Лекция 9. флуоресцентная спектроскопия Интенсивность поглощения света единицей объема вещества связана с экспериментально измеренными величинами известной формулой Ламберта-Бэра

 

Лекция 9. флуоресцентная спектроскопия

Люминисценцией является излучение фотонов электронно-возбужденными состояниями молекул. Она состоит из 2-х видов: флуоресценции и фосфоресценции. Отдельно находится так называемая биолюминесценция или хемолюминесценция, которая происходит не за счет поглощения света, а обеспечивается химической реакцией. Явление биолюминесценции широко распространено в различных биологических организмах; например, в медузах и светлячках. Основным компонентом, осуществляющим свечение этих организмов, является белок – люцефераза со связанным с ним ко-фактором – целентеразином. В биомакромолекулах люминесценция обеспечивается либо собственными хромофорами либо присоединенными к ним ковалентно или сорбированными флуоресцентными метками. В белках существуют три вида аминокислотных остатков, которые способны излучать свет после его поглощения. К ним относятся триптофан, тирозин и фенилаланин. Параметры люминесценции позволяют установить локализацию этих ароматических остатков в белках и охарактеризовать свойства их окружения.

В настоящее время метод собственной люминесценции широко используется в биофизике и биохимии благодаря относительной простоте измерения и использованию низких концентраций люминесцирующих объектов. Люминесценция происходит в результате электронного перехода возбужденной поглощением фотона света молекулы хромофора в основное невозбужденное состояние. Это явление можно пояснить следующей условной схемой уровней энергии, называемой схемой Яблонского.

Интерком-бинационная конверсия

Поглощение

S0

S1

Фосфоресценция

T2

S2

Интенсивность поглощения света единицей объема вещества связана с экспериментально измеренными величинами известной формулой Ламберта-Бэра

I_погл. = I₀ exp(-e × l × c),

Где I0 – начальная интенсивность падающего света, e – молекулярный коэффициент поглощения при данной частоте n, l – длина пути света в поглощающем веществе, с – концентрация молекул поглощающего вещества.

Поглощение кванта света, в зависимости от его энергии, переводит молекулу из основного состояния S₀ на один из колебательных уровней возбужденных состояний S₁, S₂ и т.д. В концентрированной среде энергия возбуждения состояния S₂ или любого другого высокого состояния (выше S₁), быстро диссипирует благодаря неупругим столкновениям и молекула безызлучательно достигает нулевого колебательного уровня состояния S₁. Безызлучательные переходы между электронными состояниями одной и той же мультиплетности называются внутренней конверсией. При этом энергия возбуждения переносится во внешнюю среду. Безызлучательная дезактивация S₁ Þ S₀ происходит по такому же механизму. Излучательные переходы в молекуле между синглетными уровнями приводят к появлению флуоресценции. Сравнение процессов флуоресценции S₀ ¬ S₁ и поглощения S₀ ® S₁ показывает, что наиболее длинноволновая линия поглощения совпадает по энергии с наиболее коротковолновой линией излучения. Эта линия называется О – О линией.

 

Основные принципы флуоресценции

 

1. Благодаря внутренней конверсии поглощения спектра флуоресценции не зависит от длины волны возбуждения.
2. Спектр флуоресценции сдвинут в длинноволновую сторону по отношению к спектру поглощения.
3. Число квантов, излучаемых в единицу времени, пропорционально числу квантов, поглощаемых в единицу времени, и квантовому выходу флуоресценции:

 

N_f = I₀(1 – 10^-D)q_f

 

где I₀ – интенсивность падающего света; D – оптическая плотность раствора; q_f – квантовый выход флуоресценции, который определяется как отношение числа квантов, излучаемых из возбужденного состояния, к числу квантов, поглощаемых при переходах из основного в это возбужденное состояние в единицу времени.

1. Спектр возбуждения флуоресценции идентичен спектру поглощения.

 

Время жизни люминесценции

 

Время жизни t возбужденного состояния определяется как время, требуемое для уменьшения начального числа возбужденных состояний в «е» раз. Собственное время жизни, t⁰, возбужденного состояния – это среднее время жизни этого состояния в отсутствие безызлучательных процессов дезактивации.

где q_f – квантовый выход, – собственное время жизни, а t_f – измеряемое время жизни. При непрерывном облучении раствора в течении периода времени, более длительного, чем время жизни флуоресценции, система достигает стационарного состояния, когда скорость образования синглетных возбужденных молекул S₁, будет равна скорости их исчезновения в ходе различных процессов дезактивации.

 

Параметры флуоресценции и их применение к исследованию биологических макромолекул

  Спектры флуоресценции.  

Поляризация флуоресценции.

 

Определения поляризации и анизотропии

    Когда регистрирующий поляризатор ориентирован параллельно (||) направлению поляризованного возбуждения, то… Поляризация и анизотропия могут быть взаимозаменены при использовании… (5.3), (5.4)

Влияние вращательной диффузии на анизотропию флуоресценции. Уравнение Перрена

Главная причина деполяризации флуоресценции – вращательная диффузия флуорофоров. Этот вид деполяризации описывается уравнением Перрена которое может…   (5.40)

Применения измерений анизотропии в биохимии

Измерение анизотропии флуоресценции широко используется в биохими­ческих исследованиях. Это происходит потому, что любые факторы, которые влияют на размер, форму и сегментальную гибкость макромолекулы, будут влиять на наблюдаемую анизотропию. Вышеперечисленные свойства макромолекул могут изменяться под воздействием рН, температуры, вязкости, денатурирующих агентов и из-за реакций ассоциации. В следующих разделах будет приведен ряд результатов, которые иллюстрируют использование и ин­терпретацию измерений анизотропии.

 

РИС. 5.10. Схема отбора плоскостных и внеплоскостных вращений путем выбора r₀ или длины волны возбуждения на примере перилена.

 

Оценка микровязкости клеточных мембран

  РИС. 5.11. Градуировочная кривая для оценки микровязкости мембран [12].

Вращательная диффузия белков

Для глобулярных белков время вращательной корреляции приближенно связано с молекулярной массой М белка соотношением …   где ν — удельный объем белка; h - величина гидратации (обычно 0,2 г Н20 на 1г белка).

Реакции ассоциации

(5.53)   Где rсвоб и rсвяз— анизотропии свободного и связанного флуорофоров со­ответственно: fСВОб и fсвяз — доли от общей…

Денатурация DNA

В качестве заключительного примера использования метода поляриза­ции приведен температурный график Перрена для комплекса профлавин — DNA [24] (рис. 5.16). Профлавин встраивается между парами оснований двойной спирали DNA. При такой локализации его вращательное движение строго ограничено. Наблюдаемое значение поляризации ~0,36 при Р₀ = 0,474 показывает, что профлавин практически неподвижен, когда он связан с DNA. Наиболее отличительной чертой этих данных является рез­кое увеличение 1/Р — 1/3, наблюдаемое при 60 °С, которое вызвано терми­ческой денатурацией DNA, сопровождающейся высвобождением связанного профлавина.