Этапы ДНК-диагностики с использованием полимеразной цепной реакции - раздел Медицина, Курс клинической генетики 1. Получение Материала Для Исследования.Длямолекулярно-Генет...
1. Получение материала для исследования.Длямолекулярно-генетической диагностики используют любые ядросодержащие клетки. Для диагностики наследственного заболевания чаще берут кровь (лейкоциты), реже смывы из полости рта, волосяные фолликулы. Для пренатальной диагностики проводят хориоцентез (получение ворсинчатой оболочки-хориона). плацентоцентез (получение ткани плаценты), амниоцентез (получение амниотической жидкости и выделение из нее клеток), кордоцентез (получение пуповинной крови). Для судебной медицины любые ткани (пятна крови, кожа, сперма и др.), для установления родства с помощью методов геномной дактилоскопии кровь. Для диагностики инфекционных заболеваний –соскобы из влагалища, уретры, бронхолегочные смывы, культуры возбудителей. Для диагностики онкологических заболеваний - красный костный мозг (при лейкозах) и др.
2. Выделение ДНК.Для исследования методом ПЦР пригодны даже небольшие фрагменты слабоочищенной ДНК. Как правило, ДНК из биологического материала при этом выделяют методами лизиса клеток с последующей очисткой от белковых компонентов.
Полимеразная цепная реакция (ПЦР) позволяет избирательно амплифицировать (многократно редуплицировать) интересующий исследователя участок ДНК в миллионы раз. Принцип ПЦР основан на амплификации ДНК с помощью фермента ДНК-полимеразы, осуществляющей синтез взаимно комплементарных цепей ДНК, начиная с двух олигонуклеотидных праймеров (затравок) -прямого и обратного. Праймеры – это фрагменты ДНК, комплементарные противоположным цепям ДНК в участках, ограничивающих выбранную область ДНК, и ориентированы 3'-концами навстречу друг другу в сторону той последовательности, которую необходимо амплифицировать. Таким образом, синтез новой цепи может идти только в одном направлении - начиная с 3'-конца в направлении встречного праймера. Во многом процесс амплификации сходен с редупликацией ДНК в ядре клетки. В реакционной смеси должны присутствовать:
1) матрица - исходная цепь изучаемой ДНК, по образцу которой и происходит синтез новых фрагментов,
2) нуклеотиды - "строительный материал" для наращивания вновь синтезируемых цепей ДНК,
3) фермент ДНК-полимераза, катализирующий процесс синтеза ДНК (в настоящее время используется термостабильная полимераза, выделенная из бактерий горячих источников с оптимумом работы при температуре 72 градуса) и
4) олигонуклеотидные праймеры.
Проведение реакции осуществляется в специальной буферной смеси с определенными концентрациями ионов калия, хлора и точным значением рН.
Смесь ставят в специальный прибор – амплификатор. В нем автоматически происходит смена температур, необходимых для реакции. В результате чего происходит многократная редупликация участка ДНК, который мы хотим выделить. В итоге число копий ДНК увеличивается в миллионы раз.
Полимеразная цепная реакция проходит циклически. Каждый цикл имеет три фазы:
1) Денатурация или плавление – смесь нагревают до 90 –95 градусов. При этом происходит разрыв водородных связей, соединяющих две цепи ДНК.
2) Отжиг – смесь охлаждают, праймеры соединяются с комплементарными участками ДНК.
3) Синтез – смесь вновь нагревают до 72 градусов, начинает работать термостабильная ДНК – полимераза и синтезируется дочерняя цепь ДНК. ДНК-полимераза достраивает нить нуклеотидов комплементарно матричной ДНК. При этом праймер включается в состав вновь синтезируемого участка нуклеиновой кислоты.
ДНК 1 фаза 2 фаза 3 фаза
праймер
С помощью ПЦР можно решать следующие задачи:
1) Амплификация желаемого участка ДНК, даже если анализируемый препарат недостаточно очищен или представляет собой сложную смесь молекул. Именно такими препаратами являются образцы крови, мочи, экссудатов, мокроты и других сред организма, а также бактериальные культуры.
Амплификация ДНК, присутствующей в образце в ничтожно малых количествах. По сути, в качестве стартового материала для ПЦР (как видно из схемы на рис.1) достаточно взять не только одну клетку, но и одну молекулу. Это важно при исследовании проб воздуха, воды и т.д. на наличие патогенных возбудителей заболеваний.
К настоящему времени разработано большое количество разновидностей ПЦР, среди которых практическое значение в ДНК –диагностике имеют:
1. Специфическая ПЦР с парой праймеров, применяемая для идентификации возбудителей заболеваний, диагностики наследственных болезней;
2. ПЦР-генотипирование с праймерами, выявляющими генетическую гетерогенность исследуемых организмов, применяемая в судебной медицине, в диагностике наследственных болезней.
Существуют специальные способы проведения ПЦР, позволяющие изучать не только ДНК, но и РНК. Это важно, например, при исследовании РНК-содержащих вирусов (ретровирусы, в том числе ВИЧ, вирус гепатита С, гриппа А и другие), а также при анализе экспрессии различных генов в организме. Подобные методики обычно включают в себя два этапа: обратную транскрипцию и ПЦР на матрице полученной ДНК.
4. Электрофорез фрагментов в ДНК в геле. В гель добавляют бромистый этидий (краска, которая окрашивает ДНК). Фрагменты ДНК перемещаются на определенное расстояние. Участок геля, в котором будут находиться фрагменты ДНК окрасится краской. Одновременно проводят электрофорез контрольных фрагментов.
5. Анализ полученных результатов. Участки геля, в которых находятся фрагменты ДНК, будут давать оранжевое свечение при ультрафиолетовом освещении Совпадение полос контрольного фрагмента и опытного позволят диагностировать наличие искомого гена. Гель можно сфотографировать или его изображение перенести на экран компьютера.
Все темы данного раздела:
Медицинского факультета
Одесса –2000
Введение
Быстрое развитие медицинской науки в конце ХХ века привело к тому, что в структуре заболеваемости населения на первый план вы
Тема 1.
Классификация и симптоматика наследственных болезней. Организация медико-генетической помощи населению.
Цель занятия: Приобрести практичес
Задачи медико-генетического консультирования.
Медико-генетическое консультирование - один из видов специализированной медицинской помощи населению, направленной главным образом на предупреждение появления в семье больных с наследственной патол
Синдромологический диагноз в клинической генетике.
Наследственные заболевания являются следствием изменения генотипа, т.е. мутации. Мутации вызывают либо нарушение эмбрионального развития, либо нарушение определенного звена обмена веществ. У разных
Наследственной болезни.
Особенностью клинической генетики является то, что объектом исследования является не отдельный больной, а семья. Сбор сведений о семье начинается с пробанда. Пробандом называется че
Описание фенотипа больного с наследственной патологией.
Фенотип-это совокупность внешних и внутренних признаков организма.
При описании фенотипа больного обращают внимание на пороки развития и микроаномалии развития.
Вр
Краткий перечень основных микроаномалий и пороков развития.
1. Голова, лицо, шея.
а) Изменение размеров больше чем на 10% от возрастной нормы (5 см) - микроцефалия (-5 см) или макроцефалия (+5 см).
Гидроцефалия (водянка го
Симптомы наследственной и врожденной патологии при объективном обследовании больного.
При объективном обследовании больного необходимо обращать внимание на следующие симптомы, которые могут указывать на наследственную или врожденную патологию.
У новорожденных.
Основные генетические термины.
Ген – участок ДНК, в котором закодирована информация о первичной структуре одного белка.
Генотип – система всех генов организма, содержащихся в диплоидном
Тесты для проверки конечного уровня знаний.
1. Выберите один наиболее правильный ответ.
Медицинская генетика изучает:
А) клинические особенности наследственных болезней;
Б) этиологию, патогенез
Дополнительная
1). Н.П.Бочков. Клиническая генетика. – М. Медицина, 1997. – 288с.ил. – С.23 – 26, 30 – 43,
2). Педиатрия: пер. с англ./Гл. ред. Н.Н.Володин – М.: ГЭОТАР, 1996. – С. 205 – 240.
3)
Основные теоретические сведения
Клинико-генеалогический метод основан на составлении и анализе родословной семьи. Это обязательный этап в обследовании больного с наследственной патологией. Синоним слова "родо
Сцепленное с полом наследование.
У человека не описаны заболевания, которые наследуются сцеплено с У=хромосомой (ихтиоз – "кожа дикобраза" – сцепление с У-хромосомой оспаривается многими генетиками). Поэтому, говоря о сц
Доминантное сцепленое с Х-хромосомой наследование.
1) Женщины болеют в 2 раза чаще, чем мужчины.
2) Если больная мать – гетерозиготная носительница патологического гена (ХАХа), то признак наследуют 50% дочерей и сыновей. Мать гетерозиг
У-сцепленый тип наследования.
В У-хромосоме находятся гены, контролирующие сперматогенез, рост тела, конечностей и зубов, оволосение ушной раковины и др. Признак наследуется от отца к сыну (голандрические признаки).
&n
Тесты для контроля конечного уровня знаний
Может быть один или несколько правильных ответов.
1. Сибсы – это:
а) родители пробанда;
б) дети пробанда;
в) братья пробанда;
г) сестры пробанда;
Хромосомные болезни
Цель занятия: изучить этиологию, клинику, диагностику, ведение и подход к лечению больных с наиболее распространенными хромосомными болезнями. Уметь при сборе анамнеза и обследов
Практическая работа.
1. Обследовать больного с хромосомной болезнью, выявить характерные признаки, сформулировать предположительный диагноз, составить план обследования больного.
2. Проанализировать по фотогр
Этиология хромосомных заболеваний.
В этиологии хромосомных заболеваний выделяют геномные и хромосомные мутации. К геномным мутациям относятся изменения числа хромосом. Различают полиплоидии и анеуплоидии (гетероплоидии). Изменение
Геномные мутации.
Геномные мутации - это изменение числа хромосом. Различают два вида геномных мутаций:
1) полиплоидию,
2) гетероплоидию (анеуплоидию).
Полиплоидия– увелич
Норма (2n) ХХ ХХ ХХ
1 2 3
Мы видим по две хромосомы каждой пары в гипотетической клетке с 6 хромосомами или 3 парами.
а) Моносомия - отсутствие одной хромосомы (2n-1)
ХХ ХХ Х-
1 2 3
Причины формирования геномных мутаций.
1) Наиболее важным механизмом является нерасхождение хромосом при митозе или мейозе. Хромосомы, которые в норме должны разделиться во время клеточного деления, остаются соединенными вместе и в ан
У мужчин у женщин
Нерасхождение 21 хромосомы при мейозе у женщины.
Запись нормального и измененного кариотипа человека.
В 1971г. на Парижской конференции была утверждена специальная номенклатура записи кариотипа человека.
Нормальный кариотип человека:
46,ХХ - женщина; 46, ХУ - мужчина.
Патогенез хромосомных болезней.
При хромосомных болезнях, как правило, наблюдается дисбаланс по большому количеству генов. Измененный генотип проявляется в эмбриональном периоде развития. Самые ранние этапы дробления зиготы контр
КЛИНИКО-ЦИТОГЕНЕТИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА НАИБОЛЕЕ РАСПРОСТРАНЕННЫХ ХРОМОСОМНЫХ БОЛЕЗНЕЙ
ХБ проявляются как синдромы множественных врожденных пороков развития. Для ХБ характерны общие симптомы:
Общие признаки:
В ПЕРИОД БЕРЕМЕННОСТИ.
1. Угрозы
Минимальные диагностические признаки: микроцефалия, полидактилия, расщелина губы и неба, трисомия 13 хромосомы.
Популяционная частота синдрома Патау 1: 7800.
Синдром Патау встречается в основном в двух цитогенетических вариантах: в виде простой трисомии и робертсоновских транслокаций Д/13, фенотипи
Синдром трипло-Х, трисомия Х, тетрасомия Х, пентасомия X/.
Трисомия Х впервые описана в 1959 г. у женщин с кариотипом 47,ХХХ. Частота патологии 1:1000 - 1:1200 девочек. Среди женщин с умственной отсталостью синдром встречается более чем в 1 %.
Тет
Диагностика хромосомных заболеваний
Для подтверждения (или установления) диагноза хромосомной болезни используют цитогенетические методы. Наибольшее значение имеют:
1. Метод кариотипирования.
2. Метод определения по
Показания для кариотипирования.
1. Дети с фенотипом, характерным для определенного хромосомного заболевания.
2. Дети с множественными врожденными пороками развития или с признаками дизморфии, этиология ко
Медико-генетическое консультирование.
Расчет риска при хромосомных заболеваниях зависит от кариотипа родителей. Можно рассмотреть следующие случаи.
1. У родителей нормальный кариотип. В этом случае риск для с
Тесты для самоконтроля.
1. Выберите два правильных ответа.
Какие мутации относятся к геномным:
А) инверсии, транслокации, дупликации, делеции;
Б) полиплоидии, анеуплоидии;
Моногенные болезни и синдромы
Цель занятия: Знать этиологию, патогенез, классификацию, диагностику, принципы лечения моногенных болезней и синдромов. Уметь выявить при сборе анамнеза и обследовании боль
Основные теоретические сведения.
Моногенные болезни – это болезни, обусловленные мутацией одного гена. В генотипе человека 100000 генов (10 5). Моногенные болезни могут возникнуть в результате мутации приблизительно 30
С учетом типа наследования
Общая характеристика моногенных болезней
1). Варьирующий возраст начала – от внутриутробного до пожилого. Большая часть патологических мутаций проявляется внутриутробно (до 25%) и диагностируются у новорожденного, ещё 45% - до 3 лет. В пу
Аутосомно – доминантные заболевания
Болезнь кодируется доминантным генном А, норма а. Генотип больного Аа или (редко) АА. Здоровые имеют
Ахондроплазия
Популяционная частота 1: 100 000 соотношение полов МІ:ЖІ; 80%-95% случаев обусловлены новыми мутациями. Характерными признаками являются: низкий рост (при рождении 46 или 48, у взрослых 120-130 см.
Синдром Марфана
Популяционная частота 1:10000 – 1:15000, соотношение полов МІ : ЖІ; около 75% больных с синдромом Марфана имеют больных родителей, 25% являются первыми больными ( результат новой мутации).
Моногенные болезни и синдромы с аутосомно-доминантным типом наследования
Название синдромов или болезней
Частота в популяции
Локализация гена
Минимальные диагностические признаки
Апера синдром
Аутосомно-рецесивные заболевания
Заболевание кодируется рецессивным геном а, норма – доминантным А. Больные имеют генотип аа, здоровые – АА и
Общие симптомы наследственных нарушений обмена веществ.
А) Данные анамнеза.
1. В семейном анамнезе смерть детей в раннем возрасте.
2. Нормальное течение настоящей беременности. Дети, как правило, рождаются доношенными и здоровым
Фенилкетонурия
Популяционная частота 1:8000 – 1:6000. Частота фенилкетонурии в г. Одессе 1:6793. Соотношение полов МІ: ЖІ.
В основе классической фенилкетонурии лежит блок фермента фенилаланингидроксилазы
Что такое болезни накопления?
Это группа ферментопатий, при которых нарушается катаболизм высокомолекулярных соединений. Нерасщепившиеся вещества откладываются в клетках и межклеточном веществе разных тканей и органов.
Сцепленное с Х-хромосомой наследование.
Если ген находится в Х или У хромосоме, то наследование называется сцепленным сполом.
Сцепленные с Х-хромосомой гены могут быть доминантными и рецессивными. Рецессивные сцепленные с Х-хром
Диагностика моногенных болезней.
Могут использоваться следующие методы:
1). Портретная диагностика – для диагностики моногенных синдромов, проявляющихся пороками развития.
2). Биохимические методы – для диагности
Пренатальная диагностика моногенных болезней и синдромов.
Для пренатальной диагностике могут использовать следующие методы.
1). УЗИ – для диагностики пороков развития. Оптимальные сроки для скрининговых исследований 1-й раз в 16-18 недель, 2-й ра
Тесты для самоконтроля.
(возможен один идли несколько правильных ответьов)
1.
Укажите вероятность повторного рождения больного ребенка у супругов, иемющих больную девочку с фенилкет
Методы ДНК – диагностики.
Цель занятия: знать принципы ДНК- диагностики и использование метода для диагностики наследственных заболеваний, инфекционных заболеваний, в судебной медицине и онкологии .
Основные теоретические сведения.
Если век XIX по праву вошел в историю мировой цивилизации как Век Физики, то век XX, по всей вероятности, будет назван Веком Биологии, а может быть и Веком Генетики.
С 1900 г. – года офици
Строение и функции ДНК.
ДНК – это полимер, мономером которого являются нуклеотиды (адениловый – А, тимидиловый – Т, гуаниловый – Г, цитидиловый – Ц). Каждый нуклеотид состоит из остатка фосфорной кислоты, моносахарида дез
Строение и функции РНК.
РНК – это тоже полимер, состоящий из нуклеотидов.
Отличия РНК от ДНК:
1) состоит из одной полинуклеотидной цепи;
2) в состав нуклеотида входит рибоза;
3) вместо
Ген, генетический код и его свойства.
Ген, как уже указано выше, - участок ДНК, в котором закодирована информация о строении одного белка. Если белок имеет четвертичную структуру и состоит из нескольких полипептидов, то ген будет кодир
Структурные регуляторные
Что такое геном и генотип? Характеристика генома человека.
У человека и других организмов можно выделить два типа клеток: половые (яйцеклетка и сперматозоид) и соматические (т.е. неполовые – эпителиальные, мышечные и т.д.). Половые клетки содержат гаплоидн
Программа «Геном человека».
В 1990 г. молекулярно – генетические лаборатории США, Западной Европы, России и Японии приступили к осуществлению Международной программы «Геном человека».
Программа включает три направлен
Каталог генов и генных болезней В.Мак-Кьюсика.
Более 30 лет под руководством Виктора Мак-Кьюсика (проф. Университета Джона Хопкинса в Балтиморе) собирают информацию обо всех картированных генах человека и связанных с ними наследственных заболев
Молекулярно-генетические методы. Использование в медицине.
Молекулярно-генетические методы (методы ДНК –диагностики) – это большая и разнообразная группа методов, предназначенная для выявления вариаций в структуре исследуемого участка ДНК.
Идентификация возбудителей инфекционных заболеваний с помощью ПЦР.
Для выявления и идентификации возбудителя используется специфическая для каждого вида пара праймеров. При наличии ДНК возбудителя в исследуемой пробе происходит амплификация определенного фрагмента
Принципы геномной дактилоскопии
Геномная дактилоскопия основана на анализе вариабильных участков ДНК. Вариабильные участки ДНК имеют разную длину у разных людей, т.к он может иметь разное количество копий относительно короткого ф
Тесты для проверки конечного уровня знаний.
(может быть несколько правильных ответов)
1. Участок ДНК, в котором закодирована информация о строении одного белка, называется:
А) триплетом;
Б) ге
Новости и инфо для студентов