действительности усреднением r(t) с весом I(t). Таким образом,

 

(5.42)

 

Для флуорофоров в гомогенном окружении можно ожидать, что затухание I(t} будет одноэкспоненциальным:

 

(5.43)

 

где т – время затухания флуоресценции. Подстановка уравнений (5.40) и (5.43) в (5.42) дает уравнение

(5.44),

 

которое и является одной из форм уравнения Перрена,

Полезно рассмотреть влияние вращательной диффузии, или, иначе говоря, времени вращательной корреляции, на стационарную анизотропию. Рассмотрим два случая: сильно вязкий раствор, где у » т и измеряемое значение равно r ₀, и молекулу в жидком растворе, где <р « т, а наблюдаемая анизотропия будет равна нулю. В качестве примера мы можем использовать уравнение (5.41), для того чтобы вычислить время вращательной корреляции перилена в этаноле при 20 °С, которое равно 0,092 нc. Для этих вычислений принимаем молярную массу равной 252 г/моль, плотность - 1,35 г/мл, л = 1,194 сП, Т = 293 К, V = 187 см³ /моль и R = 8,314 • 10 7 эрг/(моль • К). При r₀ = 0,36 и т = 6 нc получаем, что анизотропия должна быть равна 0,005. Если перилен растворен в пропиленгликоле при 25 °С (т) = 32 сП), анизотропия должна быть примерно 0,1. Это как раз та зависимость анизотропии от времени вращательной корреляции, которая является первопричиной широко распространенного применения этих измерений для изучения размеров и формы макромолекул, равно как и их динамических свойств в наносекундной временной шкале. Степень деполяризации можно связать со средним значением cos ²y, где у — угол,на который флуорофор поворачивается в течение времени нахождения в возбужденном состоянии:

(5.45)

 

Если вращения нет, то у = 0 и t = r₀. Анизотропия равна нулю, когда у = 54,7°. Однако, подчеркиваем, более точной интерпретацией условия r = 0 является равенство среднего значения cos²y = 1/3.

Уравнение Перрена часто записывают в другом виде. Наиболее типичные формы следующие:

(5.46)(5.47)

 

(5,48)

 

 

(5.49)

 

где R - скорость вращения флуорофора (φ^-1 = 6R); R_g - универсальная газовая постоянная; ρ - время вращательной релаксации (ρ = 3 < φ). Ясно, что выражения в единицах анизотропии проще, но уравнения (5.48) и (5.49) часто встречаются в литературе.

 

РАЗДЕЛЬНОЕ НАБЛЮДЕНИЕ ИНДИВИДУАЛЬНЫХ СКОРОСТЕЙ ВРАЩЕНИЯ ПУТЕМ подбора ДЛИНЫ ВОЛНЫ возбуждения. В нашем выводе уравнения Перрена мы предполагали, что затухание анизотропии флуоресценции, следующее за δ-импульсом возбуждения, подчиняется одноэкспоненциальному закону. Это предположение эквивалентно допущению, что деполяризационные вращения флуорофора симметричны или изотропны. Часто молекулы не симметричны, и следует ожидать различных скоростей вращения вокруг каждой молекулярной оси. Интересен в этом отношении перилен, дискообразная молекула которого (рис. 5.10) может вращаться вокруг оси, перпендикулярной к плоскости молекулы. Такое вращение называется вращением в плоскости (R_пл). Это вращение может происходить без заметного смещения ближайших молекул растворителя. И наоборот, перилен может вращаться так, что плоскость молекулы сместится; такое вращение называется внеплоскостным (R_вп). Возможны два типа таких движений, но для простоты они предполагаются равными. Внеплоскостное вращение требует большего смещения растворителя, чем плоскостное, и следовательно, ожидают, что скорость R_пл будет выше, чем R_вп. Можно получить оценку этих индивидуальных скоростей вращения, измеряя анизотропию при разных длинах волн возбуждения [10, 11].

В разд. 5.3. было указано, что значение r₀, измеренное в разбавленном стеклообразном растворе, служит мерой угла α между моментами перехода в поглощении и испускании. Так как r_o — функция длины волны возбуждения, то можно выбрать α путем подбора длины волны. Строго говоря, возбуждение при длинах волн, когда r₀ = 0,4, 0,1 и -0,2, позволяет оценить соответственно [10]. Это приближение в точности выполняется только для малых угловых смещений флуорофора. Выбор типов вращения иллюстрирует рис. 5.10. Рассмотрим, во-первых, возбуждение в длинноволновой области поглощения, где r₀ приближается к 0,4. Плоскостное вращение, так же как и одно из внеплоскостных вращений, смещает момент перехода, поэтому оба вращения активны в процессе деполяризации. Второе внеплоскостное вращение вокруг оси z не смещает диполь испускания и, таким образом, неактивно при деполяризации. Следовательно, наблюдаемая деполяризация связана только с двумя движениями, хотя считается, что существуют три возможных вращательных движения. Наблюдаемая скорость вращения < R > равна, таким образом, . Подобными рассуждениями можно показать, что при r₀ = -0,2 при деполяризации активно только R_пл. Для этого значения г₀ моменты поглощения и испускания находятся под углом 90° друг к другу. R_пл смещает момент испускания, и, таким образом, активно. Однако для α = 90° два внеплоскостных вращения неактивны. Вращение вокруг оси х не смещает Е. Вращение вокруг оси z неактивно потому, что благодаря симметрии популяция возбужденных молекул всегда случайно ориентирована вокруг оси z. В результате наблюдаемым типом вращения для r₀ = - 0,2 является R_пл.

И наконец, для r₀ = 0,1 только R_вп активно при деполяризации. Внеплоскостное вращение вокруг оси z снова неактивно из-за симметричного распределения возбужденных флуорофоров вокруг этой оси. Плоскостное вращение вокруг оси у неактивно потому, что для этого особого случая α = 45°, и популяция возбужденных флуорофоров снова симметрична относительно этой оси. Движением, которое смещает Е, является только вращение R_вп вокруг оси х. Следовательно, подбирая r₀, можно изучать анизотропию вращения флуорофора. Для симметрично вращающейся молекулы изменение r₀ не будет оказывать влияния на наблюдаемую скорость вращения. Однако, если деполяризующие вращения не изотропны, то вариации r₀ будут изменять кажущуюся скорость вращения. Еще раз отметим, что такое рассмотрение строго применимо только для малых степеней деполяризации, или, что то же самое, для самых малых угловых смещений.