Хромосомы человека

История развития цитогенетики человека

Впервые митотические хромосомы человека были описаны в работах Дж. Арнольда (1879) и В. Флемминга (1882). В последующие годы различ­ные оценки их количества давали ре­зультаты от 47 до 49 хромосом, причем у мужчин и женщин находили разное их число. Эти первые исследования проводились на гистологических сре­зах тестикул или яичников. В то время техника получения срезов была тако­ва, что митозы в готовых препаратах были, как правило, разрушены. Хромо­сомы на них накладывались одна на другую, образовывали клубки и плохо поддавались анализу. Эти трудности удалось преодолеть только к 50-м гг. XX в., когда для получения препаратов хромосом стали использовать суспен­зии клеток, выращенных в клеточных культурах. Так, первые препараты хро­мосом человека с хорошим разрешением были получены на клетках фибробластов эмбриона легкого, выращенных in vitro. Суспензии клеток промывали гипотоническим раствором, в резуль­тате чего клетки набухали и лопались, а хромосомы свободно распределялись на стекле. Позже этот способ был усо­вершенствован. Перед гипотоничес­ким шоком на клетки воздействовали колхицином — веществом, которое, разрушая нити веретена деления, оста­навливает митоз на стадии метафазы, когда хромосомы наиболее легко иден­тифицировать. Это позволило полу­чить большое число клеток в метафазе митоза, и препараты, приготовленные таким образом были более удобны для подсчета хромосом. Пользуясь подоб­ным методическим подходом, в 1955 году А. Леван и Дж. Тио, изучив 261 метафазную пластинку, пришли к вы­воду, что количество хромосом в клет­ках человека равно 46, причем как в мужских, так и в женских клетках. Го­дом позже и другие исследователи на препаратах тестикул трех пожилых мужчин на стадии метафазы мейоза 1 нашли 23 бивалента, что соответствует 46 хромосомам в диплоидном наборе. Эти результаты ознаменовали возник­новение новой отрасли исследований — клинической цитогенетики. В настоя­щее время цитогенетика человека до­стигла высокого уровня и находится на переднем крае фундаментальной цитогенетики.

Нормальный кариотип человека

Препараты хромосом человека мож­но приготовить из любых тканей и клеточных суспензий, но лишь, если в них содержатся делящиеся клетки, т. к. вне деления (во время интерфазы) хромосомы деспирализуются и пере­ходят в состояние хроматина Чаще всего препараты готовят из клеток ко­стного мозга, кратковременной куль­туры клеток крови или из перевивае­мой культуры фибробластов. Наибо­лее прост и доступен метод культиви­рования клеток крови лейкоцитов и лимфоцитов. Митозы в таких культу­рах стимулируют искусственно. Что­бы остановить жизненный цикл кле­ток в прометафазе, в них подавляют образование веретена деления, обраба­тывая веществами с колхициноподобными свойствами. Для свободного рас­пределения хромосом на стекле клетки обрабатывают гипотоническим рас­твором, вызывая гипотонический шок. Затем препарат фиксируют смесью этанола и уксусной кислоты, высуши­вают и окрашивают. Когда с помощью стандартных методов хромосомы ок­рашиваются целиком, равномерно и интенсивно, их систематизируют со­гласно Денверской классификации, принятой в 1960 г., нумеруя пары хро­мосом от 1 до 23. В кариотипе человека различают метацентрические, субметацентрические и акроцентрические хромосомы. Учитывая относительную длину плечей, положение центромеры и центромерный индекс, который отражает процентное соотношение длин корот­кого плеча и всей хромосомы, 23 пары хромосом человека разбивают на 7 групп (рис .13). В группу А (№№ 1-3) входят пары наиболее крупных метацентрических аутосом. Группа В (№№ 4-5) объединяет две пары субметацентрических хромосом, неразличи­мых между собой. Группа С (№№ 6-12) содержит семь пар аутосом среднего размера. Размеры и форма этих хро­мосом неодинаковы, однако стандарт­ные методы окрашивания не позволя­ют их идентифицировать. В группу D (№№ 13-15) объединены три пары акроцентрических хромосом среднего размера, морфологически сходных между собой. Все хромосомы группы D содержат спутник, который не все­гда выявляется, может быть очень большим, а иногда и двойным. Длина короткого плеча этих хромосом также изменчива. К группе Е (№№ 16-18) от­носятся три пары почти метацентрических хромосом, из которых в 16-й паре центромера наиболее близка к середи­не, а две другие пары неотличимы друг от друга. Группа F содержит мелкие метацентрические аутосомы (№№ 19-20), группа G — мелкие акроцентриче­ские (№№ 21-22). Внутри групп F и G нары хромосом неразличимы. Длина коротких плечей у них изменчива, как и у хромосом группы D. Короткие плечи хромосом групп D и G содер­жат районы ядрышкового организа­тора. Перечисленные 22 пары хромо­сом относятся к аутосомам, одинако­вым у мужчин и женщин. Половые хромосомы составляют 23-ю пару. У женщин — это две Х-хромосомы. У мужчин — Х- и Y-хромосомы. Половая Х-хромосома неотличима от аутосом группы С. При стандарт­ном окрашивании она включается в состав этой группы: №№ 6-12 и X. Мужская половая Y-хромосома явля­ется акроцентрической, сходна по мор­фологии с хромосомами группы G, но ее легко отличить по морфологичес­ким критериям. Длина короткого пле­ча Y-хромосомы изменчива и индиви­дуальна, причем варианты длины пле­ча наследуются от отца к сыну. Y-хро­мосома, в отличие от хромосом послед­ней группы, не имеет спутников. В ин­терфазных ядрах концевой участок длинного плеча Y-хромосомы можно выявить в составе хроматина, пользу­ясь специфическим окрашиванием ак­рихин-ипритом : в результате этот уча­сток выявляется как яркое пятно диа­метром 0,3-1,0 мкм,

Во многих хромосомах человека об­наружены ломкие (фрагильные) уча­стки, подверженные хромосомным и хроматидным разрывам. Такие разры­вы легко получить в клеточных куль­турах, удаляя фолиевую кислоту из питательной среды культивируемых клеток, В настоящее время показано, что одна из форм умственной отстало­сти человека связана с наличием опре­деленного фрагильного участка в кон­цевом районе длинного плеча Х-хромосомы.

Длина одной и той же хромосомы в разных фазах митоза различна, по­скольку конденсация хромосом про­должается до конца метафазы. Кроме того их конденсация значительно уси­ливается в присутствии применяемого для приготовления препаратов колхи­цина.

Анализ препаратов хромосом чело­века показал, что в ряде случаев, как уже говорилось выше, на некоторых хромосомах могут существовать вто­ричные перетяжки. Спутничными пе­ретяжками обладают все акроцентрические хромосомы (нары №№ 13, 14, 15,21,22). Вторичная перетяжка быва­ет также в аутосомах пары № 9. В них она располагается в околоцентромерном районе длинного плеча.

Дифференциальное окрашивание хромосом

Современные цитогенетические ме­тодики позволяют идентифицировать по морфологии все пары хромосом на препарате, а в ряде случаев и хромосомы внутри одной пары. Суть этих ме­тодик состоит в дифференциальном окрашивании нативных хромосом по длине, что обеспечивается сравнитель­но

простыми температурно-солевыми воздействиями на фиксированные хромосомы или использованием спе­цифических красителей (рис. 3.19). Дифференциальное окрашивание при­водит к появлению линейного рисунка но длине хромосомы.

Несмотря на большое разнообразие способов обработки хромосомных пре­паратов и красителей, выявляемый ли­нейный рисунок хромосомы всегда один и тот же. Он меняется только в зависимости от степени конденсиро­ванное™ хромосомы. Сегмент, види­мый как одна полоса в метафазной хромосоме, в менее конденсированной прометафазной хромосоме, может предстать в виде нескольких мелких полос.

Дифференциальное окрашивание в зависимости от используемого метода может охватывать либо всю длину хро­мосомы, либо ее центромерный район.

Представление о рисунке диффе­ренциально окрашенных по всей дли­не хромосом можно получить, окраши­вая препараты по G-методу с исполь­зованием красителя Гимзы. В этом случае хромосомы выглядят состоя­щими из поперечноисчерченных, по-разному окрашенных сегментов. Каж­дой паре хромосом присущ индивиду­альный рисунок исчерченности за счет неодинаковых размеров сегментов. В мелких хромосомах рисунок образует­ся единичными сегментами, в крупных хромосомах сегментов много

Общее для нормального хромосомного набо­ра число окрашенных и неокрашенных сегментов в метафазе составляет около 400. В прометафазных хромосомах оно увеличивается до 850 и более.

Разные типы сегментов получили обозначения G-, Q-, R-, С-, и Т по на­званиям методов, с помощью которых они выявляются. Так, для G-сегментов это метод Гимза после предваритель­ной обработки фиксированных хромо­сом. Q-сегменты после окрашивания акрихинипритом приобретают яркое флюоресцирующее свечение. Рисунок Q и G-сегментов полностью иденти­чен. R-сегменты расположены между Q-сегментами.

Место нахождения С-сегментов можно обнаружить с использованием других методов окрашивания. Эти сег­менты связаны с локализацией кон­ститутивного, или структурного гетерохроматина. В разных хромосомах размер С-сегментов неодинаков. Гетерохроматин, обнаруженный по методу С-окраски, содержится во всех хромо­сомах человека. Он находится в околоцентромерных районах всех хромосом, а также в дистальной части длинного плеча Y-хромосомы, на длинных пле­чах 1-й, 9-й и 16-й пар хромосом

Не­большие блоки структурного гетерохроматина выявляются в плечах 2-й нары и Х- хромосом. В акроцентрических хромосомах гетерохроматин С-сегментов расположен в коротких плечах. Накопленные сведения гово­рят, что в разных популяциях человека размеры сегментов гетерохроматина значительно различаются. Морфоло­гические особенности сегментов на­следуются по законам Менделя (рис. 3.20). Особенно изменчива величина С-сегментов в аутосомах №№ 1, 4, 9, 13-15, 16, 21-22 и Y-хромосоме. По­скольку у большинства носителей та­ких особенностей кариотипа отсутст­вуют фенотипические аномалии, то подобные особенности в строении хро­мосом можно рассматривать как вари­анты нормы. Согласно данным общей цитогенетики, значительное количест­венное изменение гетерохроматина в кариотипе не оказывает сильного от­рицательного влияния на развитие ор­ганизма человека.

Еще один тип сегментов — Т — вы­является также с помощью специфи­ческих методов окрашивания и при­сутствует в теломерных районах всех хромосом.

В метафазе митоза может быть вы­явлена еще одна характеристика ли­нейной неоднородности хромосом. Она связана с асинхронностью репли­кации ДНК в их разных участках. Та­кой тип окрашивания разбирается по­дробно в главе 4 в разделе, посвящен­ном клеточному циклу.

Индивидуальная совокупность сег­ментов, различающихся по ширине и интенсивности окрашивания, образует цитологическую карту каждой хромо­сомы. Основанные на дифференциаль­ном окрашивании хромосом цитологические карты имеют исключительное значение для развития цитогенетики человека. С помощью этих карт стало реальным выяснить происхождение аномальных хромосом, вплоть до точ­ного описания, какие конкретно райо­ны вовлекаются в ту или иную форму хромосомного нарушения. На между­народных совещаниях по номенклатуре в цитогенетике человека была разрабо­тана и введена в практику система обо­значения сегментов нормальных хро­мосом и хромосом, подвергшихся тем или иным структурным перестройкам.

Дальнейшее совершенствование ме­тодов окрашивания хромосом позво­лило выявить до 1000 полос на всех 23-х хромосомах человека, характер­ных для гаплоидного набора. В сред­нем на хромосому при этом приходит­ся 50 полос, хотя на некоторых хромо­сомах их можно обнаружить в не­сколько раз больше, чем на других. Гаплоидный геном человека состоит из 3x109 пар нуклеотидов, соответственно каждая полоса содержит в среднем 3x106 нар нуклеотидов, что соответст­вует нескольким сотням генов.

Половой гетерохроматин

В соматических клетках женщин по­ловой хроматин выявляется в виде ге­терохроматина - небольшой хорошо окрашенной округлой структуры, размером 0,8-1,1 мкм, находящейся возле ядерной мембраны (рис. 3.21). Поло­вой хроматин называют также тельцем Барра, т. к. впервые он был описан этим ученым в нейронах кошки. Позже оказалось, что половой гетерохрома­тин присутствует в соматических клетках всех млекопитающих женско­го пола, в том числе и человека. Гомо­логичные половому хроматину струк­туры, так называемые "барабанные па­лочки" были обнаружены в ядрах полиморфноядерных лейкоцитов. Поло­вой гетерохроматин — это одна из Х-хромосом, которая находится в не­активном, суперснирализованном со­стоянии. Известно, что фенотипически пол у человека определяется нали­чием или отсутствием Y-хромосомы, а не количеством Х-хромосом. Если в кариотипе зиготы присутствует хотя бы одна Y-хромосома, а количество Х-хромосом превышает единицу, то по фенотипу формируется мужчина

Ко­личество телец Барра в клетках всегда на одно меньше, чем число Х-хромо­сом. То есть только одна Х-хромосома в соматических клетках человека, и мужчины, и женщины, всегда находит­ся в активном состоянии. В норме жен­щина имеет две, а мужчина одну Х-хромосому, в связи с чем инактива­ция второй Х-хромосомы у женщин в виде полового гетерохроматина слу­жит механизмом компенсации разли­чий в дозе генов, не оказывающих вли­яния на развитие половых признаков и признаков, сцепленных с Х-хромосомой. Этот же механизм оказался фак­тором, благоприятствующим носите­лям Х-хромосомных анеуплоидий. Ка­кое бы количество Х-хромосом они не несли, генетически активна только од­на. Остальные же Х-хромосомы суще­ствуют в виде факультативного поло­вого гетерохроматина. Поэтому но ко­личеству телец Барра в соматических клетках можно диагносцировать фор­му анеуплоидий. Например, у женщин с кариотином 47, XXX обнаруживают­ся два тельца Барра, а с кариотипом 45, ХО — ни одного. У мужчин с кариоти­пом XXY — одно.

Образование полового хроматина из Х-хромосомы происходит на ранних стадиях эмбрионального развития. Дробящаяся "женская" зигота млеко­питающих имеет две функционально активные Х-хромосомы. У человека половой хроматин появляется на ста­дии развития зародыша в несколько сотен клеток. В трофобласте Х-хроматин выявлен на 12-й день развития, а в собственно эмбрионе — на 16-й день. Половой хроматин образуется сразу во всех клетках эмбриона. В настоящее время наиболее приемлемой является гипотеза, согласно которой в разных клетках одного организма могут быть инактивнрованы разные Х-хромосо­мы: в одних — отцовская, в других — материнская. То есть по Х-хромосоме женщины мозаичны. Это положение можно рассмотреть на примере актив­ности фермента глюкозо-6-фосфат дегидрогеназы (Г6ФД), ген которого на­ходится в Х-хромосоме. Женщины имеют два аллеля этого гена, а мужчи­ны только один. Тем не менее средний уровень активности этого фермента сходен у представителей обоих полов, следовательно, должен действовать механизм дозовой компенсации. У ге­терозиготных женщин с помощью эле­ктрофореза в разных клетках можно выявить два аллеля Г6ФД. В ряде ра­бот на эритроцитах in vivo и на фибробластах соединительной ткани в клеточных культурах у женщин был выявлен мозаицизм по Г6ФД.

Тельца Барра присутствуют не во всех клетках женщины. Так, обе Х-хромосомы активны в ооцитах и в клетках женской половой системы.