Реферат Курсовая Конспект
Практикум - раздел Биотехнологии, ОСНОВЫ БИОТЕХНОЛОГИИ Работа № 1. Знакомство С Питательными Среды Для Культивирования Изолированных...
|
Работа № 1. Знакомство с питательными среды для культивирования изолированных клеток и тканей растений.
Основные компоненты питательных сред:
- макроэлементы (азот, фосфор, калий, кальций, сера, магний, железо);
- микроэлементы (бор, цинк, медь, марганец, кобальт, йод, молибден);
- витамины;
- аминокислоты, пептиды (гидрализаты казеина), углеводы (сахароза или глюкоза);
- фитогормоны (ауксины и цитокинины) и другие биорегуляторы;
- этилендиаминотетрауксусная кислота (ЭДТА).
Источники ауксинов в питательных средах - 2,4-дихлорфеноксиуксусная кислота (2,4-Д), индолилуксусная кислота (ИУК), индолилмасляная кислота (ИМК), нафтилуксусная кислота (НУК); источники цитокининов - аденин, кинетин, 6-бензиламинопурин (6-БАП), зеатин, 2ip. Для регуляции роста используют гиббереловую кислоту (ГК). ИУК в 30 раз менее активна, чем 2,4-Д. Для индукции каллуса используют высокие концентрации 2,4-Д. Ауксины вызывают процессы дедифференцировки клетки, подготавливают ее к делению. Затем цитокинины инициируют деление клеток. Молекулярный механизм действия ауксинов связан с индукцией ими синтеза главной протеинкиназы клеточного деления Р34cdc2, а цитокинины индуцируют синтез циклинов, регулирующих прохождение клетки по клеточному циклу. Таким образом, действие этих биорегуляторов (растительных гормонов) проявляется только при последовательном или одновременном внесении их в среду.
Для культивирования клеток, тканей и органов растений используют следующие питательные среды.
Среда Мурасиге-Скуга
Компоненты питательной среды, мг/л | |||
NH4NO3 | KJ | 0,83 | |
KNO3 | FeSO4×7H2O | 27,8 | |
CaCl2×2H2O | Na2EDTA×2H2O | 37,3 | |
MgSO4×7H2O | Тиамин-HCl | 0,1 | |
KH2PO4 | Пиридоксин-HCl | 0,5 | |
MnSO4×4H2O | 24,1 | Никотиновая к-та | 0,5 |
CoCl2×6H2O | 0,025 | Мезоинозит | |
ZnSO4×7H2O | 8,6 | Глицин | 2,0 |
CuSO4×5H2O | 0,025 | Сахароза | |
Na2MoO4×2H2O | 0,25 | ||
рН 5,6-5,8 |
Среда Уайта
Компоненты питательной среды, мг/л | |||
Ca(NO3)2 | CuSO4×5H2O | 0,02 | |
MgSO4×7H2O | ZnSO4 | 1,5 | |
Na2SO4 | Na2MoO4×2H2O | 0,0025 | |
KNO3 | KJ | 0,75 | |
KCl | Пиридоксин HCl | 0,1 | |
NaH2PO4 | 16,5 | Тиамин-HCl | 0,1 |
H3BO3 | 1,5 | Никотиновая к-та | 0,5 |
MnSO4 | 4,5 | Глицин | 3,0 |
Fe2(SO4)3 | 2,5 | Сахароза | |
рН 5,6-5,8 |
Среда Гамборга и Эвелега (В5)
Компоненты питательной среды, мг/л | |||
NaH2PO4 | Na2EDTA×2H20 | 30,0 | |
KNO3 | Na2MoO4×2H2O | 0,25 | |
(NH4)2SO4 | KJ | 0,75 | |
MgSO4×7H2O | FeSO4×7H2O | ||
CaCl2×2H2O | Тиамин-HCl | ||
H3BO3 | 3,0 | Пиридоксин HCl | 1,0 |
MnSO4×4H2O | 10,0 | Никотиновая к-та | 1,0 |
CoCl2×6H2O | 0,025 | Мезоинозит | |
CuSO4×5H2O | 0,025 | 2,4-Д | 2,0 |
ZnSO4×7H2O | 2,0 | Сахароза | |
рН 5,8 |
1. Сравните составы трех питательных сред. Найдите отличия. Сгруппируйте составные компоненты питательных сред (макроэлементы, микроэлементы, молекулы пластического обмена, биорегуляторы, ЭДТА). Свяжите состав питательных сред с молекулярными процессами в культивируемых клетках, тканях, органах.
2. Питательные среды готовят из «маточных» растворов, которые хранят при низкой температуре. В «маточных» растворах повышена концентрация макроэлементов в 10-20 раз, микроэлементов – в 100-1000 раз, витаминов – в 1000 раз. Предложите варианты «маточных» растворов солей макроэлементов, Fe-хелата (FeSO4×7H2O + Na2EDTA×2H20), солей микроэлементов, витаминов, биорегуляторов для быстрого приготовления рабочих питательных сред для культивирования.
Работа 2. Цветные реакции на белки и аминокислоты.
Диагностическое значение и принцип реакций. Цветные реакции дают возможность обнаружить присутствие белка в биологических жидкостях и получить представление об его аминокислотном составе.
Биуретовая реакция открывает пептидную связь в белке. Ее способны давать вещества, которые содержат не менее двух пептидных связей. При добавлении сернокислой меди к сильнощелочному раствору белка или полипептида образуются соединения меди с пептидной группировкой, окрашенные в красно-фиолетовый или сине-фиолетовый цвет в зависимости от длины полипептидной цепи. Раствор белка дает сине-фиолетовое окрашивание, а продукты неполного его гидролиза (пептоны) - розовое или красное окрашивание.
Нингидриновая реакция характерна для a-аминогрупп. Растворы белка, a-аминокислот и пептидов при нагревании с нингидрином дают синее или фиолетовое окрашивание. В этой реакции a-аминокислоты и пептиды окисляются нингидрином и подвергаются окислительному дезаминированию и декарбоксилированию с образованием аммиака, альдегида и СО2. Нингидрин восстанавливается и связывается со второй молекулой нингидрина посредством молекулы аммиака, образуя продукты конденсации, окрашенные в синий цвет (комплекс Руэмана). Нингидриновая реакция используется для количественного определения a-аминокислот в аминокислотных анализаторах.
Ксантопротеиновая реакция открывает наличие в белках циклических аминокислот - триптофана, фенилаланина, тирозина, содержащих в своем составе бензольное ядро. Большинство белков при нагревании с концентрированной азотной кислотой дает желтое окрашивание, переходящее в оранжевое при подщелачивании. Реакция обусловлена нитрованием бензольного кольца этих аминокислот с образованием нитросоединений желтого цвета.
Реакция Миллона открывает в белке циклическую аминокислоту тирозин. При добавлении к раствору белка реактива Миллона, состоящего из смеси азотнокислых и азотистокислых солей закиси и окиси ртути, растворенных в концентрированной азотной кислоте, образуется белый осадок (действие соли тяжелого металла), окрашивающийся при нагревании в красный цвет. Реактив Миллона дает окрашивание почти со всеми фенолами, и в случае белков реакция обусловлена присутствием в них фенольной группы тирозина. Белки, не содержащие тирозина, этой реакции не дают. Следует избегать прибавления избытка реактива Миллона, поскольку он содержит азотную кислоту, которая при взаимодействии с белком может дать желтое окрашивание (ксантопротеиновую реакцию), маскирующее реакцию Миллона.
Реакция Фоля указывает на присутствие в белке аминокислот цистина и цистеина, содержащих слабосвязанную серу. Метионин, хотя и является содержащей серу аминокислотой, этой реакции не дает, поскольку сера в нем связана прочно. Реакция состоит в том, что при кипячении белка с реактивом Фоля (плюмбит натрия в избытке NaОН) под действием щелочи от цистеина или цистина легко отщепляется сера в виде сернистого натрия, который с плюмбитом дает черный или бурый осадок сернистого свинца.
Реактивы, исследуемый материал
1. Раствор едкого натра, 100 г/л. 2. Раствор сернокислой меди, 10 г/л. 3. Раствор нингидрина, 5 г/л. 4. Азотная кислота концентрированная. 5. Реактив Миллона. 6. Раствор фенола, 1 г/л. 7. Реактив Фоля. 8. Раствор яичного белка для цветных реакций.
Ход работы
Реагенты | Опыт | Контроль |
Биуретовая реакция | ||
Раствор белка | 5 кап | - |
Вода | - | 5 кап |
NaOH, 10% | 5 кап | 5 кап |
CuSO4, 1% | 2 кап | 2 кап |
Окрашивание | ||
Нингидриновая реакция | ||
Раствор белка | 5 кап | - |
Вода | - | 5 кап |
Раствор нингидрина | 5 кап | 5 кап |
Кипятить 1-2 мин | ||
Окрашивание | ||
Ксантопротеиновая реакция | ||
Раствор белка | 5 кап | - |
Вода | - | 5 кап |
HNO3, конц. | 5 кап | 5 кап |
Кипятить до появления окраски раствора белка | ||
Окрашивание | ||
Реакция Милона | ||
Раствор белка | 5 кап | - |
Вода | - | 5 кап |
Реактив Миллона | 3 кап | 3 кап |
Нагреть до окрашивания осадка белка | ||
Окрашивание | ||
Реакция Фоля | ||
Раствор белка | 5 кап | - |
Вода | - | 5 кап |
NaOH, 30% | 5 кап | 5 кап |
(CH3COO)2Pb, 5% | 1 кап | 1 кап |
Кипятить до появления черного окрашивания |
– Конец работы –
Эта тема принадлежит разделу:
ОСНОВЫ БИОТЕХНОЛОГИИ... Витебск Министерство образования Республики Беларусь...
Если Вам нужно дополнительный материал на эту тему, или Вы не нашли то, что искали, рекомендуем воспользоваться поиском по нашей базе работ: Практикум
Если этот материал оказался полезным ля Вас, Вы можете сохранить его на свою страничку в социальных сетях:
Твитнуть |
Новости и инфо для студентов