Цитогенетический метод

Основа метода — микроскопическое изучение хромосом человека. Цитогенетические исследования стали широко использоваться с начала 20-х гг. XX в. для изучения морфологии хромосом человека, подсчета хромосом, культи­вирования лейкоцитов для получения метафазных пластинок.

Развитие современной цитогенетики человека связано с именами цито­логов Д.Тио и А.Левана. В 1956 г. они первыми установили, что у человека 46 (а не 48, как думали раньше) хромо­сом, что положило начало широкому изучению митотических и мейотических хромосом человека.

В 1959 г. французские ученые Д. Лежен, Р.Тюрпен и М. Готье устано­вили хромосомную природу болезни Дауна. В последующие годы были описаны многие другие хромосомные синдромы, часто встречающиеся у че­ловека. Цитогенетика стала важней­шим разделом практической медици­ны. В настоящее время цитогенетиче­ский метод применяется для диагнос­тики хромосомных болезней, состав­ления генетических карт хромосом, изучения мутационного процесса и других проблем генетики человека.

В 1960 г. в г. Денвере (США) была разработана первая Международная классификация хромосом человека. В ее основу легли размеры хромосом и положение первичной перетяжки — центромеры

Все хромосомы по форме разделены на метацентрические, субметацентрические и акроцентрические и подразделены на 7 групп, обозначен­ных латинскими буквами А, В, С, D, Е, F и G. Каждая пара хромосом была на­делена порядковым номером от 1 до 22, выделены отдельно и поименованы латинскими буквами — X и Y половые хромосомы (Табл. 2.4).

В 1971 г. на IV Пражской конферен­ции генетиков в дополнении к Денвер­ской классификации были представле­ны методы дифференциальной окрас­ки хромосом, благодаря которым каж­дая хромосома приобретает свой непо­вторимый рисунок, что помогает точ­ной идентификации.

Основные сведения о морфологии хромосом человека получены при изу­чении их в метафазах митоза и профазе-метафазе мейоза. При этом важно, чтобы количество делящихся клеток, было достаточно высоко. Важнейшие цитогенетические работы выполнены на лимфоцитах периферической кро­ви, поскольку культивирование лим­фоцитов в течение 2-3 суток в присутствии фитогемагглютинина позволяет получить множество метафазных пла­стинок для хромосомного анализа.

Цитогенетическому анализу под­вергают однослойные метафазные пластинки с раздельно лежащими хро­мосомами Для этого делящиеся клет­ки обрабатывают колхицином и неко­торыми другими химическими веще­ствами (гипотоническим раствором солей, метанол-уксусным фиксатором и др.).

Важным этапом цитогенетического анализа является окраска полученных препаратов. Ее проводят простыми, дифференциальными и флюоресцент­ными методами.

Простая окраска обеспечивает груп­повую идентификацию хромосом. Ис­пользуется она для количественного учета хромосомных аномалий при оп­ределении мутагенности среды (дейст­вия радиации, химических мутагенов и др.). С помощью этого типа окраски были открыты многие хромосомные болезни, а также хромосомные аберра­ции), вызывающие самопроизвольные аборты, врожденные пороки развития, канцерогенез и т.п.

В 70-е гг. XX в. в медицинской прак­тике начали применяться методы диф­ференциального окрашивания, выяв­ляющие структурную разнородность хромосом по длине, что выражается в виде чередования светлых и темных полос (эу- и гетерохроматических рай­онов). Отмечается, что протяженность и рисунок полос специфичны для каж­дой хромосомы.

Дифференциальное окрашивание хромосом можно проводить рядом способов. Первоначально использова­ли акрихин- иприт — флюоресцентное алкилирующее вещество (Q-метод). Действие его основано на способности метафазиых хромосом дифференци­ально связывать флюорохромы. После окрашивания акрихинипритом сег­менты приобретают яркое флюоресци­рующее свечение. Для просмотра та­ких препаратов используют люминес­центный микроскоп.

В дальнейшем был разработан спо­соб окраски хромосом без флюорес­центных красителей. Это — G-окраска (краситель Гимза). После предвари­тельной инкубации в солевом растворе хромосомы обрабатываются протеазой. В результате они приобретают сег­ментированный вид благодаря чередо­ванию темно и светлоокрашенных уча­стков. Механизм образования сегмен­тов пока недостаточно ясен. Предпола­гается, что окрашенные сегменты — это гетерохроматиновые участки с по­вторяющимися последовательностями ДНК, а неокрашенные — эухроматиновые районы с кодирующими последо­вательностями ДНК (рис. 2.9).

К разновидностям дифференциаль­ного окрашивания по методу Гимзы относятся R-окрашиваемость и С-окрашиваемость. Эти разновидности дифференциального окрашивания получают при определенном измене­нии времени инкубации препаратов, окрашенных по методу Гимзы. В нервом случае распределение окрашен­ных и неокрашенных сегментов будет обратным тому, что наблюдается при G и Q-окрашивании. На R-окрашенных хромосомах гетерохроматиновые и околоцентромерные районы оста­ются светлыми. В случае же С-окраски выявляются районы структурного гетерохроматина, наиболее устойчи­вого к химическим и физическим по­вреждениям. В аутосомах и Х-хромосомах человека эти районы локализо­ваны в околоцентромерных участках, а в Y-хромосоме — в дистальной поло­вине длинного плеча. Наиболее круп­ные блоки С-хроматина имеются в ау­тосомах 1, 9 и 16 в области их вторич­ных перетяжек, а также в Y-хромосо­ме. Самыми мелкими центромерными блоками обладают Y-хромосома и аутосома 2 (рис. 2.10).

Одной из особенностей хромосом человека является асинхронность (не­одновременность) репликации по дли­не. В каждой хромосоме есть рано и по­здно реплицирующиеся участки. Для выявления последовательности репли­кации применяется 5-бромдезоксиури-дин — аналог тимина. Включившие его участки окрашиваются слабо.

Применяется 5-бром-дезоксиури-дин и для дифференциальной окраски сестринских хроматид, если он вводит­ся на полный клеточный цикл. В этом случае вновь образуемая хроматида, включит этот аналог тимина и будет окрашена слабо, а другая (старая) ок­расится интенсивно (рис. 2.11). Этот метод позволяет выявлять участки об­мена между сестринскими хроматидами (СХО).

При воздействии различными мута­генными факторами число СХО уве­личивается, следовательно, этот метод пригоден для изучения мутационного процесса у человека.

Успехи молекулярной цитогенетики человека позволяют разрабатывать но­вые методы изучения хромосом. Так, следует отметить метод флюоресцент­ной гибридизации in situ (FISH), кото­рый дает возможность исследовать широкий круг вопросов : от локализа­ции гена до расшифровки сложных пе­рестроек между несколькими хромосо­мами. Метод FISH может применяться и для диагностики анеуплоидий в ин­терфазных ядрах (см. главу 6).

Таким образом, соединение цитогенетических и молекулярно-генетических методов в генетике человека де­лает почти неограниченными воз­можности диагностики хромосомных аномалий.