Способы устранения антимикробного действия ле­карственных средств

Для HJIC рекомендованы такие методы:

увеличение рабочего разбавления препарата (за счет большого объе­ма фосфатного буферного раствора);

добавление специфических инактиваторов (например, пеницилли- назы для b-лактамных антибиотиков) или веществ, замещающих антиме­таболит (например, парааминобензойной кислоты для сульфаниламидов);

использование неспецифических инактиваторов-нейтрализаторов, особенно для препаратов с консервантами, например, 0,3-0,4 % раствор твина-80 и твина-20; 0,1-0,5 % раствор соевого лецитина, гистидина, ко­торые предварительно вносят в питательную среду.

Если все перечисленные методы неэффективны, а лекарственное вещество растворимо, то используют метод мембранной фильтрации.

16.4. Контроль стерильности лекарственных препаратов

Целью испытания на стерильность является подтверждение полно­го отсутствия жизнеспособных бактерий и грибов в объекте. В некото­рых случаях, например, в производстве вакцин проводят испытания на полное отсутствие вирусов в объекте.

Анализу подлежит каждая партия препарата. За партию (серию) при­нимают количество препарата, для которого вероятность нарушения или недостижения стерильности одинакова. Достоверность испытания на сте­рильность зависит от нескольких факторов: объема (массы) образца для анализа; состава и качества питательных сред; используемого метода исследования; соблюдения асептичных условий проведения анализа.

Объем образца.

В связи с тем, что метод испытания является разрушающим, отби­рать на анализ большое количество образцов невыгодно, вместе с тем есть риск получить неадекватный ответ, если проводить испытание на малом числе образцов из серий большого объема. Размер выборочной пробы устанавливают в зависимости от вида стерилизации и числа единиц в се­рии. Если лекарственное средство стерилизуют паром под давлением 0,11±0,02 МПа и температуре 121 °С, то образец состоит из 10 единиц, независимо от числа образцов в серии. При других видах стерилизации минимальное количество образцов определяют по формуле:

п = OAsfN,

где: и - число единиц для анализа; iV-число единиц в исследуемой серии, при этом п должно быть не менее 3 и не более 40.

Качество питательных сред. Питательные среды должны быть максимально пригодны для контроля микроорганизмов, т. е. учитывать различные потребности, обеспечивающие прорастание клеток, хотя изве­стно, что универсальной среды практически быть не может. По современ­ной НТД применяют жидкие питательные среды тиогликолевую и Сабу- ро, а для иммунобиологических - только тиогликолевую. Эта среда обла­дает некоторыми преимуществами: снижает окислительно-восстанови­тельный потенциал и способствует росту анаэробных микроорганизмов, обеспечивает рост грибов, нейтрализует антимикробное действие неко­торых консервантов.

Контроль качества питательных сред проводят путем проверки сте­рильности и ростовых свойств для доказательства отсутствия торможе­ния роста. В качестве тест-микроорганизмов для тиогликолевой среды используют определенные штаммы Bacillus subtilis, Clostridium sporogenes, Staphylococcus aureus, Escherichia coli. Для проверки ростовых свойств среды Сабуро используют Candida albicans.

Для контроля стерильности проверяют 5 % от партии приготовлен­ной питательной среды путем выдерживания в термостате при температу­ре 30-35 °С 48 ч для тиогликолевой и 20-25 °С 70-72 ч для среды Сабуро.

Метод анализа. Контроль стерильности можно проводить двумя методами: прямым посевом образца в питательные среды и мембранной фильтрацией. При прямом посеве испытуемый препарат предварительно растворяют или суспендируют и вносят в среду в количестве, зависящем от объема содержимого одной единицы: если в ампуле 1 мл, то весь объем, для ампул объема 1^4- мл засевают 1 мл, если объем составляет 5-19 мл - 2 мл, для объема 20-100 мл - 2-4 мл, а при анализе содержимого флако­нов объемом более 100 мл предпочтительным является метод мембран­ной фильтрации. Объем питательной среды должен в 10 раз превышать объем образца для посева.

Посевы втиогликолевую среду инкубируют при температуре 30-35 °С, а в среде Сабуро -20-25 °С. Продолжительность инкубации 14 суток.

Интерпретация результатов. Посевы просматривают ежедневно и по окончании периода инкубации. Наличие роста микроорганизмов оце­нивают визуально по появлению мутности, пленки, осадка и других при­знаков микробного роста. Выявленный рост подтверждают микроскопи­ей мазков, окрашенных по Граму. Препарат считают стерильным при от­сутствии роста микроорганизмов. При обнаружении роста хотя бы в од­ной пробирке (колбе) испытание проводят повторно на таком же количе­стве образцов. При отсутствии роста испытуемый препарат считают удов­летворяющим требованиям. В случае роста микроорганизмов при повто­ром посеве, морфологически сходных с микроорганизмами, обнаружен­ными в первичном посеве испытуемый препарат считают нестерильным. Если выявлена другая морфологическая группа, то испытание проводят в третий раз на удвоенном количестве образцов. При отсутствии роста в третьем испытании препарат считают стерильным. Если хотя бы в одной пробирке обнаружен рост, испытуемый препарат считают нестерильным.

Испытание на стерильность методом мембранной фильтрации. Испытание проводят с использованием открытой или замкнутой систе­мы. При испытании в открытой системе используют фильтродержатели и мембраны диаметром 47 мм. Метод основан на фильтрации образца че­рез мембрану с порами 0,45 мкм со скоростью, предотвращающей про­скок микроорганизмов. При испытании препаратов с антимикробной ак­тивностью после фильтрации мембрану тщательно промывают раство­ром, объем которого определен заранее. Предварительно эксперименталь­но определяют тип и объем промывной жидкости, необходимой для пол­ного удаления антимикробного вещества. Полноту отмывки мембраны можно проверить биологически по тест-микроорганизмам или методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. Мембрану после отмы­вания растворяют в 2 мл ацетона и оценивают присутствие антимикроб­ного вещества.

В анализах на стерильность целесообразно использовать мембра­ны, выполненные из инертных полимерных материалов, не взаимодей­ствующих с антимикробными агентами. Для предотвращения подтекания фильтруемой жидкости под мембрану, применяют мембраны с гидрофоб­ным краем. После фильтрации мембрану стерильными ножницами разре­зают пополам и одну часть помещают в тиогликолевую среду, а другую в среду Сабуро с последующим термостатированием в течение 7 суток при ранее указанных температурах. Одновременно проводится контроль на асептичность посева. Используют такую же стерильную установку, через которую пропускают заведомо стерильную жидкость и производят посев. Параллельно ставят контроль на отсутствие следов антимикроб­ного вещества. После внесения мембраны во флакон со средой добавля­ют суспензию, содержащую приблизительно 100 клеток тест-микроорга­низмов. В случае их прорастания делают вывод об устранении антимик­робной активности.

Испытание на стерильность в закрытой системе «Стеритест» про­водят для препаратов с выраженным антимикробным действием или име­ющим объем более 100 мл (инфузионных растворов). Преимуществами метода мембранной фильтрации являются:

1) высокая эффективность выявления микробной контаминации при низкой концентрации клеток в единице образца благодаря возмож­ности концентрирования или удержания на мембране даже единич­ных клеток при пропускании большого объема препарата;

2) высокая надежность выявления нестерильности антимикробных препаратов из-за отсутствия разбавления, что имеет место при уст­ранении антимикробной активности;

3) сокращенные сроки испытания.

К ограничениям метода мембранной фильтрации можно отнести необходимость проведения испытания в строго асептичных условиях (при использовании открытой системы), необходимость использовать эффек­тивное оборудование, мембранные материалы, а также повышенные тре­бования к квалификации персонала.