Роль м и к р о о р г а н и з м о в - к о н т а м и н а н т о в лекарствен­ных средств впатологи и человека

Основными отрицательными последствиями для больных при ис­пользовании препаратов, содержащих микроорганизмы, могут быть сни­жение или отсутствие терапевтического действия препарата, возникнове­ние заболеваний, неблагоприятных побочных реакций, а также передача и распространение лекарственно устойчивых бактерий. Заболевания мо­гут иметь инфекционную или неинфекционную природу. Заболевания неинфекционной природы могут быть обусловлены продуктами биораз- рушения БАВ и микробными токсинами. Последние могут вызывать ток- сикоинфекции и интоксикации (токсикозы). Токсикоинфекции - это об­ширная группа острых кишечных заболеваний, которые развиваются после приема per os (через рот) лекарственных препаратов, обильно контамини- рованных патогенными и условно-патогенными бактериями, содержащи­ми эндотоксины. Токсикоинфекции являются полиэтиологическими, их могут вызывать различные микроорганизмы: энтеротоксигенные вари­анты кишечной палочки, протей, энтерококки, Bacillus cereus, Staphylo­coccus aureus, Clostridium perfringens, реже - бактерии родов Klebsiella, Enterobacter, Pseudomonas. Токсикозы обусловлены попаданием экзоток­синов некоторых бактерий (S. aureus, С. botulinum), грибов, а также ток­сичных продуктов микробной деградации БАВ.

Инфекционные заболевания, возникающие в результате использо­вания контаминированных ЛС, могут иметь разную локализацию и кли­ническую форму:

^1) гнойно-септические инфекции (местные или генерализованные);

2) грибковые поражения кожи, слизистых, глаз и других органов;

3) заболевания вирусной природы (например, в результате применения

контаминированных препаратов крови);

4) кишечные инфекции (эшерихиозы, сальмонеллезы).

Возникновение, развитие и исход заболевания зависят от уровня мик­робной контаминации, биологических особенностей микроба-загрязните­ля (его вирулентности), от резистентности пациента и способа введения препарата. Важную роль в развитии заболевания имеет способ применения контаминированных препаратов. Наибольшую опасность представляет их введение в кровоток, глаза, в полости тела, в норме свободные от микроор­ганизмов. При местном применении препаратов вероятность развития ин­фекционного процесса резко возрастает при обширных повреждениях тка­ней в результате травмы, ожога, хирургического вмешательства. Например, Staphylococcus aureus при попадании с ЛС на поврежденную кожу и слизи­стые может вызывать гнойно-воспалительные процессы; при ингаляцион­ном введении - стафилококковую пневмонию; при пероральном - токсико- инфекцию или интоксикацию; при попадании в кровяное русло - генерали­зованную инфекцию (сепсис).

Микробиологические требования к качеству ГЛС

Определение микроорганизмов в лекарственных препаратах впер­вые стали проводить по указанию Всемирной организации здравоохране­ния. В бывшем СССР такая инструкция впервые появилась в 1971 году. По результатам анализов, выполненных в период с 1973 по 1975 гг. из 5000 препаратов 65 % не удовлетворяло предъявляемым требованиям, а 12 % препаратов содержали патогенные микроорганизмы. В 1979 году только 30 % проверенных препаратов не соответствовали требованиям и лишь 0,9 % содержали патогенные микроорганизмы. Современные требова­ния к микробной чистоте лекарственных средств представлены в табл. 27.

16.2. Микроорганизмы, контролируемые в НЛС

Микробиологическая чистота лекарственных препаратов (изменение № 3 к статье ГФ XI, 25.06.2003)

Выбор микроорганизмов, нормирование которых предусмотрено Фар­макопеей (табл. 27), определяется их опасностью для здоровья населения и способностью служить критерием оценки гигиенического состояния про­изводства, предусмотренного GMP. Этот выбор достаточно ограничен по эко­номическим соображениям, но в настоящее время признан достаточным для получения результатов, адекватно отражающих качество продукции по мик­робиологическим показателям, и со временем может бьггь расширен. Напри­мер, существует мнение, что в воде, используемой при изготовлении несте­рильных офтальмологических препаратов, должны отсутствовать псевдомо­нады, не только P.aeruginosa, но и P. (Burkholderia) cepacia. Однако существу­ющие методы анализа (посев на цетрамидный агар) исключают выделение и идентификацию последнего вида. В фармацевтической микробиологии об­суждается вопрос о некультивируемых видах микроорганизмов, определе­ние которых в настоящее время не предусмотрено. Известно значение бакте­риальной биопленки, вызывающей загрязнение системы водоснабжения и служащей резервуаром патогенных бактерий, попадающих в питьевую воду, системы гемодиализа, госпитальные системы водоснабжения и др. В отно­шении экологии водоснабжения фармацевтического производства этот воп­рос пока не рассматривается при существующей необходимости изменить критерии микробиологической оценки качества воды.

Таблица 27 Категория Препараты Рекомендуемые требования Лекарственные препараты, к которым предъявляется требование «стерильность» Препараты должны быть стериль­ными • Для применения местно, наружно, интравагиналь- но • Для введения в полости уха, носа • Для введения в дыха­тельные пути • Трансдермальные пла­стыри За исключением тех лекар­ственных препаратов, ко­торые должны быть сте­рильными • Общее число аэробных бактерий и грибов суммарно - не более 10" в 1 г или в 1 мл, или на 1 пла­стырь (включая клейкую сторону и основу) • Отсутствие энтеробактерий и некоторых других грамотрица­тельных бактерий на 1 пластырь (включая клейкую сторону и ос­нову) • Не более 10' энтеробактерий и некоторых других грамотрица­тельных бактерий в 1 г или 1 мл для других препаратов • Отсутствие Pseudomonas aerugi­nosa в 1 г или в i мл, или на 1 пластырь (включая клейкую сторону и основу) Отсутствие Staphylococcus aureus в 1 г или в 1 мл, или на 1 пластырь (включая клейкую сторону и основу)

 

Окончание табл. 27 Категория Препараты Рекомендуемые требования ЗА ® Для приема внутрь или введения ректально • Общее число аэробных бактерий - не более 10J в 1 г или в 1 мл • Общее число грибов - не более 10" в 1 г или в 1 мл • Отсутствие Escherichia coli в 1 г или в 1 мл ЗБ • Для приема внутрь - из сырья природного проис­хождения (животного, растительного или мине­рального), уровень мик­робной загрязненности которого невозможно снизить в процессе пред­варительной обработки. Исключением являются ле­карственные раститель­ные средства, включенные в Категорию 4 • Общее число аэробных бактерий не более!О4 в 1 г или в 1 мл • Общее число грибов - не более 10" в 1 г или в 1 мл • Энтеробактерий и некоторых других грамотрицательных бак­терий - не более Ю2 в 1 г или в 1 мл • Отсутствие Escherichia coli в 1 г или в 1 мл • Отсутствие Salmonella в 10 г или в 10 мл • Отсутствие Staphylococcus aureus в 1 г или в 1 мл Лекарственные средства, состоящие из одного вида сырья (фасо­ванная продукция) или нескольких (сборы), а также раститель­ное сырье «ангро» 4А • Лекарственные расти­тельные препараты или лекарственное расти­тельное сырье «ангро», применяемые в виде настоев и отваров, при­готовленные с исполь­зованием кипящей во­ды • Общее число аэробных бактерий не более 107 в 1 г или в 1 мл • Общее число грибов - не более 105 в 1 г или в 1 MJI • Escherichia coli - не более 10" в 1 г или в 1 мл 4Б • Лекарственные расти­тельные препараты или лекарственное расти­тельное сырье «ангро», приготовленные без использования кипя­щей воды • Общее число аэробных бакте­рий - не более 105 в 1 г или в 1 мл • Общее число грибов - не более 104 в 1 г или в 1 мл • Энтеробактерий и других грамот­рицательных бактерий - не более 103 в 1 г или в 1 мл • Отсутствие Escherichia coli - в 1 г или в 1 мл • Отсутствие Salmonella в 10 г или в 10 мл

 

В последующих разделах этой главы будут рассмотрены морфоло- го-биохимические особенности микроорганизмов (в порядке их перечис­ления в Определителе бактерий Берджи), содержание которых регламен­тировано для продукции фармацевтической промышленности, в связи с существующими методами их выделения и идентификации, а также их значение в паталогии человека.

Грамотрицательные аэробные (м и к р о а э р о ф и л ь н ы е палочки)

Род Pseudomonas. Прямые или слегка изогнутые, но не спираль­ные палочки 0,5-1,0 х 1,5-5,0 мкм. Подвижны (полярные жгутики). Аэро­бы. Способны к анаэробному дыханию с использованием нитрата в каче­стве акцептора электронов. Некоторые виды - факультативные автотро- фы. Род включает более 70 видов. Они широко распространены в приро­де. Некоторые виды патогенны для человека, животных и растений могут загрязнять фармацевтические препараты, размножаться в растворах ан­тисептиков. На основании гомологии ДНК некоторые виды, относивши­еся к роду Pseudomonas, выделены в род Burkholderia (В.mallei, B.pseudomallei, B.cepacia), род Brevundimonas (B.diminuta) и др.)

Pseudomonas aeruginosa - основной возбудитель гнойно-воспали­тельных процессов, особенно в условиях стационаров. Вызывает общие и местные нагноительные процессы: отиты, пиелиты, циститы, кератиты, менингоэнцефалиты, инфицирует поверхности ран и ожогов. Устойчива к действию антибиотиков. Описаны вспышки токсикоинфекций вслед­ствие употребления пищевых продуктов (мясо, рыба), контаминирован­ных этим микроорганизмом. Образует биопленку на оборудовании систе­мы водоснабжения. Способна разрушать многие химические вещества, в том числе биоциды.

Растет на простых питательных средах в широком диапазоне темпе­ратур (4-42 °С), оптимальная температура 37 °С. Строгий аэроб. На жид­ких средах (пептонная вода, МПБ) образует характерную серовато-сереб- ристую пленку, по мере старения культуры возникает помутнение. На плот­ных средах (МПА, кровяной агар, среды Эндо, Левина, Плоскирова) вид колоний зависит от состава среды. На специальных средах образует сине- вато-зеленоватые пигменты (пиоцианин, флюоресцеин и др.), выделяю­щиеся в питательную среду. Имеются также непигментированные штам­мы. Образует токсины и другие факторы вирулентности.

Pseudomonas (Burkholderia) cepacia - повсеместно распространен­ный микроорганизм, часто контаминирует растворы для местной анесте­зии, лекарственные препараты, косметические средства. Эпидемиология и этология имеет много общего с таковыми P. aeruqinosa. Подвижная по­лиморфная палочка, по Граму окрашивается биполярно. Температурный оптимум 30 °С. Выделение требует специальных селективных сред. На кровяном огаре с полимиксином образует мутные маслянистые беловато- серые колонии. Возможно образование желтого или зеленоватого нефлю- оресцирующего феназинового пигмента, растворимого в хлороформе.

Семейство Enterobacteriaceae

Семейство Enterobacteriaceae включает более 115 видов, принадле­жащих к 30 родам-.. Это прямые палочки 0,3-1,8 мкм. Подвижные (перит- рихи) или неподвижные. Присутствуют повсеместно: в почве, воде, на растениях, у животных. Некоторые из них патогенны и вызывают заболе­вания желудочно- кишечных, дыхательных и мочевыводящих путей, ме­нингиты и раневые инфекции. Около 50 % внутрибольничных инфекций вызываются видами этого семейства. Наиболее часто встречаются Escherichia coli, Serratia marcescens и виды родов Klebsiella, Enterobacter, Proteus, Providencia, Shigella.

Pod Escherichia. Прямые палочки 1,1-1,5 г 2,0-6,0 мкм одиночные или в парах. Для многих штаммов характерны капсулы или микрокапсулы.

Виды рода Escherichia различаются по подвижности и биохимичес­кой активности.

Escherichia coli и колиформные бактерии

Е. coli - постоянный обитатель и важный представитель нормаль­ной микробиоты кишечника человека и теплокровных животных. Боль­шая часть штаммов E.coli не считается патогенной, однако вид включает условно-патогенные и патогенные штаммы. Последние различаются по факторам вирулентности, которыми они обладают (энтеротоксигенные, энтеропатогенные, энтерогеморратические и др.)

В 1892 г. Shardinger предложил использовать Е. coli как санитарно- показательный микроорганизм.

По фенотипическим признакам Е. coli имеет много общего с други­ми родами сем. Enterobacteriaceae (Klebsiella, Citrobacter и Enterobacter), поэтому было предложено эту группу бактерий называть колиформными. Этот термин не является таксономическим, но служит рабочим определе­нием группы грамотрицательных факультативно анаэробных палочковид­ных бактерий, которые ферментируют лактозу с образованием кислоты и газа за 48 ч культивирования при 35 °С.

Некоторые колиформные бактерии способны обитать во внешней среде, поэтому группу санитарно-показательных колиформных бактерий было предложено называть фекальными колиформами. Фекальные коли- формы рассматривают как представителей общих колиформ, которые ра­стут и ферментируют лактозу при повышенной температуре инкубации (термотолерантные колиформы). Эта группа включает в основном Е. coli; однако виды Klebsiella также способны ферментировать лактозу при тем­пературе 44-45 °С. Для дифференциации E.coli и Klebsiella spp. служат специальные методы.

Показатель общего числа колиформ используют в качестве индикато­ра санитарного состояния воды или как основной индикатор санитарного состояния производства в пищевой и фармацевтической промышленности; показатель термотолерантных колиформ - для характеристики санитарно­го состояния воды; E.coli - показатель свежего фекального загрязнения.

Род Citrobacter. Прямые палочки 1 х 2-6 мкм, одиночные и в парах, обычно подвижные. Факультативные анаэробы. Обнаружены в почве, воде и пищевых продуктах, входят в состав нормальной микробиоты кишеч­ника. Штаммы определенных серогрупп вызывают гастроэнтериты и пи­щевые токсикоинфекции, оппортунистические и госпитальные инфекции.

Род Enterobacter. Прямые палочки 0,6-1, х 1,2-3,0 мкм. Подвиж­ные. Оптимальный диапазон температуры 30-37 °С. Вызывает внутри- больничные и опортунистические инфекции.

Род Klebsiella. Прямые палочки 0,3-1,0 х 0,6-6,0 мкм, одиночные, в парах или коротких цепочках. Неподвижные. Для К. pneumoniae и К. oxytoca характерна массивная полисахаридная капсула, определяющая об­разование крупных мукоидных колоний. Известно более 80 капсульных антигенов, используемых для серотипирования клебсиелл. Широко рас­пространены, встречаются в почве, воде, на фруктах и овощах.

Температурные границы роста 12-43 °С, оптимум рН 7,2.

Вызывают оппортунистические и внутрибольничные инфекции.

K.pneumoniae образует экзотоксин. Является возбудителем бронхо­легочных заболеваний, иногда - менингита; у детей может вызывать сеп­тицемию, циститы и другие заболевания.

К. ozaenae - возбудитель хронического заболевания респираторно­го тракта.

К. rhinoscleromatis вызывает хронический гранулематозный или ат- рофический процессы в слизистой оболочке верхних дыхательных путей.

Род Мorganella. Прямые палочки 0,6-0,7 х 1,0-1,7 мкм. Подвижны (перитрих). Роение отсутствует. Выделяются из фекалий млекопитающих. Вызывают оппортунистические инфекции.

Род Proteus. Прямые палочки 0,4-0,8 х 1-3 мкм. Подвижные (пе­ритрих). У большинства штаммов имеет место роение с периодическими циклами миграции, приводящее к образованию концентрических зон или распространению в виде однородной пленки по влажной поверхности среды. Встречаются в кишечнике позвоночных, в почве, навозе, загряз­ненных водах. Вызывают инфекции мочевых путей, вторичные пораже­ния, часто при ожогах.

Род Providencia. Прямые палочки 0,6-0,8 х 1,5-2,5 мкм, подвиж­ные (перитрих), роение отсутствует. Вызывают желудочно-кишечные рас­стройства, инфекции мочевых путей, вторичные поражения при ранах и ожогах

Род Salmonella. Прямые палочки 0,7-1,5 х 2-5 мкм. Подвижны (пе­ритрих). Встречаются у человека и животных, в пищевых продуктах и в природной среде. Вызывают брюшной тиф, кишечные инфекции, ток­сикоинфекции, септицемию. Образуют эндоксины.

Температурный оптимум 35-37 °С. Диапазон рН 4,1-9,0. Оптимум 7,2-7,4. Рост подавляют или ограничивают высокие концентрации соли и сахара.

Биохимические свойства могут различаться даже в пределах одного серовара.

Род Serratia. Прямые палочки 0,5-0,8 х 0,9-2 мкм. Обычно под­вижные (перитрих). Некоторые виды образуют розово-красный водоне- растворимый пигмент продигнозин. Распространены повсеместно (вода, почва, растения). S.marcescens вызывает оппортунистические инфекции - септицемию, инфекции мочевых путей, мастит у коров.

Род Shigella. Прямые палочки, неподвижны. По морфологическим признакам не отличаются от других представителей сем. Enterobacteriaceae. Вызывают дизентерию и другие шигеллезы - заболевания, передающие­ся с водой и пищей, распространенные среди приматов, включая челове­ка. По биохимическим признакам шигеллы трудно дифференцировать от Е. coli. На основании гомологиии ДНК их можно отнести к одному виду. S. dysenteriae продуцирует экзотоксин, обладающий выраженным тропиз­мом к нервной системе и слизистой оболочке кишечника. Другие виды шигелл образуют эндотоксины. Вызывают дизентерию.

Род Yersinia. Прямые палочки 0,5-0,8 х 1-3 мкм, приобретающие иногда сферическую форму. Подвижные (перитрих) или неподвижные (Y. pestis). Подвижность и метаболизм зависит от температуры. Темпера­турные пределы роста - 0-39 °С, для Y.pestis - до 45 °С; оптимум роста 28-30 °С; оптимум рН 6,9-7,2. Широко распространены в природе, пара­зиты животных и человека, йерсиниозы - опасные инфекционные забо­левания.

Грамположительные кокки

У большинства организмов этой группы клетки сферические, иног­да овальные, всегда четко грамположительные, неподвижные.

Род Enterococcus. Род Enterococcus представлен видами, ранее относи­мыми к роду Streptococcus (S.f aecalis, S. faecium, S. avium, S. gallinarum и др.)

Клетки сферические или овальные 0,6-2,0 х 0,6-2,5 мкм в парах или (в жидкой среде) коротких цепочках. Факультативные анаэробы. Сбра­живают разнообразные углеводы с образованием лактата. Нуждаются в сложных питательных средах. Каталазоотрицательные. Растут в преде­лах температуры 10-45 °С, оптимальная температура 37 °С. Растут при рН 9,6, концентрации NaCl 6,5 %, желчи - 40 %. Как правило, относятся к серологической группе Lancefield D. Широко распространены в приро­де, обитают в кишечнике позвоночных, иногда вызывают пиогенные ин­фекции.

Все виды и варианты энтерококков признаны санитарно-показатель- ными микроорганизмами и отвечают предъявляемым к ним требованиям. Это постоянные обитатели кишечника несмотря на то, что их количе­ство меньше, чем E.coli; они не способны размножаться во внешней среде (точнее могут размножаться при содержании органических веществ 375 мкг/л и температуре равной 20 °С и выше). Не проявляют выражен­ной изменчивости во внешней среде, что облегчает их распознавание и не имеют аналогов во внешней среде. Отмирают во внешней среде значи­тельно раньше, чем E.coli, поэтому всегда свидетельствуют о свежем фе­кальном загрязнении. Самым главным достоинством является их устой­чивость к неблагоприятным внешним воздействиям. Они устойчивы к нагреванию до 65 °С в течение 30 мин, что делает их показателем каче­ства режима пастеризации. Энтерококки устойчивы к высоким концент­рациям NaCl (6,5-17 %), что позволяет использовать их при анализе мор­ской воды. Энтерококки устойчивы в диапазоне рН 3-12, что можно ис­пользовать при анализе стоков кислого и щелочного характера.

В настоящее время количественная энтерококкометрия принята меж­дународным стандартом по воде как дополнительный показатель фекаль­ного загрязнения, а при выявлении атипичных E.coli - главным методом выявления фекального загрязнения.

Трудности в индикации энтерококков состоят в необходимости ис­пользовать среды сложного состава и в том, что для их выявления требу­ется больше времени, чем для колиформных бактерий.

Род Staphylococcus. Повсеместно распространенные микроорганиз­мы, чувствительны к нагреванию и действию биоцидов. Поэтому их при­сутствие в помещении свидетельствует о плохом санитарном состоянии.

Стафилококки образуют клетки диаметром 0,5-1,5 мкм, располага­ющиеся в мазках одиночно, парами или гроздьями. Факультативные ана­эробы, каталазоположительны, оксидазоотрицательны, чувствительны к действию лизостафина, но не лизоцима, растут на средах с 5-10 % NaCl. На плотных средах образуют мутные, круглые колонии желтого, кремо­вого или оранжевого цвета. На жидких средах вызывают помутнение и рыхлый осадок. Разжижают желатин, образуют H,S. Восстанавливают нитраты до нитритов.

Staphylococcus aureus вызывает разнообразные гнойно-септические инфекции и пищевые отравления. S.aureus коагулирует плазму, что явля­ется критерием для идентификации этого вида.

Дрожжи и плесневые грибы

Грибы - многочисленная группа эукариотических микроорганизмов, различающихся по своей морфологии и физиологии. В основном сапрот- рофы, некоторые виды вызывают заболевания человека и животных (ми­козы). Поселяясь на разнообразных продуктах - пищевом и лекарствен­ном сырье, пищевых продуктах, кормах, лекарственных препаратах они вызывают их порчу и могут выделять в среду опасные микотоксины. Кон­такт с материалом, инфицированном грибами, может привести к разви­тию заболеваний, в том числе аллергических. Подробно материал изло­жен в главе 2.

16.3. Принципы микробиологического контроля НЛС

Контроль осуществляют на всех предприятиях, выпускающих ле­карственные препараты, с целью оценки качества готовой продукции по показателю «микробиологическая чистота» и соответствия его установ­ленным требованиям. Исследования проводят в микробиологических ла­бораториях, аккредитованных в соответствии с ОСТ 42-503-95.

Схема анализа должна отвечать следующим требованиям:

■ предельная краткость по времени и числу использованных тестов;

■ использование методов, обеспечивающих точность количественного

подсчета и достоверную идентификацию нормируемых микроорга­низмов.

Микробиологический контроль лекарственных средств отличается от традиционного контроля пищевых продуктов или патологического материала. Отличие состоит в использовании сред обогащения при ана­лизе лекарственных препаратов на возможное присутствие условно-пато­генных микроорганизмов, которые могут находиться в препарате в не­большом количестве.

В таком случае прямой посев контаминированного препарата на плотные дифференциально-диагностические среды, как это делают в санитарной микробиологии при анализе продуктов, в большинстве случа­ев не приводит к обнаружению искомой группы бактерий за исключени­ем случаев высокой контаминации.

В средах обогащения (селективных) существуют условия для пре­имущественного роста и размножения определенных условно-патоген­ных микроорганизмов, иногда за счет добавления ингибиторов роста других бактерий. В благоприятных условиях начинает преобладать ис­комый вид (группа) микроорганизмов, хотя посторонние микроорганиз­мы могут присутствовать в незначительном количестве. Далее микро­организмы идентифицируют на основании их морфологических и био­химических свойств. Еще одной особенностью контроля лекарственных препаратов является определение их антимикробной активности и уст­ранение ее перед проведением анализа. Без этого возможно выявление только устойчивых к данному препарату микроорганизмов, что искажа­ет реально существующую ситуацию и не позволяет получать достовер­ные результаты.

Факторы, обеспечивающие достоверность результатов анализа

Принципиальное значение имеет масса образца, т. е. количество препарата, взятого для анализа. Чем больше масса образца, тем выше ста­тистическая достоверность вывода об отсутствии патогенных микроор­ганизмов. Например, при массе образца для анализа 1-5 г предваритель­но контаминированного препарата условно-патогенные микроорганизмы удавалось выявить только при нескольких повторных анализах. При уве­личении массы образца до 10 г положительный ответ удавалось получить с первого раза.

Вторым фактором, обеспечивающим достоверность ответа, являет­ся качество питательных сред. Питательные среды должны быть изго­товлены в строгом соответствии с указаниями ГФ, из компонентов, отве­чающих по качеству требованиям ГОСТ. Они должны храниться в усло­виях, исключающих их высыхание или увлажнение, и проверены на рос­товые свойства и стерильность. Под ростовыми свойствами понимают способность питательной среды обеспечивать эффективный рост специ­альных штаммов тест-микроорганизмов. На ростовые свойства, проверя­ют каждую новую партию среды. Стерильность контролируют путем тер- мостатирования образца приготовленной среды после ее стерилизации (отбирают 5 % от всего количества).

Третий фактор, влияющий на достоверность ответа, это отсутствие антимикробной активности препарата. Чтобы исключить попадание в объекты анализа посторонних микроорганизмов, анализ проводят в стро­го асептичных условиях в специальном помещении, полностью изоли­рованном от процесса производства.

Схема анализа Н Л С, не обладающих антимикроб­ным действием

В соответствии с требованиями НТД в НЛС определяют общее чис­ло бактерий и грибов, а также возможное присутствие условно-патоген­ных микроорганизмов. Для этого используют 15 различных питательных сред, каждая из которых имеет определенный номер (табл. 28). Схема и методы анализа являются одинаковыми для всех видов НЛС, независи­мо от их лекарственной формы (твердой, мягкой, жидкой). Схема анализа включает следующие этапы:

• обогащение культур;

• первичная дифференциация (разделение по группам) на диффе­ренциально-диагностических средах;

® выделение «чистых» культур микроорганизмов;

• изучение морфологических и биохимических свойств выделенных культур;

• заключение о присутствии (отсутствии) конкретных культур на ос­новании совокупности признаков.

Общий принцип микробиологического контроля состоит в анализе так называемой выборочной пробы и в перенесении результатов контро­ля на всю серию или партию препарата.

Выборочная проба - это образцы, отбираемые из всей массы иссле­дуемого объекта при соблюдении принципа случайности выборки. Сери­ей (или партией) препарата называют определенное количество продук­та, изготавливаемого в условиях, которые считаются постоянными. Ос­новным требованием к серии (партии) является ее однородность по пока­зателям качества. Для анализа ГЛС от каждой серии (не зависимо от объе­ма) отбирают среднюю пробу не менее 50 г (мл), состоящую из равных разовых проб, взятых как минимум из 10 разных упаковок. Всего для про­ведения одного анализа по схеме используют 30 г лекарственного сред­ства: 10 г (мл) - для определения общего количества бактерий и грибов - мезофильных аэробных и факультативных анаэробных микроорганизмов (МАФАМ), 10 г (мл) - для определения микроорганизмов семейства Enterobacteriaceae (или Escherichia coli и Salmonella spp.), 10 г (мл) - для определения Staphylococcus aureus и Pseudomonas aeruginosa. В том слу­чае, когда необходимо подтвердить результат, проводят повторное испы­тание по конкретному разделу схемы анализа, используя при этом обра­зец 10 г (мл) из оставшегося от средней пробы.

Таблица 28

Перечень и назначение питательных сред, использующихся в схеме анализа нестерильных лекарственных средств

Название и номер среды по схеме	Назначение, особенность компонентного состава	Учитываемый признак, его проявление
Среда № 1	Количественное определение бактерий (МАФАМ).	Макроморфология и подсчет числа колоний.
Среда № 2	Определение количества jpn6oB и дрожжей.	Макроморфология и подсчет числа колоний.
Накопительная среда № 3	Среда создает условия для преимущественного роста Г" палочек (при этом рост Г+ бактерий подавлен внесенным в среду малахитовым зеленым).	Изменение цвета среды, признаки бактериального роста.
Дифференциал ьно- диагностическа я Среда № 4 (Эндо)	Идентификация бактерий семейства Enterobacteriaceae, Escherichia coli.	Способность ферментировать лактозу, появление красных (бледно-розовых) колоний с металлическим блеском (без блеска); рост микроорганизмов сопровождается изменением цвета среды в ярко-малиновый.
Дифференциал ьно- диагностическа я среда № 5 (висмугсульфит агар)	Идентификация бактерий Enterobacteriaceae, Salmonella spp.	Черные (коричневые) колонии.
Накопительная среда № 8	Накопление Pseudomonas spp., Staphylococcus aureus.	Изменение цвета среды, признаки бактериального роста.
Дифференциал ьно- диагностическа я среда № 9 (с глицерином)	Выявление пигмента пиоцианина у Pseudomonas aeruginosa.	Изменение цвета среды с серовато-желтоватого на голубовато-зеленоватый (серо- зеленый); колонии серые, коричневые.
Дифференциал ьно- диагностическа я среда № 10 (с маннитом)	Выявление стафилококков.	Появление желтых, выпуклых колоний, окруженных желтыми зонами вследствие ферментации маннита.

 

Окончание табл. 28 Название и номер среды по схеме Назначение, особенность компонентного состава Учитываемый признак, его проявление Среда № 11 (лактозный бульон) Активирование роста энтеробактерий перед посевом в накопительную среду. Изменений внешнего вида среды отметить не удается из-за кратковременного культивирования (2-5 час). Среда № 12 (селенитовая) Накопление сальмонелл, что обусловлено присутствием селенита натрия. Изменение цвета среды - признаки бактериального роста. Среда № 13 Идентификация сальмонелл. В среду вносят глюкозу, лактозу и сахарозу. Посев петлей на скошенную часть и уколом в столбик. Изменение цвета среды: столбик окрашивается в желтый цвет в результате подкисления среды при ферментации глюкозы, скошенная часть имеет малиновую окраску. что свидетельствует об отсутствии ферментации лактозы и сахарозы, почернение в толще среды - выделение сероводорода. Среда № 14 (цитратный агар) Тест на утилизацию цитрата при испытании на Escherichia coli. Изменение цвета среды из зеленого в синий. Среда № 15 (бульон Хоттингера) Тест на индол при испытании на E.coli. Появление красного окрашивания в среде № 15 при добавлении реактива Ковача после культивирования.

 

При проведении испытания мембранным методом от каждой серии препарата отбирают среднюю пробу не менее 6 г (мл), если нет другого указания в частных Фармакопейных статьях. В зависимости от физичес­ких свойств лекарственной формы образец для анализа готовят в виде раствора, суспензии или эмульсии:

твердые лекарственные формы, которые плохо растворяются, пред­варительно измельчают с использованием оборудования, исключающего дополнительное загрязнение микроорганизмами и суспензируют в фос­фатном буферном растворе рН 7,0 (или соответствующей жидкой пита­тельной среде), соблюдая соотношение объем препарата: объем буферно­го раствора 1:20;

жидкие лекарственные формы, а также твердые формы, растворяю­щиеся в буфере, готовят в виде растворов 1:10;

мягкие лекарственные формы, нерастворимые в воде, предваритель­но эмульгируют в фосфатном буферном растворе рН 7,0 с добавлением эмульгатора (например, твина - 80).

При подготовке к анализу используют стеклянные бусы при меха­ническом встряхивании и нагревании пробы до температуры не более 45 °С. Приготовленные образцы используют для определения общего ко­личества МАФАМ и условно-патогенных микроорганизмов, нормируе­мых в препаратах разных категорий.

Количественное определение микроорганизмов

Испытание проводят двухслойным агаровым методом в чашках Петри. Приготовленный раствор, суспензию или эмульсию препарата вносят по 1 мл в каждую из 2-х пробирок с 4 мл расплавленной и ох­лажденной до 45-50 °С среды № 1. Быстро перемешивают содержи­мое пробирки и переносят в чашку, содержащую 15-20 мл застывшей питательной среды № 1. Быстрым покачиванием чашки равномерно распределяют верхний слой агара до его застывания. Чашки инкуби­руют 5 суток при 30-35 °С.

При таком способе посева микроорганизмы, содержащиеся в ана­лизируемом образце, распределяются в тонком слое на поверхности сре­ды, где имеются благоприятные условия для роста аэробных и факульта­тивно-анаэробных бактерий. Слой питательной среды, предварительно внесенной в чашку, обеспечивает диффузию питательных веществ для прорастания колоний микроорганизмов.

После инкубирования посевов через 2 сут и окончательно через 5 сут подсчитывают число бактериальных колоний на двух чашках, нахо­дят среднее значение и умножают на показатель разведения для определе­ния числа МАФАМ в 1 г (мл) образца.

Для получения достоверных результатов учитывают только те чашки, на которых выросло не более 300 колоний. Если при посеве разведения препарата 1:10 на чашках нет роста, делают заключение о том, что в 1 г препарата содержатся менее 10 бактерий. Если число колоний превышает 300, делают ряд последовательных разведений образца.

Для определения общего числа грибов препарат засевают на среду № 2, используя двухслойный агаровый метод, как описано выше.

Схема выделения и идентификации микроорганизмов из нестерильных лекарственных средств

Enterobacteriaceae Pseudomonas Staphylococcus aeruginosa aureus