Молекулярно-генетические методы

Конечный итог молекулярно-генетических методов — выявление изме­нений в определенных участках ДНК, гена или хромосомы. В их основе ле­жат современные методики работы с ДНК или РНК. В 70-80 гг. в связи с прогрессом в молекулярной генетике и успехами в изучении генома человека молекулярно-генетический подход на­шел широкое применение.

Начальным этапом молекулярно-генетического анализа является получе­ние образцов ДНК или РНК. Для это­го используют геномную ДНК (вся ДНК клетки) или отдельные ее фраг­менты. В последнем случае, чтобы по­лучить достаточное количество таких фрагментов, необходимо, амплифицировать (размножить) их. Для этого пользуются полимеразной цепной ре­акцией — быстрым методом фермента­тивной репликации определенного фрагмента ДНК. С его помощью мож­но амплифицировать любой участок ДНК, расположенный между двумя известными последовательностями.

Анализировать огромные молекулы ДНК в том виде, в котором они суще­ствуют в клетке, невозможно. Поэтому прежде их необходимо разделить на части, обработать разнообразными рестриктазами — бактериальными эндонуклеазами. Эти ферменты способны разрезать двойную спираль ДНК, при­чем места разрыва строго специфичны для данного образца. Расщепление ДНК рестриктазами дает характерный набор фрагментов (4-6 пар основа­ний), отличающихся по длине.

Фракционирование (т.е. разделение) фрагментов ДНК по размеру и длине проводится с помощью электрофореза на поверхности агарозного или полиакриламидного геля. Под действием электрического поля фрагменты ДНК начинают перемещаться вниз по гелю со скоростью, зависящей от их длины. (Чем короче фрагменты, тем быстрее они движутся). В результате каждый фрагмент ДНК занимает определенное положение в виде дискретной полосы в конкретном месте геля. Длину каждого фрагмента можно определить путем сравнения расстояния, пройденного им и стандартным (с известными размера­ми) отрезком ДНК.

Молекулярно-генетическую диа­гностику наследственных болезней ис­пользуют и для изучения генома чело­века. Чтобы выявить необходимые для этого специфические фрагменты ДНК, используют блот-гибридизацию по Саузерну. Сущность этой методики кратко состоит в следующем: сначала осуществляют денатурацию ДНК с об­разованием одноцепочечных фрагмен­тов, которые переносят на нитроцеллюлозный или нейлоновый фильтр в буферном растворе.

Агарозный гель с фрагментами ДНК помещают на фильтровальную бумагу, смоченную концентрирован­ным солевым раствором. На гель на­кладывают нитроцеллюлозный фильтр, а сверху помещают сухую фильтровальную бумагу, в которую впитывается солевой раствор. ДНК переносится вместе с раствором, но за­держивается фильтром и практически полностью оказывается на его поверх­ности. Затем одноцепочечные ДНК фиксируют на фильтре. Расположение фрагментов на фильтре точно соответ­ствует их расположению в геле.

Чтобы выявить нужные фрагменты, проводят гибридизацию ДНК с радиактивным ДНК-зондом или клониро­ванным фрагментом ДНК. Нуклеотид-ная последовательность зонда должна быть полностью или частично компле­ментарна изучаемому участку геном­ной ДНК.

Результат гибридизации компле­ментарных цепей радиоактивного ДНК-зонда и фрагмента ДНК обнару­живают с помощью радиоавтографии: каждая комплементарная зонду после­довательность ДНК проявляется в ви­де радиоактивной полосы.

С помощью метода Саузерна можно составить рестрикционную карту гено­ма в участке исследуемого гена и уста­новить, несет ли данный ген какие-ли­бо дефекты

Так, разработаны эффек­тивные методы синтеза искусственных ДНК-зондов, которые используются в диагностике наследст­венных заболеваний. Для этого из эмб­риональных клеток, содержащихся в амниотической жидкости плода, выде­ляют ДНК и гибридизируют ее с помо­щью Саузерн-блоттинга с радиоактив­ным ДНК-зондом. Аномальный эмб­рион легко распознается, т.к. его ДНК будет гибридизоваться только с ДНК-зондом, комплементарным мутантной последовательности.

В настоящее время имеются различ­ные методы выявления мутаций. Их делят на прямые и косвенные. Прямая диагностика мутаций включает ряд методов:

1. Определение нуклеотидной по­следовательности (секвенирование), дающее возможность выявить замены оснований, делеции и вставки в изуча­емом фрагменте.

2. Выявление нарушения места рес­трикции, с помощью блот-гибридизации но Саузерну. Около 50% нуклеотидных замен ведет к изменению сайта (места) рестрикции. Это делает воз­можным выявить мутацию путем рестриктного анализа.

3. Проведение аллелоспецифической гибридизации с синтетическими зондами, что позволяет обнаружить мутации н геномной ДНК

Последова­тельность оснований в зонде может быть задана по дефектному или нор­мальному варианту гена. В обоих слу­чаях зонд используется для гибриди­зации с фрагментами ДНК обследуе­мого индивида.

4. Химическое и ферментативное расщепление ДНК в местах непра­вильной сшивки оснований выявляет большую группу мутаций, ведущих к нестабильности ДНК. Метод заключа­ется в электрофорезе двухцепочечной ДНК в нейтральном или равномерно денатурирующем геле.

5. Регистрация изменения электрофоретической подвижности мутантных молекул ДНК.

6. Трансляция белкового продукта осуществляется в системе in vitro на основе получения специфической мРНК с добавлением лизата ретикулоцитов. Синтезируемый белок анализи­руют с помощью электрофореза. Изме­нение подвижности белка указывает на наличие мутации.

К косвенному выявлению мутаций прибегают в тех случаях, когда нуклеотидная последовательность гена еще не расшифрована, но известно его по­ложение на генетической карте. Техни­ческие приемы такие же, как и в пря­мой диагностике, но добавляется мате­матический анализ.

Диагностике мутаций способствует нахождение в геноме полиморфных по длине рестрикционных фрагментов. Их можно выявить с помощью блот-гибридизации по Саузерну.

Другим типам полиморфизма ДНК являются микросателлиты. Это корот­кие моно-, ди-, три- и тетрануклеотидные тандемно повторяющиеся после­довательности ДНК. Они используют­ся в качестве маркерных локусов аллельных вариантов гена или маркеров дефектных мутаций.

В 1993 г. был идентифицирован ген, ответственный за возникновение тя­желого заболевания нервной системы у человека — хореи Гентингтона (ХГ). Болезнь, проявляющаяся после 40 лет, выражается в расстройстве движений, снижении интеллекта, в нарушении эмоционально-волевой сферы и др. Этот недуг наследуется по аутосомно-доминантному типу со 100 % пенетрантностью. Ген локализован в корот­ком плече 4-й хромосомы.

Оказалось, что ген ХГ содержит об­ласть, в которой нуклеотидная последовательность представлена много­кратным повторением трех нуклеотидов — ЦАГ (цитозин-аденин-гуанин) геномной ДНК. В норме количество таких повторов колеблется от 11 до 34, а у больных ХГ их 37-86 (в среднем 45). И, следовательно, хорея Гентингтона относится к наследственным за­болеваниям, при котором мутация ге­на состоит в экспансии (многократном увеличении числа копий) тринуклеотидных ЦАГ-повторов.

Установлено, что форма болезни бо­лее тяжелая, если ХГ проявляется в молодом возрасте, наследуется по от­цовской линии и нарастает в последу­ющих поколениях. Ученые пришли к выводу, что число ЦАГ-повторов тесно связано и со сроком появления первых симптомов, и с тяжестью заболевания.

В 1992 г. экспансия тринуклеотидных ЦТГ-повторов была обнаружена в гене, который вызывает миотоническую дистрофию. Этот ген, названный ДМ-1, был картирован на 19-й хромо­соме. Длина последовательности ЦТГ-повторов весьма различна. Если в нор­мальной популяции она колеблется от 5 до 30, то у больных миотонической дистрофией, количество повторов мо­жжет достигать многих сотен.

Болезнь наследуется по аутосомно-доминантному типу, обычно начинает­ся в зрелом возрасте и проявляется прогрессирующей мышечной слабос­тью, а в некоторых случаях задержкой умственного развития, поражением скелета, сердечно-сосудистой системы и глаз. Для миотонической дистрофии характерно возрастание тяжести болез­ни на протяжении трех или четырех по­колений. Если в первом поколении бо­лезнь возникает в зрелом возрасте и проявляется лишь развитием катарак­ты или легким нарушением сократимо­сти мышц, то в последующих поколе­ниях болезнь начинается сразу после рождения ребенка, у которого развива­ется выраженная мышечная слабость, задержка умственного развития.

В последние годы было показано, что подобный механизм мутаций характе­рен и для ряда других наследственных заболеваний нервной системы челове­ка: болезни Кеннеди, синдрома фрагильной (ломкой) Х-хромосомы и др.