рефераты конспекты курсовые дипломные лекции шпоры

Реферат Курсовая Конспект

Техника эксперимента в ТСХ

Техника эксперимента в ТСХ - раздел Полиграфия, Хроматографические методы. Общая характеристика методов Активация Пластин.Для Повышения Точности Анализов Рекомендуе...

Активация пластин.Для повышения точности анализов рекомендуется проводить активацию пластин. Это связано с тем, что адсорбционная способность силикагеля и оксида алюминия уменьшается с возрастанием содержания воды и зависит от условий хранения пластин. Для активации в хроматографическую камеру наливают ацетон или 10% раствор аммиака. Пластину помещают в камеру и накрывают крышкой. Фронт растворителя должен достичь ее верхнего края. После этого пластину с помощью пинцета (необходимо избегать прикосновения руками к слою сорбента) извлекают из хроматографической камеры и выдерживают в сушильном шкафу при температуре 100°С в течение 1 ч. Режим сушки должен быть таким, чтобы в слое адсорбента не образовалось трещин. Активированные пластины хранят в эксикаторе над осушителем (прокаленный CaCl2 или безводный силикагель) или в плотно закрытом герметичном пакете.

Перед активацией в верхнем углу пластины карандашом рисуют стрелку направления движения растворителя, чтобы при хроматографировании оно было таким же, как и при активации пластин.

Приготовление подвижной фазы.В колбу с притертой пробкой при перемешивании добавляют указанные растворители до получения однородного прозрачного раствора. Дозирование компонентов проводят мерным цилиндром. Общий объем элюента составляет около 30-50 мл. Готовить элюент необходимо непосредственно перед анализом. Заблаговременное приготовление элюента не рекомендуется, так как при хранении происходит его частичное испарение, что меняет соотношение растворителей, либо протекают химические реакции (растворы аммиака).

Использовать одну порцию элюента для последовательного проведения нескольких анализов нежелательно по соображениям воспроизводимости. В этом случае приготавливают рассчитанный большой объем элюента и для каждого анализа отбирают от него свежую порцию.

Насыщение хроматографической камеры.Перед хроматографированием необходимо насытить хроматографическую камеру парами растворителей, чтобы не нарушать состав элюента в процессе развития хроматограммы за счет испарения с пластинки и поверхности раствора. Для этого приготовленную смесь растворителей выливают в камеру, накрывают крышкой и выдерживают около 20 мин. Рекомендуется обложить стенки камеры фильтровальной бумагой для быстрого и равномерного насыщения воздуха парами растворителей. Однако в таких камерах трудно получить воспроизводимые результаты, так как по мере поднятия элюента по пластине происходят фронтальное разделение элюента в слое сорбента (полизональная ТСХ), адсорбция и капиллярная конденсация компонентов элюента из паровой фазы на сухую часть пластины и другие процессы.

Нанесение проб.Карандашом, не повреждая слой сорбента, помечают на активированной пластине линию старта на расстоянии 1 см от нижнего края пластины и линию финиша ниже верхнего края пластины. Пробы испытуемого раствора и раствора сравнения наносят на линию старта стеклянным капилляром, осторожно касаясь сорбента. При этом пробы наносят таким образом, чтобы расстояние от места нанесения до левого (раствор сравнения) или правого (испытуемый раствор) края пластины составляло около 1 см. Расстояние между соседними пятнами также должно быть около 1 см. Подобным образом на пластину можно нанести, например, раствор сравнения и 3-4 испытуемых раствора, приготовленных из нескольких различных препаратов, содержащих одно действующее вещество (при массовых анализах).

При нанесении проб надо стремиться получать компактные «стартовые пятна» диаметром до 4-5 мм, что повышает эффективность и четкость разделения. Для этого используется дробное нанесение (по частям) с сушкой пластин до полного испарения растворителя. Пробу можно сконцентрировать в узкую стартовую зону при погружении пластины в растворитель, для которого значения Rf всех компонентов близки к 1, и пропусканием его несколько выше зоны нанесения пробы, после чего элюирование прекращают, а пластину быстро высушивают. Подобную операцию повторяют несколько раз.

Вследствие нанесения чрезмерно большого количества пробы, адсорбционной емкости неподвижной фазы может оказаться недостаточно, и вещество не адсорбируется на носителе в полной мере. При прохождении элюента через стартовое пятно высокой концентрации компоненты пробы просто растворяются в элюенте, а не десорбируются, как в процессе нормального развития хроматограммы. В этом случае, а также при нанесении вещества в виде большого пятна, получаются сильно вытянутые пятна (зоны) в виде «хвостов», что способствует сливанию зон соединений с близкой хроматографической подвижностью в одно большое сильно вытянутое пятно.

Минимальное количество исследуемой пробы лимитируется порогом чувствительности метода проявления пятен на пластине.

Рекомендуется перед началом хроматографирования срезать углы в нижней части пластины на расстоянии 6-8 мм от края под углом 45° для обеспечения равномерного подъема фронта растворителя.

Для предотвращения смешения проб между собой капилляр необходимо тщательно промывать в растворителе не менее 3‑5 раз.

Развитие хроматограммы (хроматографирование).При хроматографировании камера должна находиться на устойчивой поверхности. Пластину с нанесенными пробами помещают с помощью пинцета в хроматографическую камеру, таким образом, чтобы уровень элюента был ниже линии старта. Помещение пластины в камеру необходимо проводить аккуратно и быстро, чтобы не нарушить установившееся при насыщении равновесие. Под действием капиллярных сил элюент перемещается вдоль пластины к линии финиша, увлекая за собой вещества, содержащиеся в пробах. Крышку камеры закрывают и проводят хроматографирование до тех пор, пока фронт растворителя не дойдет до линии финиша. После этого пластину пинцетом вынимают из камеры и помещают в сушильный шкаф для удаления растворителя.

Проявление хроматограммы (детектирование пятен).Многие органические вещества образуют невидимые зоны, поэтому для их обнаружения хроматограмму обрабатывают растворами органических и неорганических реагентов-проявителей (табл. 2).

Цветные реакции в ТСХ используются чрезвычайно широко. Они служат для определения местоположения разделенных компонентов, установления класса веществ, а также для идентификации (при наличии индивидуальных реакций). При совпадении всех качественных реакций и полученных значений Rf вещества в трех различных системах с литературными данными, вещество идентифицировано.

Пятна анализируемых веществ на поверхности пластины можно увидеть и при ее облучении УФ-светом. Высушенную пластину помещают в облучатель хроматографический УФС-254/365 и рассматривают пятна веществ в свете УФ-лампы при 254 или 365 нм.

Сорбент обычно содержит флуоресцентные индикаторы (силикаты цинка, сульфиды цинка или кадмия, вольфраматы щелочноземельных металлов), и пластина при УФ-облучении 254 нм светится бледно-голубым светом. В присутствии веществ, способных поглощать УФ-излучение (ароматические и содержащие сопряженные С=С-связи соединения), происходит ингибирование флуоресценции, и эти соединения проступают в виде темных пятен. При длинноволновом УФ-излучении с длиной волны 365 нм разделенные вещества на пластинах флюоресцируют яркими пятнами, часто разного цвета, на темном фоне. Чувствительность детектирования в таком свете увеличивается с ростом интенсивности облучения.

 

Таблица 1.

Проявление пятен веществ на хроматограммах

 

Реагент Тип соединений Приготовление и визуальный эффект
Пары иода (I2) Соединения различных типов Камера с парами йода. Соединения проявляются в виде коричневых пятен.
H2SO4 (50-98% р-р) Соединения различных типов Пластинки нагревают при 100-150оС. Соединения проявляются в виде черных пятен.
Смесь H2SO4 / K2Cr2O7 Соединения различных типов Хромовая смесь или 8% раствор бихромата в 45% H2SO4. Соединения проявляются в виде черных пятен. Аналогично действует 7% раствор HNO3 в H2SO4.
УФ-излучение (250-400 нм) Флуоресцирующие соединения Флуоресцирующие пятна на нейтральном фоне.
2',7’-Дихлор-(или дибром)-флуоресцеин (0,2% раствор в 90% EtOH) Липиды и липофильные соединения УФ-излучение (254 нм) обнаруживает желтые флуоресцирующие пятна на темном фоне.
Флуоресцеин (0,04% водный раствор Na-соли) Системы с сопряженными связями УФ-излучение обнаруживает желтые пятна на розовом фоне.
Индикаторные красители Карбоновые кислоты 0,1-0,5% растворы красителей (бромкрезолового зеленого или фиолетового, бромфенолового или бромтимолового голубого) в этаноле слегка подщелачивают. Желтые пятна на зеленом, фиолетовом или голубом фоне.
FeCl3 (1% вод-ный раствор) Фенолы, енолы Проявляются пятна различных цветов
Фосфорно-мо-либденовая кислота (5% спиртовой раствор) Соединения различных типов После нагревания пластинки в токе горячего воздуха проявляются темно-синие пятна на светло-желтом фоне.
KMnO4 (3% водный раствор) Фенолы, енолы, ненасыщенные соединения После обработки пластинки раствором KMnO4 и удаления избытка реагента в токе воды остаются бурые пятна на белом фоне
Нингидрин Аминокислоты, аминосахара, аминофосфатиды 0,3% раствор в бутан-1-оле, содержащий 3% уксусной кислоты. После нагревания (125оС, 10 минут) проявляются голубые пятна
2,4-Динитро-фенилгидразин Альдегиды, кетоны 0,5% раствор в 2 н. HCl. Проявляются пятна от красного до желтого цвета.
Анисовый альдегид Углеводы 0,5 мл в 0,5 мл конц. H2SO4 + 9 мл 95% этанола + несколько капель HOAc. Обработанную пластинку нагревают при 100-110оС 20-30 минут. Проявляются голубые пятна

После высушивания пластинки ТСХ проявление пятен окисляющихся веществ проводят с помощью раствора KMnO4. Пятна также проявляются при взаимодействии с парами йода. В этом случае пластину кладут в чашку Петри с йодом или в сосуд со смесью силикагеля и йода и оставляют на некоторое время до момента, когда соединения начнут проявляться в виде коричневых пятен. Проявление фосфорномолибденовой кислотой проводят путем опускания пластинки в спиртовой раствор реагента с последующим высушиванием и прогреванием в токе горячего воздуха до появления окрашенных пятен.

Преимуществом ТСХ по сравнению с бумажной хроматографией является возможность использования агрессивных реагентов для проявления пятен (например, серной кислоты).

После проявления хроматограммы необходимо обозначить карандашом положение линии фронта растворителя и пятен. Качество хроматографирования определяет отсутствие «хвостов» разделяемых веществ или перекрытие их пятен, правильная форма и размеры пятен, отсутствие слияния хроматографических дорожек и т.д. При необходимости хроматограмму зарисовывают, фиксируют цвет, форму и размер пятен анализируемых веществ, а также рассчитывают величины Rf компонентов. Если пятно, полученное от испытуемого раствора, находится на одном уровне с пятном от раствора сравнения, это с высокой вероятностью означает, что данные растворы содержат одно и то же действующее вещество и это свидетельствует об обнаружении испытуемого вещества. Если же пятно от испытуемого раствора значительно отличается по положению от пятна раствора сравнения или вообще отсутствует, то это говорит об отсутствии испытуемого вещества.

 

– Конец работы –

Эта тема принадлежит разделу:

Хроматографические методы. Общая характеристика методов

Хроматографические методы Общая характеристика методов.. Характеристики хроматографического разделения компонентов анализируемой.. Основные закономерности сорбционных процессов..

Если Вам нужно дополнительный материал на эту тему, или Вы не нашли то, что искали, рекомендуем воспользоваться поиском по нашей базе работ: Техника эксперимента в ТСХ

Что будем делать с полученным материалом:

Если этот материал оказался полезным ля Вас, Вы можете сохранить его на свою страничку в социальных сетях:

Все темы данного раздела:

ХРОМАТОГРАФИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ
Абсолютое большинство веществ живой и неживой природы и синтетических веществ, используемых в производстве самых разнообразных продуктов питания и непродовольственных товаров, представляют собой не

Компонентов анализируемой смеси
Результатом хроматографического разделения исследуемой пробы является хроматограмма. Различают внутреннюю и внешнюю хроматограммы. Внутренняя хроматограмма – это распределение разделен

Изотермы адсорбции
Изотермой адсорбции называется количественная зависимость между величиной адсорбции и равновесной концентрацией адсорбируемого вещества. В общем виде уравнение изотермы адсорбции записывае

Изотермы адсорбции и форма фронтов зон
Рассмотрим вопросы применения теории адсорбции к описанию хроматографических разделений. Основными задачами теории адсорбции в приложении к хроматографии являются получение ответов на д

Газовая хроматография
Газовая хроматография - метод разделения летучих соединений. Поскольку в процессе разделения анализируемые вещества должны находиться в газообразном состоянии, что достигается

Подвижная фаза. Характеристика основных представителей
При выборе газа-носителя следует учитывать, что природа газа-носителя оказывает влияние как на характеристики разделения компонентов анализируемой смеси в хроматографической колонке, так и на парам

Значения инкрементов функциональных групп и связей
Группа/связь ОМЧ-инкремент - СН2 - ОН = СН – ОН

Величины относительных молярных поправочных коэффициентов
бензол 1.00 метанол 2.46 метан 1.23 этанол 1.77

Величины относительных коэффициентов захвата электронов
Класс соединений Кэз Примеры алканы, алкены, алкины, алифатические эфиры и диены 0.01

Фотоионизационный детектор (ДФИ)
Детектор был предложен в 1968 г., имел нестабильные характеристики и почти не применялся. В конце 70-х начале 80-х годов началась новая эра в развитии ДФИ, связанная, главным образом, с его примене

Силы дисперсионного взаимодействия
Энергия дисперсионного взаимодействия двух сферических частиц описывается уравнением Лондона: , (84) где k - коэффициент пропорциональности, зависящий от потенциала ионизац

Силы ориентационного взаимодействия
Наконец, для двух частиц, обладающих дипольными моментами, возникает ориентационное взаимодействие, энергия которого описывается уравнением: . (87) Под взаимодействующими частицам

Силы полухимического и химического взаимодействий
Еще более прочные адсорбционные связи полухимического характера образуются либо при возникновении водородных связей, либо за счет образования комплексов переноса заряда. Образование водоро

Углеродные адсорбенты
Основными представителями этой группы адсорбентов являются: · графитированная термическая сажа; · активированный уголь; · углеродные молекулярные сита;

Оксид алюминия
Оксид алюминия является весьма термостойким и механически прочным адсорбентом; его удельная поверхность составляет около 200 м2/г. Из-за наличия кислотных и основных (по Льюису)

Органические сорбенты
Наибольшее применение получили пористые сополимеры стирола и дивинилбензола. Эти материалы получают суспензионной полимеризацией мономерных винильных производных (стирола, этилбензола), к которым д

Диатомовые носители
Исходным материалом для носителей служит светло-серое или красновато-коричневое аморфное вещество, представляющее собой обломки панцирей микроскопических диатомовых водорослей – диатомит.

Шкала относительной полярности неподвижных жидких фаз
Неподвижная фаза Р Неподвижная фаза Р сквалан диэтилоксалат

Неароматические углеводороды
Неароматические углеводороды, будучи неполярными, являются очень хорошими растворителями для всех анализируемых веществ углеводородного типа. На этих неподвижных фазах алканы обладают большими (по

Силиконы
Диметил- и метилфенилполисилоксаны относятся к числу наиболее часто применяемых неподвижных жидких фаз. Это объясняется несколькими причинами. Силиконы можно применять как при очень низких (

Фенилсиликоны
Наличие фенильных групп в фенилсиликонах приводит к усилению взаимодействия с ароматическими соединениями. Несколько более высокие величины удерживания характерны для полярных соединений. Отличие о

Спирты, эфиры и производные углеводов
Алифатические углеводороды очень плохо растворяются в неподвижных фазах такого типа и поэтому селективно отделяются от других органических соединений. Однако разделение самих гомологов парафинов не

Полигликоли
Эти неподвижные фазы плохо растворяют алифатические углеводороды, но обладают некоторой селективностью для отделения н-парафинов от изопарафинов и насыщенных углеводородов от ненасыщенных. Селектив

Сложные эфиры
Эфиры карбоновых и фосфорных кислот содержат в карбоксильных и фосфатных группах атомы кислорода, способные к образованию водородной связи. Поэтому при применении эфирных неподвижных фаз наблюдаютс

Жидкостная хроматография
Жидкостная хроматография - это метод разделения и анализа сложных смесей веществ, в котором подвижной фазой служит жидкость. Он применим для разделения более широкого круга

Характеристики растворителей, используемых в жидкостной хроматографии
Растворитель Индекс полярности Элюирующая сила (SiO2) Коротковолновая граница прозрачности Фторал

Способы борьбы с пульсациями.
1. Применение демпфирующих устройств. Это спиральные трубки специального профиля из нержавеющей стали, включенные последовательно или параллельно в систему между насосом и дозатором

Сверхкритическая флюидная хроматография
  В сверхкритической флюидной хроматографии (СФХ) подвижной фазой служит сверхкритический флюид – вещество, находящееся в сверхкритическом состоянии и имеющее показатели, промежуточны

Важнейшие характеристики газов, сверхкритических флюидов и жидкостей
Характеристика Газы Сверхкритические флюиды Жидкости Плотность, г/см3 0,6 10–3

Критические величины для подвижных фаз в СФХ
Флюид Температура Тс, оС Давление рс, Па Плотность dc, г/см

Принятые термины и сокращения
Время миграции (tм) - время, необходимое компоненту для прохождения им эффективной длины капилляра (Lэфф) от зоны ввода пробы (начала капилляра)

Физико-химические основы метода капиллярного электрофореза
Метод КЭ основан на разделении заряженных компонентов сложной смеси в кварцевом капилляре под действием приложенного электрического поля. Микрообъем анализируемого раствора

Капилляры
В системах КЭ используют капилляры из кварца, прозрачного в УФ-области спектра, с внешним полиимидным защитным покрытием. В случае детектирования внутри капилляра (on-line)

Источники высокого напряжения
Источники напряжения обеспечивают подачу постоянного напряжения в диапазоне от –25 до +25 кВ. Максимально допустимый ток в капилляре не должен превышать 200 мкА. В отношении ве

Ввод пробы
Типичный объем вводимой пробы в КЭ составляет 1–20 нл. Общепринято заполнять пробой не более 2 % объема капилляра, чтобы изначально не создавать широкую зону компонентов и обеспечить достаточное вр

Детекторы
Характеристики методов детектирования, используемых в КЭ, представлены в табл. 2. Указанные пределы детектирования позволяют оценить чувствительность того и

Чувствительность метода
Основным способом детектирования в КЭ является фотометрический, чувствительность которого не всегда достаточна, поскольку детектирование происходит в слое малого внутреннего

Качественный и количественный анализ
Для качественного и количественного анализа в КЭ обязательно проводят градуировку системы путем анализа нескольких смесей известного состава. Результатом градуировки являютс

Количественная обработка результатов анализа
Для количественного определения необходимо выбрать метод градуировки (внешнего стандарта (абсолютной градуировки), внутреннего стандарта

Объекты для анализа методом КЭ. Подготовка пробы
Первые аналитические приложения КЭ были связаны с разделением заряженных компонентов: наиболее подходящими оказались неорганические катионы и анионы, а также карбоновые кислоты. В биотехнологии КЭ

Особенности методики, практические рекомендации
Здесь будет рассмотрен вариант одновременного определения ряда катионов и анионов с использованием прибора «Капель-103РЕ». Для определения к

Количественный анализ
Количественная интерпретация хроматограмм является одним из наиболее ответственных заключительных этапов хроматографического анализа. Задачами количественной интерпретации хроматогр

Параметр h
Если проанализировать влияние возможных отклонений температуры колонки и скорости потока газа-носителя от средних значений, соизмеримых по длительности с продолжительностью регистрации пика на усто

Параметр hl
Влияние изменения условий процесса хроматографического разделения на параметр hl сказываются следующим образом: · флуктуации температуры при работе с обоими видами детекторов

Параметр А
Влияние изменения условий хроматографических разделений на параметр А (площадь пика) сводятся к следующему: · флуктуации температуры не искажают площадь пика при работе с дет

Методы триангуляции
Пик рассматривают как треугольник и площадь его рассчитывают как площадь треугольника. Известны три метода триангуляции (triangle – треугольник). Эти методы приближенные, поскольку площадь пика апп

Хотите получать на электронную почту самые свежие новости?
Education Insider Sample
Подпишитесь на Нашу рассылку
Наша политика приватности обеспечивает 100% безопасность и анонимность Ваших E-Mail
Реклама
Соответствующий теме материал
  • Похожее
  • Популярное
  • Облако тегов
  • Здесь
  • Временно
  • Пусто
Теги