Реферат Курсовая Конспект
Современные методы картирования хромосом - раздел Образование, Тема ХРОМОСОМНАЯ ТЕОРИЯ На Рубеже 70-Х Гг. Xx В. Молекулярная Генетика Достигла Определенной Заверше...
|
На рубеже 70-х гг. XX в. молекулярная генетика достигла определенной завершенности в своем развитии : были установлены структура и механизм репликации ДНК, провозглашена "центральная догма" экспрессии гена (транскрипция, трансляция), выяснены основные аспекты регуляции активности гена. Главным объектом исследования в то время служили микроорганизмы. Существовавшие в тот период методы не позволяли серьезно продвинуться в изучении строения геномов эукариот, в том числе и генома человека. Стремительный прорыв в молекулярной генетике в 70-е гг. стал возможен благодаря появлению новых экспериментальных подходов — использованию рестрикционных эндонуклеаз и становлению нового направления в молекулярной генетике — генной инженерии. С помощью этих методик были открыты совершенно неожиданные факты, имеющие теоретическое и практическое значение в областях знаний, связанных с действием генов. Это относится к генетическому консультированию, включая пренатальную диагностику, к развитию новых подходов в изучении проблем эволюции и популяционной генетики. Эти же успехи заставили ученых задуматься об этической стороне манипулирования с человеческим зародышем, об опасности возникновения возбудителей в процессе генно-инженерных исследований.
Принципы новых экспериментальных подходов должны быть понятны всем исследователям, однако детали молекулярно-генетических методов, которые привели к внушительному профессу генетики человека, изложены в специальных изданиях. Ниже рассматриваются основные принципы этих методов, и в качестве примера описывается анализ р-глобинового генного кластера человека с использованием рестрикционных ферментов, гибридизации нуклеиновых кислот, секвенирования ДНК и сортировки хромосом с помощью цитофлуорометрии.
Анализ р-глобинового гена человека
Гемоглобин взрослого человека HbAf состоит из четырех полипептидных цепей: двух а и двух р. Кроме такого гемоглобина, у человека известны и другие типы этой сложной молекулы. Так, у эмбрионов функционирует фетальный гемоглобин, в состав которого входят у-цепи, у взрослых людей в небольшом количестве обнаруживается гемоглобин НЬА2, в состав которого входят а-цепи р-глобиновый кластер генов в настоящее время полностью идентифицирован и проанализирован молекулярнотенетическими методами.
Этапы анализа.
В начале 60-х гг. был завершен аминокислотный анализ белка гемоглобина. Цепь р состоит из 146 аминокислот. Вся транскрибируемая часть гена должна содержать 438 нуклеотидов, т. к. генетический код триплетен (146*3 =438). Этот маленький участок нужно идентифицировать на одной из хромосом, в состав которой входит нить ДНК длиной несколько сантиметров. После того, как этот участок выявлен, его нужно выделить и накопить в большом количестве, чтобы определить последовательность нуклеотидов в составе анализируемого отрезка ДНК-молекулы.
родной ДНК с такими же липкими концами, полученные после разрезания аналогичной рестриктазой, можно сшить с плазмидной ДНК с помощью специального фермента — лига-зы. Полученную рекомбинантную молекулу, называемую вектором, можно ввести в бактерию, где она начнет многократно реплицироваться. Чужеродный фрагмент ДНК (им может стать и глобиновый ген) будет многократно амплифицирован вместе с плазмидой (рис. 3.23). Такая процедура называется клонированием генов и используется для создания банков генов
Этот методический подход позволяет разбить геном человека на отдельные фрагменты, каждый из которых может быть размножен вне организма человека. Еще одна область применения в молекулярной генетике рестрикраз — идентификация генов. Эти задачи решаются с помощью метода, разработанного Саузерном в 1975 г.
Суммарную ДНК из клеток человека гидролизуют эндонуклеазой примерно на 500 ООО фрагментов длиной от 102 до 105 нуклеотидных пар. Затем фрагменты разделяют по молекулярной массе с помощью гель-электрофореза на пластинках в агарозе. Следующий этан — получение одноцепочечных фрагментов ДНК денатурацией щелочью прямо в геле. С агарозной пластинки получают реплику- отпечаток на нитроцеллюлозном фильтре. Перенесенные на фильтр одноцепочечные фрагменты ДНК можно идентифицировать путем гибридизации с радиоактивными ДНК-зондами. Любой фрагмент, содержащий последовательность зондируемого гена, выявляется в виде темной полосы на радиоавтографе (фильтре, покрытом фотоэмульсией и проявленном после взаимодействия с радиоактивным зондом).
Рестрнкционные эндонуклеазы.
Рестрикция (разрезание) выделенной из клеток ДНК осуществляется ферментами — рестрикционными эндонуклеазами (рестриктазами) Эти ферменты вступают в реакцию с определенными участками ДНК, так называемыми сайтами узнавания, которые в клетке обычно бывают защищены специальными группировками (метилированы). После обработки ДНК эн-донуклеазами фрагменты имеют так называемые "липкие концы": рестриктазы разрезают две цепи ДНК не в одном месте, а в двух разных местах, в результате чего одна из цепей оказывается длиннее другой на несколько нуклеотидов. Свободные нуклеотиды могут спариваться с комплементарными нуклеотидами другого фрагмента ДНК с липкими концами. Благодаря этому, ДНК из различных источников может объединяться, образуя рекомбинантные молекулы. Это свойство рестрикционных фрагментов ДНК используется в генной инженерии для создания искусственных векторов на основе бактериальных плазмид, или фагов.
Помимо своей собственной молекулы ДНК, замкнутой в кольцо, бактерии часто содержат дополнительные маленькие кольцевые двухцепочечные молекулы ДНК (рис. 3.22), называемые илазмидами. Плазмиды реплицируются автономно, независимо от основной молекулы ДНК
Они могут содержать некоторые гены, например, определяющие устойчивость бактерий к антибиотикам или контролирующие синтез некоторых веществ. Плазмидную ДНК можно выделить и расщепить подходящей рестриктазой только п одном месте, при этом кольцевая молекула превращается в линейную с липкими концами. При добавлении к-ДНК, если комплементарны отдельные цепи, происходит восстановление двойной спирали (рис. 3.24). Для выявления реассоциированных молекул на фильтр наносят фотоэмульсию. Под действием излучения радиоактивных изотопов в составе к-ДНК, в фотоэмульсионном слое восстанавливаются зерна серебра, которые выглядят после проявления темными участками.
Метод гибридизации нуклеиновых кислот можно использовать на препарате хромосом после их соответствующей обработки. Так, исследуемый ген можно локализовать в специфическом хромосомном сегменте, одном из тех сегментов, которые наблюдаются при дифференциальном окрашивании. Поскольку эксперимент проводится с зондом к-ДНК, синтезированном на м-РНК, можно утверждать, что идентифицированный участок хромосомы содержит активный ген. Известно, что в геноме помимо активных генов, могут находиться псевдогены, такие последовательности ДНК, которые гомологичны активному гену, но не транскрибируются из-за отсутствия каких-то важных последовательностей вне транскрибируемой части.
Метод гибридизации нуклеиновых кислот позволил идентифицировать большое количество генов в хромосомах человека. В настоящее время достоверно картировано около 8000 генов человека. В большинстве случаев к идентифицированным генам найдены альтернативные аллельные формы. Для нескольких тысяч генов один из альтернативных аллелей определяет какое-либо наследственное заболевание или аномалии. Другие известные гены кодируют белки групп крови, различные антигены, иммуноглобулины, ферменты метаболизма и т.д.
Главное условие такого анализа — наличие подходящего радиоактивного ДНК-зонда.
Создание зонда для гена р-глобина связано с получением матричной РНК р-глобина из созревающих эритроцитов, где активно синтезируется гемоглобин. Затем с помощью фермента обратной транскринтазы, который обеспечивает считывание пуклеотндной последовательности м-РНК в комплементарную последовательность ДНК, получают так называемую к-ДНК с высокой радиоактивной меткой
В настоящее время созданы библиотеки к-ДНК из разных источников. Имеются геномные библиотеки человека, полученные генно-инженерными методами, а также хромосомно-специфические библиотеки, полученные из отдельных специфических хромосом или их участков. Создание таких библиотек требует выделения отдельных хромосом. В настоящее время это стало возможным благодаря сортировке хромосом цитофлуорометрическим методом. Для синтеза к-ДНК используются также автоматизированные устройства, в том случае, если производится синтез к-ДНК гена определенного белка, аминокислотная последовательность которого известна.
Гибридизация нуклеиновых кислот
Идентификация фрагментов одноцепочечной ДНК на нитроцеллюлозном фильтре происходит с помощью гибридизации цепей ДНК. Большинство природных ДНК встречается в виде двухцепочечных молекул, где азотистые основания двух цепей взаимодействуют по принципу комплементарности с помощью водородных связей.
Секвенирование ДНК
В последние годы разработаны методы быстрого секвенирования ДНК. Для этого длинную молекулу ДНК с помощью рестрикраз разрезают на фрагменты удобного размера
Затем эти фрагменты размножают путем клонирования и специальными методами определяют последовательность нуклеотидов в каждом из фрагментов. Очередность фрагментов восстанавливают, используя перекрывающиеся концы (участки ДНК с одинаковой последовательностью в разных клонах). С помощью секвенирования получают точные сведения и о нетранскрибируемых участках ДНК, важных для контроля транскрипции.
Анализ р-глобинового гена.
Первый этап анализа связан с идентификацией этого гена в суммарной человеческой ДНК. Для этого ДНК выделяют из клеток, с помощью эндонуклеаз получают фрагменты, раздечяют их в агарозе с помощью гель-электрофореза, денатурируют на две отдельные цепи и создают реплику с препарата на нитроцеллюлозном фильтре. Следующий шаг состоит в том, чтобы найти среди всех фрагментов р-глобиновый ген. Для этого необходим радиоактивный ДНК-зонд. Его синтезируют на р-глобиновой РНК с помощью обратной транскриптазы. Далее этот к-ДНК зонд используют для двух задач. Первое — идентифицировать фрагменты ДНК, соответствующие глобиновому гену, прямо на фильтре
Задача вторая — идентифицировать на препарате хромосом место нахождения этого гена. Идентификация в обоих случаях происходит с помощью гибридизации радиоактивной к-ДНК с денатурированной ДНК препарата. Так, ген гемоглобина-р был локализован на коротком плече 11-й хромосомы.
Для более подробной характеристики глобинового гена необходимо получить большое количество его ДНК. Для этого клонируют к-ДНК в каком-нибудь векторе, например, в бактериальной млазмиде. Затем сравнивают фрагменты геномной ДНК, содержащие глобиновый ген, и клонированную к-ДНК, соответствующую м-РНК. Оказалось, что фрагменты геномной ДНК значительно больше, чем к-ДНК. В р-гемоглобиновом гене были выявлены две вставочные последовательности (интроны^), которые разделяют три разные кодирующие области — экзоны. (Исследования многих других эукариотических генов, показали, что наличие нитронов является правилом для большинства из них). Выяснилось также, что ген р-гемоглобина относится к уникальным последовательностям. Кроме того, были найдены псевдогены, имеющие мутации в колирующих и фланкирующих, регуляторных участках. Они называются нсевдогенами, т.к. с них не идет транскрипция.
Сейчас известны последовательности ДНК различных глобиновых генов. Их изучение позволило решить много общих проблем, касающихся организации и экспрессии генетического материала в клетке.
Полимеразная цепная реакция
В середине 80-х гг. в молекулярной генетике был введен в практику совершенно новый метод, позволяющий очень быстро размножить следовые количества молекул ДНК или РНК Чувствительность его такова, что позволяет обнаружить в пробе всего одну присутствующую в ней молекулу. Открытие этого метода позволило многократно ускорить исследования по картированию генома человека.
Полимеразная цепная реакция была открыта в 1984 г. КБ. Мюллисом. Она основана на том, что новосинтезируемые цепи нуклеиновых кислот могут служить матрицами в следующих циклах репликации. Реакция осуществляется последовательными циклами. Каждый из них начинается с разделения двуспиральной молекулы ДНК на две одноценочечные. В таком состоянии каждая цепочка может служить матрицей для репликации. Затем одноцепочечные нити ДНК инкубируют в присутствии ДНК-полимеразы в растворе со смесью всех четырех нуклеотидов и специфической последовательностью ДНК — праймером. Присоединение праймера к одноцепочеч-ной нити ДНК приводит к образованию небольшого двуцепочечного отрезка, который удлиняется с помощью ДНК-нолимеразы. Процедуры многократно повторяются, происходит множественное копирование старых и новых одноцепочечных молекул. Отдельный цикл занимает около 5 мин., клонирование одного фрагмента ДНК происходит всего в течение нескольких часов.
Помимо молекулярной генетики, метол полимеразной цепной реакции широко используется в практических исследованиях: прснатальной диагностике наследственных болезней, выявлении вирусных инфекций, а также в судебной медицине, поскольку этот метод позволяет проводить генетическую "дактилоскопию" по одной единственной клетке.
Программа "Геном человека"
С развитием новых технологий молекулярных исследований, основанных на быстрых методах работы с ДНК (клонировании фрагментов ДНК генноинженерными способами и с помощью полимеразной реакции, автоматизированном секвенировании), с введением в практику молекулярногенетических исследований компьютерных технологий сравнительного анализа строения геномов представителей разных систематических групп, с развитием техники направленного воздействия на генетический аппарат клетки и организма в целом и возможности создания искусственных ферментов по нуклеотидной последовательности фрагмента ДНК темпы развития молекулярной генетики обрели стремительный характер и привели к возникновению в конце 80-х гг. международной программы "Геном человека". Этот глобальный проект предполагает к 2005 г. завершить определение полной последовательности всех трех миллиардов нуклеотидных звеньев, составляющих геном человека. Принятие такой программы означает, что характер развития молекулярной биологии достиг совершенно нового уровня. Произошедший качественный скачок в технологии позволяет решать принципиально новые задачи.
Более ранние молекулярногенетические работы проводились с целью исследовать строение генов, идентифицировать их в целом геноме, изучить по возможности функцию гена и уровни его регуляции. Методы современной молекулярной генетики позволяют отследить эффект действия того или иного гена на уровне целого организма, изучать не отдельные гены, а структуры и функции целых геномов. На сегодняшний день изучены: геномы 141 вируса, более 50 геномов митохондрий из разных объектов, большое количество геномов бактерий. Установлено, что бактериальный геном содержит 5-6 тыс. генов, из представителей эукариот наиболее близки к завершению изучение геномов дрожжей и нематод. Показано, что геном дрожжей имеет в своем составе около 6 тыс. генов.
Суммарная длина нуклеотидных последовательностей генома человека соответствует 3 миллиардам. По данным разных авторов, такая гигантская нуклеотидная последовательность может содержать от 50 до 100 тыс. генов. В настоящее время известна структура около 7 тыс. генов. Изучение структуры генов — не конечная цель программы. Помимо анализа последовательности нуклеотидов, проводится их картирование
Каждый ген приписывается к определенной хромосоме в строго определенное место — локус, устанавливается расстояние между генами, составляется карта хромосом человека. В настоящее время картированы около 8 тыс. генов. Увеличению скорости картирования генов на хромосомах способствует выявление маркерных последовательностей для каждой хромосомы. Эти маркерные последовательности много раз повторяются вдоль хромосомы и как бы делят ее на ограниченные участки. Работа с таким небольшим участком хромосомы облегчает процедуру выделения гена. Благодаря существованию маркерных последовательностей, геном человека разбит на отдельные фрагменты, и каждый фрагмент в случае необходимости может быть легко размножен вне организма.
Помимо задачи картирования генов и установления их структуры, программа "Геном человека" ставит цель определить структурно-функциональную взаимосвязь генов. Для решения этой задачи используются совершенно новые подходы, которые просто невозможно было представить себе несколько лет назад. Так, по дефектному ферменту, который
является причиной наследственного заболевания, зная последовательность аминокислот в его составе, можно искусственно синтезировать информационную РНК, а затем соответствующий участок ДНК, идентифицировать его на хромосомной карте, выделить нативный ген и клонировать его вне организма, чтобы установить, в чем причина образования дефектного фермента. Таким способом были изучены гены дистрофии рака молочной железы, мутантной фенилаланингидроксилазы, являющейся причиной наследственной фенилкетонурии, и ряда других генов.
Еще один новый методический подход в изучении функции генов связан с использованием информационно-компьютерных технологий. Этот путь исследований основан на следующем предположении : если у представителей разных систематических групп имеются одинаковые по структуре гены, то они выполняют одинаковую функцию. Таким образом была установлена причина развития рака толстой кишки у человека. Методами клонирования и картирования была изучена структура генов, отвечающих за развитие рака толстой кишки. Затем был проведен поиск в информационном поле с помощью компьютерных технологий. В процессе этого поиска была предпринята попытка найти в геноме дрожжей, который уже полностью расшифрован, гены, сходные по структуре с исследуемыми генами человека. И они были обнаружены. Оказалось, что у дрожжей такие же гены отвечают за репарацию ДНК. Таким образом, было установлено, что рак толстой кишки связан с мутациями генов, кодирующих ферменты репарации ДНК.
Важнейшую роль в структурных исследованиях генома человека играет изучение его полиморфизма. Популяционный полиморфизм генома человека является основой для понимания принципов молекулярной эволюции, механизмов возникновения патологических мутаций, для оценки факторов риска при воздействии потенциально токсических агентов окружающей среды на человеческий организм, наконец, для понимания основ различной индивидуальной восприимчивости лекарств. Эти исследования получили новый импульс с открытием полиморфных мини- и макросателлитных последовательностей ДНК, которые используют в качестве маркеров при картировании генома человека.
Новым этапом в изучении структурно-функциональных связей между генами в программе "Геном человека" является возможность клонирования крупных фрагментов генома в специальных векторах, способных размножаться в клетках вместе со встроенными в них фрагментами. В качестве вектора в таких случаях используют искусственные дрожжевые хромосомы, появление которых стало возможным благодаря развитию генетики дрожжей. Использование таких векторов позволяет клонировать фрагменты ДНК длиной до 106 пар оснований. Это создает предпосылки для быстрого выделения нужного фрагмента генома и использования его для структурного или функционального анализа.
Использование новых методов в изучении генетики человека позволяет значительно ускорить процесс исследовательской работы и накопить информацию о генах, играющих ключевую роль в регуляции жизнедеятельности клетки. К таким генам относятся гены контроля клеточного цикла, гены, кодирующие компоненты цепи передачи сигнала от клеточной поверхности к аппарату транскрипции в ядре, гены, контролирующие развитие эмбрионов, гены, ответственные за работу защитных систем организма, гены иммунной системы. Активно расширяется представление о генах, повреждение которых приводит к возникновению раковых опухолей, онкогенах, генах-супрессорах, генах клеточной смерти и апоптоза (программируемой гибели клеток)
Все более детальным становится знание надмолекулярных уровней организации регуляции экспрессии генов.
Выполнение программы "Геном человека" приближает возможность использования генной терапии для лечения патологий, связанных с изменением наследственной информации. Генная терапия основана на введении в организм больного искусственных генетических конструкций. Лечебный эффект достигается в результате работы введенного гена либо за счет подавления функции "больного" гена. Современная генная терапия делает первые шаги и имеет дело с соматическими клетками в постнатальном периоде жизни человека, но в то же время разрабатываются подходы к генной терапии клеток эмбриона.
Для создания генетических конструкций большей частью используются вирусы. При этом из генома вируса вырезается часть генов, ответственных за формирование инфекционных ви-русных частиц и разрушение инфицированных клеток. Гены, необходимые для переноса и функционирования генетической информации, сохраняются. К ним добавляются клонированные гены, оказывающие лечебный эффект
Одними из наиболее приемлемых для генной терапии окажутся, видимо, аденовирусные векторы, поскольку аденовирусы не встраиваются в геном клетки хозяина, имеют широкий спектр поражения тканей человека и не индуцируют злокачественный рост.
В настоящее время разрабатываются способы для целевой доставки искусственных векторов к тем или иным органам. Для этого используют локальные инъекции, аэрозольный метод, баллистический метод, основанный на обстреле ткани микрочастицами тяжелых металлов (золота, вольфрама), покрытых векторной ДНК.
Результаты генной терапии можно рассмотреть на конкретном примере. У мальчика, больного гемофилией из-за дефицита девятого фактора свертывания крови, с помощью биопсии были выделены фибробласты кожи и культивированы в клеточной культуре, В эти клетки был введен искусственный вектор, созданный на основе ретровируса и содержащий гены, которые увеличивают активность девятого фактора. Инфицированные клетки были размножены в клеточной культуре и возвращены в организм мальчика подкожно в районе спины и ягодиц. Клетки прижились, в результате была увеличена активность девятого фактора свертывания крови, и симптомы гемофилии у пациента были сглажены. Таким образом, генно-инженерные работы создают подходы к лечению гемофилии человека.
Генная терапия — направление, появившееся на стыке двух наук: биологии и медицины, пока имеет скромные практические успехи, но с этим направлением связано развитие медицины XXI-го столетия.
Перспектива использования достижений программы "Геном человека" многопланова: от идентификации генов, ответственных за возникновение наследственных и приобретенных заболеваний, до развития систем лечения, основанных на введении в организм новой генетической информации, корректирующей генетические дефекты (генная терапия), и интенсивных методов диагностики, основанных на выявлении генетических дефектов, и перехода в диагностике к наиболее полному обследованию популяций для выявления предрасположенности к болезни.
– Конец работы –
Эта тема принадлежит разделу:
Хххххххх хххххххх хххххх Тема ХРОМОСОМНАЯ ТЕОРИЯ... Занятие Генные мутации... Занятие Хромосомные и геномные мутации...
Если Вам нужно дополнительный материал на эту тему, или Вы не нашли то, что искали, рекомендуем воспользоваться поиском по нашей базе работ: Современные методы картирования хромосом
Если этот материал оказался полезным ля Вас, Вы можете сохранить его на свою страничку в социальных сетях:
Твитнуть |
Новости и инфо для студентов