Хроматографические методы. Общая характеристика методов

Содержание

1.Хроматографические методы. Общая характеристика методов.

1.1. Характеристики хроматографического разделения компонентов анализируемой смеси

1.2.Основные закономерности сорбционных процессов

1.3. Основные факторы размывания хроматографических пиков

1.4. Теория теоретических тарелок

1.5.Оценка параметров эффективности и селективности хроматографической колонки

1.6. Влияние условий анализа на эффективность разделения

2. Газовая хроматография

2.1. Схема газожидкостного хроматографа

2.2. Характеристика подвижной фазы

2.3. Хроматографические колонки

2.4. Устройства ввода пробы в хроматограф

2.5. Детекторы

2.5.1. Детекторы по теплопроводности

2.5.2. Принципы ионизационного детектирования

2.5.3. Детектор пламенно-ионизационный

2.5.4. Детектор электронного захвата

2.5.5. Термоионный детектор

2.6. Варианты метода газовой хроматографии

2.6.1. Газоадсорбционная хроматография

2.6.2. Газо-жидкостная хроматография

2.6.3. Характеристики носителя неподвижной жидкой фазы и их влияние на эффективность разделения компонентов.

2.6.4. Неподвижные жидкие фазы

2.6.5. Двумерная хроматография

3. Жидкостная хроматография

3.3. Плоскостная хроматография

3.4. Сверхкритическая флюидная хроматография

4. Капиллярный электрофорез

5.Качественный хроматографический анализ

6. Количественный анализ

7. Практическое использование хроматографии в контроле качества продукции

ПРЕДИСЛОВИЕ

Цель данного учебного пособия – облегчить студентам, обучающимся по специальности «Физико-химические методы и приборы контроля качества продукции», овладение основами методов, уже в настоящее время широко используемых в заводских, испытательных и исследовательских лабораториях для контроля качества сырья, готовой продукции и других объектов окружающей среды или очень перспективных для такого применения.

В разделах, посвященных спектральному анализу, изложены общие положения атомной и молекулярной спектроскопии, теоретические и практические аспекты элементного анализа, основанного на использовании методов оптической и рентгеновской атомной спектроскопии, масс-спектрометрии, и люминисцентного анализа, а также методы установления молекулярной структуры вещества ИК-, масс- и ЯМР-спектроскопией.

Практическое применение этих методов как в лабораторной, так и в производственной практике стремительно возрастает. Все более широкое распространение физических и физико-химических методов, в первую очередь, связано с тем, что большинство из них обладает значительно большей (на несколько порядков) чувствительностью по отношению к определяемым компонентам анализируемой продукции по сравнению с химическими методами. Благодаря этому они являются единственно способными обеспечить надежный контроль содержания в пищевых продуктах, например, токсичных элементов, остаточных лекарственных препаратов, пестицидов и других вредных компонентов; содержания и локального распределения по поверхности и толщине допирующих элементов при производстве полупроводниковых материалов и устройств, а также проверить иные самые разнообразные параметры качества продукции различного назначения. Другим преимуществом этих методов является их высокая селективность, благодаря которой при проведении анализа можно одновременно качественно и количественно определить в анализируемой пробе десятки компонентов, что значительно повышает экспрессность анализа, снижает его стоимость и предотвращает возможные потери от выпуска недоброкачественной продукции. У каждого метода существуют и другие преимущества, которые в некоторых случаях приобретают предпочтительное значение.

В настоящее время разработано множество методик контроля качества разнообразых видов продукции, которые основаны на использовании физических и физико-химических методов. Рассмотреть их конкретно практически невозможно, да и не имеет смысла, поскольку каждый новый объект анализа требует конкретизации условий его проведения, что осуществляется, как правило, экспериментальным подбором. Поэтому в данном пособии изложены физические основы различных вариантов газовой и жидкостной хроматографии, разнообразных методов анализа, основанных на оптической, рентгеновской, резонансной, а также масс-спектроскопии; представлены общие данные о способах подготовки проб к анализу, виде получаемой информации и средствах ее аналитической интерпретации. В разделах, посвященных каждому из рассматриваемых методов, приведены блок-схемы соответствующих приборов и описаны функции их основных узлов. В пособии изложены также общие сведения о возможностях применения каждого из методов при контроле качества продукции. Такой подход, по мнению авторов, создаст у будущих специалистов базу для грамотного подбора и использования методов контроля качества продукции при их практической работе.

В разделах, посвященных спектральному анализу, изложены общие положения атомной и молекулярной спектроскопии, теоретические основы и практические аспекты элементного анализа, основанного на использовании методов оптической и рентгеновской атомной спектроскопии, масс-спектроскопии, молекулярной спектроскопии поглощения в УФ- и видимой области, и люминесцентного анализа, а также методы установления молекулярной структуры вещества ИК-, масс- и ЯМР-спектроскопией.

Авторы выражают глубокую признательность рецензентам заведующему кафедрой химии БГПУ имени Максима Танка кандидату химических наук, доценту Ф.Ф.Лахвичу и заведующему кафедрой товароведения непродовольственных товаров БГЭУ кандидату технических наук, доценту Е.В.Перминову за ценные замечания, способствосделанные при рецензировании рукописи.

ВВЕДЕНИЕ

Хроматография - это не наука, а - искусство!

Несколько последних десятилетий можно охарактеризовать как период интенсивного развития и распространения инструментальных методов анализа, в том числе и при осуществлении контроля качества продукции. В первую очередь это относится к хроматографическим и спектральным методам анализа. В настоящее время невозможно представить не использующие эти аналитические методы даже производственные лаборатории, не говоря уже об испытательных.

Это связано, в первую очередь, с усложнением задач, которые стоят перед аналитиками и обусловлены необходимостью обнаруживать и определять все меньшие количества различных веществ, находящихся в анализируемых объектах в большинстве случаев в виде сложных многокомпонентных смесей. Практически только благодаря тому, что аналитические характеристики методик анализа, основанные на использовании различных вариантов хроматографии и спектроскопии, существенно выше аналогичных показателей методик, которые базируются на классических химических методах, решение этих задач является возможным.

Аналитические характеристики проводимых анализов зависят от качества получаемых результатов и качества аналитической системы. Аналитическое качество результатов определяется точностью получаемых результатов – величиной, характеризующей их правильность и воспроизводимость.

Аналитическое качество системы характеризуется:

– числом компонентов (элементов), которые можно определить данным методом;

– долговременной стабильностью;

– селективностью;

– универсальностью;

– чувствительностью (нижним пределом обнаружения);

– диапазоном линейной зависимости аналитического сигнала от содержания определяемого компонента анализируемого вещества.

Широкое распространение инструментальных методов обусловлено и тем, что развитие приборостроения привело к тому, что очень многие приборы стали достаточно доступными не только для проведения научных исследований, но и для рутинного анализа при контроле качества продукции, а их широкая компьютеризация и разработка эффективного программного обеспечения облегчила и ускорила обработку получаемой информации.

Приборы, используемые в различных видах инструментального анализа, становятся все более сложными так же как и программное обеспечение для них. Однако практически любой современный аналитический прибор может быть представлен в виде блоков (модулей), предназначенных:

1) получения физической информации. В спектральных приборах это происходит путем взаимодействия с веществом внешней энергии, в результате чего возникает физическая информация в виде потока испускаемого излучения или потока частиц, в хроматографах - за счет различия в силе взаимодействия между компонентами смеси и компонентами хроматографической системы;

2) извлечения физической информации, состоящего в выделении полезного сигнала из общего объема информации, например, при помощи системы диспергирования электромагнитного излучения по длинам волн или ионного пучка по массам;

3) преобразования физической информации в электрический сигнал (силу тока или напряжение) с использованием, например, детекторов фотонов (фотоумножители, диоды, термические детекторы, мостовые измерительные схемы и т. д.) или детекторов ионов (электронные умножители, электрометры и др.);

4) обработки полученного электрического сигнала при помощи электронных устройств для получения эффективного отношения сигнал/шум и сигнала, который можно обработать с использованием программного обеспечения;

5) преобразования электрического сигнала в аналитическую информацию за счет программного обеспечения (качественный анализ, использование статистической обработки данных для построения градуировочных графиков, расчета пределов обнаружения, воспроизводимости, неопределенности и т. д.);

6) редактирования аналитической информации с использованием компьютера: составление отчета, накопление, хранение информации и ее систематизация и т. п.

Спектр доступных приборов, предназначенных для осуществления того или иного метода контроля, уже в настоящее время достаточно широк. Можно смело прогнозировать расширение в ближайшее время приборного рынка как за счет многофункциональных универсальных приборов, так и за счет специализированных приборов, которые необходимы для проведения серийных рутинных анализов узкого круга объектов. При выборе приборного оснащения следует руководствоваться характеристиками приборов в двух аспектах – с точки зрения удобства их эксплуатации и с точки зрения экономичности.

Высокие эксплуатационные характеристики приборов обеспечивают:

– простота эксплуатации и технического обслуживания;

– возможность использования проб любого типа, находящихся в любом агрегатном состоянии;

– небольшой расход проб;

– возможность автоматизации измерений и обработки получаемой информации;

– небольшие размеры.

Как высокоэкономичные характеризуются приборы, имеющие:

– высокую производительность;

– низкую стоимость;

– высокую безопасность при эксплуатации;

– низкие затраты на эксплуатацию и техническое обслуживание.

Таким образом данное учебного пособия позволит читателям овладеть основами методов, уже в настоящее время широко используемых в заводских, испытательных и исследовательских лабораториях для контроля качества сырья, готовой продукции и других объектов окружающей среды или очень перспективных для такого применения.

ХРОМАТОГРАФИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ

Должное качество продукции достигается, как правило, при достаточно строгом компонентном составе получаемой… Цвет М.С. (1872-1919 г.г.) Особенно большие… Еще более эффективно смеси веществ разделяются, если разделение смеси производить так, чтобы одна из фаз была…

Варианты хроматографии, различающиеся по способу проведения

Способ проведения процесса разделения	Название варианта
в цилиндрическом слое сорбента	колоночная хроматография
в слое сорбента на плоской поверхности	хроматография в тонких слоях
в пленке жидкости, содержащейся в полоске бумаги	хроматография на бумаге
в пленке жидкости или тонком слое адсорбента, размещенном на внутренней стенке капилляра	капиллярная хроматография
в полях электрических, магнитных, центробежных и других сил	хроматография в полях сил

В зависимости от цели хроматографирования выделяют:

– аналитическую;

– препаративную (для получения чистых веществ, концентрирования и выделения микропримесей);

– промышленную (производственную) хроматографию, применяемую для автоматического управления производственным процессом.

По способу получения хроматограмм различают элюентную (проявительную), фронтальную хроматографию и вытеснительную.

Проявительный (элюационный) метод заключается в том, что сорбаты переносятся через сорбционный слой потоком вещества (элюента), сорбирующегося хуже любого из сорбатов. В ходе проявительного анализа разделенные компоненты анализируемой смеси выходят из хроматографической колонки в потоке элюента отдельными зонами, между которыми (при достаточно четком разделении) из колонки выходит чистый элюент. Вид хроматограммы при осуществлении элюентного разделения представлен на рис. 1.1.

Основные преимущества проявительного метода заключаются в

следующем:

1) при выборе соответствующих условий компоненты могут быть, практически полностью, изолированы друг от друга и будут находиться лишь в смеси с элюентом;

2) сорбент непрерывно регенерируется элюентом, поэтому после выхода наиболее сильно сорбирующегося компонента пробы может быть немедленно начато исследование следующей смеси;

3) если концентрация исследуемого компонента соответствует линейному участку изотермы сорбции, то время элюирования компонента при заданных условиях является постоянной величиной, которая может быть использована для целей идентификации.

К недостаткам метода относится необходимость использования значительных количеств элюента.

Проявительный анализ можно проводить как при постоянной температуре (изотермическая хроматография), так и при изменении температуры сорбента в процессе анализа по заданной программе (хроматография с программированием температуры). В последнем случае изменяется сорбционная емкость сорбента.

Фронтальный метод заключается в непрерывном пропускании исследуемой смеси через слой сорбента. При этом на сорбенте образуются зоны, содержащие последовательно увеличивающееся число компонентов, а из колонки вначале выходит порция наименее сорбирующегося вещества, а в конце анализа из кологнки выходит исходная смесь. Фронтальный анализ применялся на ранних стадиях развития хроматографии, когда еще не были достаточно разработаны методы детектирования. В настоящее время он используется редко и практически совсем не применяется для целей количественного анализа. Это объясняется тем, что при фронтальном анализе ни один из компонентов смеси не отделяется полностью от остальных. Если после полного проявления концентрационного профиля при фронтальном анализе прекратить подачу пробы и начать промывку колонки чистой подвижной фазой, то фронтальный анализ превратится в вариант проявительной хроматографии с очень большой пробой.

Кривая элюирования будет повторять в обратном порядке кривую фронтального анализа; последняя ступень будет соответствовать относительно чистому последнему (наиболее сильно удерживаемому) компоненту.

К недостанткам фронтального метода можно отнести необходимость регенерации сорбента после каждого анализа и в результате хроматографирования возможно получить в относительно чистом виде только первый компонент.

Вытеснительный метод заключается в переносе разделяемой смеси потоком вещества (вытеснителя), сорбирующегося сильнее любого из компонентов смеси. В ходе вытеснительного анализа образуются отдельные примыкающие друг к другу зоны компонентов, которые располагаются в порядке увеличения их сорбируемости. Порядок элюирования компонентов характеризует их физико-химические свойства, а ширина полосы (не высота!) пропорциональна концентрации данного компонента.

Вытеснительный анализ как метод разделения имеет весьма ограниченное применение и крайне редко используется в количественном анализе. Это объясняется тем, что в результате описанного процесса неполучается дискретных локальных полос индивидуальных соединений.

Электрохроматография — хроматографический процесс, при котором движение заряженных частиц осуществляется под действием приложенного напряжения. Скорость движения частиц определяется их массой и зарядом.

Т а б л и ц а 4

Области применения различных вариантов хроматографии

молекулярная масса
		10²	10³	10⁴	10⁵	10⁶	10⁷
	газы	жидкости	твердые вещества	полимеры	вирусы	бактерии	частицы
газовая ионообменная полифазная
ионная жидкостная
электрофорез ситовая
разделение в полях гидродинамическая

Характеристики хроматографического разделения

Компонентов анализируемой смеси

Идеализированная внешняя хроматограмма представлена на рис. 1.4. На внешней хроматограмме по оси абсцисс отложено время хроматографирования… На дифференциальной хроматограмме различают следующие составные части: 1 –точка ввода пробы; 2 – нулевая линия,…

Изотермы адсорбции

В общем виде уравнение изотермы адсорбции записывается следующим образом: Г = f (C), ( 88 ) где Г - величина равновесной адсорбции, моль/см2; С - равновесная концентрация, моль/л.

Изотермы адсорбции и форма фронтов зон

Основными задачами теории адсорбции в приложении к хроматографии являются получение ответов на два вопроса: · в какой последовательности зоны разделяемых веществ будут выходить из… · какие условия в ходе процесса разделения необходимо соблюдать, чтобы фронты зон разделяемых компонентов были…

Влияние условий анализа на эффективность разделения

Любая хроматографическая колонка может заметно изменять свои разделительные свойства при изменении условий анализа. Наибольшее влияние оказывают скорость потока газа-носителяи температурапроцесса разделения.

ВЛИЯНИЕ СКОРОСТИ ПОТОКА ГАЗА-НОСИТЕЛЯ НА ЭФФЕКТИВНОСТЬ НАСАДОЧНОЙ КОЛОНКИ В ВАРИАНТЕ ГАЗО-ЖИДКОСТНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ

Эффективность насадочной хроматографической колонки и скорость потока газа-носителя ( ) связаны между собой уравнением Ван-Деемтера:

, (40)

где h - высота, эквивалентная теоретической тарелке; d_p - диаметр частиц носителя; l - коэффициент заполнения колонки, характеризующий степень плотности упаковки насадки в колонке; D_g - коэффициент диффузии хроматографируемого вещества в газовой фазе; g - коэффициент извилистости пути потока газа-носителя; D_l- коэффициент диффузии хроматографируемого вещества в неподвижной жидкой фазе; d_f- эффективная толщина слоя неподвижной жидкой фазы на поверхности твердого носителя; k - коэффициент емкости колонки.

В общем виде уравнение Ван-Деемтера можно представить в следующей форме:

. (41)

Каждое из слагаемых уравнения (41) количественно представляет вклад различных параметров процесса разделения, приводящих к изменению профиля зоны исследуемого соединения в хроматографической колонке.

Первый член уравнения А отражает вкладвихревой диффузии и не зависит от скорости потока газа-носителя. Поэтому с уменьшением размера частиц твердого носителя d_p , при одной и той же величине степени упаковки насадки в колонке, высота, эквивалентная теоретической тарелке, уменьшается, эффективность колонки возрастает.

Графически вклад этого слагаемого изображается прямой, параллельной оси абсцисс, а величина отсекаемого на оси ординат отрезка определяется величиной диаметра частиц носителя неподвижной жидкой фазы.

Второй член уравнения отражает влияние процесса диффузииисследуемого соединенияв газовой фазе на эффективность колонки. Коэффициент извилистости показывает влияние геометрического фактора насадки колонки. Чем меньше различаются между собой частицы сорбента по размеру и форме гранул, тем менее извилисты траектории, по которым должны двигаться молекулы разделяемых веществ в потоке газа-носителя.

Далее, высота, эквивалентная теоретической тарелке, возрастает пропорционально увеличению коэффициента диффузии вещества в газовой фазе D_g. Возможные пути управления величиной коэффициента диффузии – использование влияния температуры процесса разделения и природы газа-носителя. График вклада этого слагаемого изображается гиперболой.

Из третьего члена, , характеризующего влияние процессов диффузии в неподвижной жидкой фазе, следует, что высота, эквивалентная теоретической тарелке, пропорциональна квадрату толщины жидкой пленкиd_f. Эффективность колонки повышается, если содержание неподвижной жидкой фазы на носителе снижается.

Для более толстого слоя неподвижной жидкой фазы время, необходимое для диффузии хроматографируемого вещества через пленку неподвижной жидкой фазы и обратно, возрастает и приводит к расширению зоны и снижению эффективности колонки.

Коэффициент емкости колонки k обычно превышает единицу для большинства летучих соединений. Следовательно, значение уменьшается с увеличением k.

График вклада этого, третьего, слагаемого представляет собой прямую, выходящую из начала координат.

Результирующая, с учётом вклада всех трёх слагаемых, изображается кривой (рис. 17).

u_min

B/U

Рис. 17. Зависимость высоты, эквивалентной теоретической тарелке, от скорости потока газа-носителя

Приведенная графическая зависимость позволяет, с одной стороны, установить численное значение оптимальной скорости газа-носителя и, с другой стороны, оценить величины вкладов каждого из процессов, описываемых слагаемыми уравнения Ван-Деемтера в величину высоты, эквивалентной теоретической тарелке, и, изменяя значение скорости потока газа-носителя, изменять величины этих вкладов.

Численное значение оптимальной скорости потока газа-носителя можно также определить из уравнения Ван-Деемтера по соотношению:

. (42)

Влияние природы газа-носителя на эффективность колонки представлено на рис. 18.

u, мл/мин

h, см

0,4

0,8

1,2

H₂

N₂

HHe

Рис. 18. Влияние природы газа-носителя на эффективность хроматографической колонки

Оптимальная практическая скорость изменяется в широкой области в зависимости от площади поперечного сечения колонки, температуры, толщины пленки неподвижной жидкой фазы, коэффициента емкости колонки и природы используемого газа-носителя.

В практической газовой хроматографии следует различать понятия линейная скорость потока газа-носителя и расход газа-носителя (объемная скорость потока газа-носителя). При работе, как правило, измеряется только расход газа-носителя. В теоретических рассуждениях употребляется понятие линейной скорости потока газа-носителя.

Расход газа-носителя (w) и линейная скорость потока газа-носителя (u) связаны соотношением:

, (43)

где d_l- величина внутреннего диаметра колонки; Q - коэффициент, величина которого для насадочных колонок составляет 0.45-0.50.

Связь между длиной колонки, ее диаметром, размером частиц сорбента и расходом газа-носителя иллюстрируется табл. 6.

Соблюдение приведенных в таблице условий способствует достижению максимальной эффективности хроматографической колонки.

Т а б л и ц а 6

Условия оптимального функционирования насадочных колонок

Диаметр колонки	Размер частиц (мм) в колонках длиной	Расход газа-носителя см³/мин
до 3 м	более 3 м	N₂	He или Н₂
2 мм	0.11-0.12	0.12-0.18	8-15	15-30
3 мм	0.11-0.12	0.12-0.18	15-30	30-60
4 мм	0.12-0.18	0.18-0.25	30-60	60-100

Для насадочных колонок оптимальная практическая скорость лежит в области менее 1м/мин.

Таким образом, эффективность насадочной хроматографической колонки улучшается, если:

· используются частицы носителя неподвижной жидкой фазы малого диаметра, равномерно заполняющие колонку;

· разделение проводится при наименьшей практически возможной температуре;

· содержание неподвижной жидкой фазы оптимальное;

· газ-носитель имеет большой молекулярный вес;

· скорость потока газа-носителя оптимальная.

7.3. ВЛИЯНИЕ СКОРОСТИ ПОТОКА ГАЗА-НОСИТЕЛЯ НА ЭФФЕКТИВНОСТЬ КАПИЛЛЯРНЫХ КОЛОНОК

При переходе от насадочных колонок к капиллярным, вследствие изменения характера внутреннего пространства, претерпевают изменения и представления Ван-Деемтера.

Теория процесса разделения веществ в капиллярных колонках разработана М. Голеем (США, 1957 г.) из следующих предположений:

· размывание зоны вещества в колонке происходит только вследствие процессов диффузии в потоке газа-носителя;

· в хроматографической колонке реализуется только ламинарный характер течения газа-носителя по колонке;

· неподвижная жидкая фаза зафиксирована на внутренней стенке капилляра в виде гомогенной жидкой пленки.

Развернутая форма уравнения Голея записывается

, (44)

в котором r – радиус капиллярной колонки.

В общем виде уравнение Голея записывается:

. (45)

Если принять, что С_g >> C_l, то можно рассчитать значение h_min

. (46)

Из приведенного уравнения следует, что величина h_min пропорциональна радиусу капилляра и является функцией коэффициента емкости колонки.

Для несорбирующегося компонента (k = 0) h_min = 0.58 r, для компонента с величиной k > 100 h_min = 1.9 r.

Исходя из того же допущения, что С_g >> C_l, можно рассчитать и величину оптимальной скорости потока газа-носителя

. (47)

Видно, что с уменьшением радиуса капилляра оптимальная скорость газа-носителя возрастает пропорционально коэффициенту диффузии исследуемого соединения в газе-носителе и величине коэффициента емкости колонки.

Для несорбирующегося компонента с k = 0 численное значение оптимальной скорости потока газа-носителя рассчитывается по соотношению

u_опт = 6.9 , а для компонента с k = 100 u_опт = 2.1 .

Графическая зависимость высоты эквивалентной теоретической тарелки от скорости потока газа-носителя, при его ламинарном течении, аналогична, как и для насадочных колонок.

h, см

0,01

0,09

0,07

0,05

0,03

0,01

0,09

0,07

0,05

0,03

линейная скорость газа-носителя, см/c

На рис. 19 а представлено влияние величины внутреннего диаметра капиллярной колонки, а на рис. 19 б - влияние величины коэффициента емкости капиллярной колонки к исследуемому соединению на ее эффективность.

Рис. 19. График зависимости высоты тарелки от линейной скорости газа-носителя для полой капиллярной колонки (н-гексан, газ-носитель – гелий):

a – влияние внутреннего диаметра колонки (k= 1): 1-d_c = 0,1 mm; 2–d_c = 0,25 mm; 3 – d_c = 0,5 mm; б – влияние коэффициента емкости колонки (d_c=0,25 mm):1 – k = 0; 2 – k = 1; 3 – k = 2; 4 – k = 5; 5 – k = 10

Однако дальнейшее увеличение объемной скорости потока газа-носителя приводит к изменению характера течения – ламинарное течение сменяется турбулентным, для которого характерны внезапные локальные изменения скорости, изменение направления движения потока, изменение величины давления.

Обычно тип течения жидкости определяется величиной критерия Рейнольдса “Re”, определяемого из соотношения:

, (48)

где u - линейная скорость потока газа-носителя; r - радиус капилляра;v - кинематическая вязкость газа-носителя.

Графическая зависимость высоты эквивалентной теоретической тарелки от величины критерия Рейнольдса приведена на рис.20.

h, см

10³

10²

10¹

10⁰

10¹

10²

10³

10⁴

10⁵

Рис. 20. Зависимость высоты эквивалентной теоретической тарелки от величины критерия Рейнольдса:

а – область ламинарного течения, б – область турбулентного течения потока газа-носителя

Для капиллярных колонок оптимальная практическая линейная скорость потока газа-носителя лежит в области от 3 до 8 м/мин.

ВЛИЯНИЕ ТЕМПЕРАТУРЫ НА ПАРАМЕТРЫ ПРОЦЕССА РАЗДЕЛЕНИЯ

На селективность α очень сильно оказывает влияние температура, а на эффективность n влияет скорость потока газа-носителя. С увеличением температуры снижается α, но при этом повышается эффективность.

Температура колонки оказывает одно из самых решающих влияний на ход газохроматографического разделения, что обусловлено следующими причинами.

Величина коэффициента распределения исследуемого соединения К_i связана с величиной исправленного удерживаемого объема соотношением:

V¢ = V_l К_i , (51)

где V_l - объем неподвижной фазы в колонке; V¢ - исправленный удерживаемый объем исследуемого соединения.

8.1. ВЛИЯНИЕ ТЕМПЕРАТУРЫ НА ПАРАМЕТРЫ УДЕРЖИВАНИЯ

Для данной хроматографической колонки объем неподвижной фазы V_l можно считать постоянным. Следовательно, для того чтобы величина исправленного удерживаемого объема исследуемого соединения находилась в приемлемых пределах, величина коэффициента распределения этого вещества между фазами K_i также должна находиться в соответствующей области численных значений, которая во многом и определяется температурой процесса разделения.

В принципе повышение температуры обусловливает более короткое время удерживания, а тем самым и время анализа. Это объясняется тем, что коэффициент распределения вещества между фазами К_i имеет положительный температурный коэффициент, его численные значения с ростом температуры процесса разделения уменьшаются, а следовательно, уменьшается и удерживаемый объем исследуемого соединения.

Исправленный удерживаемый объем изменяется с обратной абсолютной температурой экспоненциально, как показано на рис. 21.

температура, ⁰C

3,4

3,0

2,5

1000/T, ⁰K

пропан

мертвый обьем

н-пентан

н-октан

Рис. 21. Изменение величин исправленных удерживаемых объемов от температуры

Мертвый объем колонки при повышении температуры также уменьшается.

Таким образом, если бы хроматографические разделения велись только при комнатной температуре, газовую хроматографию можно было бы использовать для анализа только ограниченного набора веществ, существенно различающихся при этой температуре по величинам констант распределения между фазами. Одно только использование сильной температурной зависимости коэффициента распределения позволяет значительно расширить число анализируемых веществ.

Температуру хроматографической колонки следует довести до такого значения, при котором различия в коэффициентах распределения исследуемых веществ между фазами находятся в пределах, необходимых для осуществления эффективного хроматографического разделения.

Так как температуру колонки обычно варьируют в диапазоне от 20 до 300 ^oС, целесообразно учитывать эмпирическое правило, согласно которому методом газовой хроматографии при заданной температуре колонки можно с достаточной эффективностью разделить все вещества с температурами кипения, отличными от температуры колонки не более чем на 60 ^oC.

Кроме изменения величин коэффициентов распределения разделяемых компонентов между фазами, изменение температуры процесса разделения приводит:

· к изменению объема газовой фазы во внутреннем объеме колонки;

· к изменению объема неподвижной жидкой фазы во внутреннем объеме колонки;

· к изменению скорости потока газа-носителя;

· к изменению величины перепада давления газа-носителя на входе в колонку и на выходе из колонки;

· к изменению величин коэффициентов диффузии разделяемых соединений в газе-носителе;

· к изменению величин коэффициентов диффузии разделяемых соединений в неподвижной жидкой фазе.

Суммарным результатом всех имеющих место изменений является изменение эффективности используемой хроматографической колонки при изменении температуры процесса разделения.

8.3. ВЛИЯНИЕ ТЕМПЕРАТУРЫ НА СТЕПЕНЬ

РАЗМЫВАНИЯ ХРОМАТОГРАФИЧЕСКИХ ПИКОВ

Эффективность колонки, которая является мерой размывания хроматографической полосы, выражают обычно через высоту, эквивалентную теоретической тарелке.

Высота тарелки является функцией большого числа переменных, входящих в уравнение Ван-Деемтера, многие из которых зависят от температуры; вследствие этого высота тарелки меняется с температурой сложным образом.

Наиболее существенное влияние изменение температуры оказывает на величины коэффициентов диффузии разделяемых соединений в газе-носителе и в неподвижной жидкой фазе.

Установлено, что коэффициенты диффузии разделяемых соединений в газовой фазе пропорциональны температуре в степени 1.8. Так, при повышении температуры с 25 до 150 ^оС коэффициенты диффузии возрастают в 2 раза, а при повышении температуры до 310 ^оС – в 4 раза.

Таким образом, при работе с постоянными давлениями на входе и на выходе из колонки изменение скорости потока газа-носителя пропорционально изменению температуры колонки в степени -0.7.

Именно поэтому слагаемое в уравнении Ван-Деемтера увеличивается с ростом температуры колонки в степени 2.5.

В коэффициенте С уравнения Ван-Деемтера все три параметра k, d_f, D_l зависят от температуры.

Наименьшим является изменение с температурой величины d_f², отражающее влияние коэффициента термического расширения жидкости. Так, например, для динонилфталата при повышении температуры от 0 до 150 ^оС d_f² увеличивается на 20 %.

Коэффициент емкости колонки k быстро уменьшается с повышением температуры. Численное значение сомножителя сначала растет, поскольку при низких температурах k имеют высокие численные значения, проходит через максимум при k = 1, а затем при дальнейшем повышении температуры уменьшается.

Поскольку при оптимальном хроматографическом режиме значение k обычно несколько больше единицы, в большинстве случаев повышение температуры колонки будет вызывать увеличение численного значения этого сомножителя.

Наконец, коэффициенты диффузии разделяемых соединений в неподвижной жидкой фазе D_l быстро увеличиваются с повышением температуры. Коэффициенты диффузии разделяемых соединений в наиболее распространенных неподвижных жидких фазах увеличиваются с повышением температуры; логарифм коэффициента диффузии линейно связан с обратным значением абсолютной температуры.

Таким образом, с повышением температуры колонки численное значение d_f слегка возрастает, численное значение – сильно уменьшается, а численное значение – либо увеличивается, либо уменьшается в зависимости от величины k.

Влияние температуры колонки на высоту тарелки для 2.3-диметилбутана для колонки длиной 1 м, содержащей 39 % ПЭГ-400 приведено на рис. 23.

скорость потока, см/сек

6,0

3,0

0,3

0,6

0,9

15 ⁰C

30 ⁰C

45 ⁰C

Рис. 23. Влияние температуры колонки на высоту, эквивалентную теоретической тарелке

Следовательно, с ростом температуры эффективность колонки должна улучшаться (высота, эквивалентная теоретической тарелке уменьшается), однако при любой постоянной температуре невозможно выбрать скорость потока газа-носителя такой, чтобы обеспечить максимальную эффективность колонки для всех разделяемых веществ, различающихся температурами кипения.

8.4. РАЗДЕЛЕНИЕ С ПРОГРАММИРОВАНИЕМ ТЕМПЕРАТУРЫ

Последнее заключение послужило предпосылкой для разработки специального варианта разделения сложных по составу смесей, основу которого составляет изменение температуры хроматографической колонки непосредственно в ходе процесса разделения.

Действительно, если в состав анализируемой смеси входят легко летучие компоненты и компоненты, кипящие при достаточно высоких температурах, хроматограммы, полученные в различных изотермических режимах, будут иметь различный вид (рис. 24).

время, мин

Рис. 24. Изотермические хроматограммы смеси, кипящей до 226 ^оС.

Пики 1- 6 соответствуют н-алканам от пропана до октана; 7 - бромоформ; 8 – м-хлортолуол. а – температура колонки 45 ^оС; б – температура колонки 120 ^оС

Из приведенных хроматограмм следует, что разделение легко летучих компонентов следует проводить при минимальной рабочей температуре колонки, а эффективное разделение высококипящих компонентов достигается только при гораздо более высоких температурах колонки.

При постоянной температуре термостата колонок (разделение в

изотермическом режиме) с достаточной эффективностью возможно осуществление разделения только 5-6 последовательных членов одного гомологического ряда. Для анализа более сложных по составу проб необходимо выполнение нескольких повторяющихся разделений одной и той же анализируемой смеси веществ при последовательно повышаемых на 50 ^оС температурах процесса разделения.

Из отмеченного следует, что оптимальным температурным режимом процесса разделения является низкая температура колонки в самом начале процесса разделения и постепенное возрастание температуры колонки по мере выхода из нее легко летучих компонентов анализируемой смеси.

Режим изменения температуры процесса разделения во времени может быть самым различным и зависит от свойств веществ, входящих в состав разделяемой смеси.

Температура может меняться по линейному закону (с постоянной скоростью увеличения), по нелинейному закону или ступенчато.

время, мин

температура, ⁰С

Рис. 25. Хроматограмма смеси рис. 24, полученная при линейном программировании температуры. Номера пиков как и на рис. 24; 9 – м-бромтолуол

На рис. 25 приведена хроматограмма разделения той же смеси, что и на рис. 24, только с использованием линейного программирования температуры колонки.

Использование рационального режима программирования температуры позволяет для хроматографической колонки с числом теоретических тарелок равным 3 000 разделить с достаточной эффективностью смесь, состоящую из 40-50 компонентов. При использовании более эффективной колонки с числом теоретических тарелок 100 000, число разделяемых компонентов может достигать 300.

Газовая хроматография

Отличительной особенностью газовой хроматографии от других методов хроматографических разделений является то, что используемая подвижная фаза должна… Характерными особенностями газовой хроматографии являются: · Высокая разделительная способность: по своим возможностям анализа многокомпонентных смесей газовая хроматография не…

Подвижная фаза. Характеристика основных представителей

Исходя из этого, и определены следующие основные требования, предъявляемые к газу-носителю: · газ-носитель должен способствовать обеспечению оптимального разделения… · газ-носитель должен обеспечить максимально высокую чувствительность детектора;

Рис. 22. Изменение вязкости газов-носителей от температуры

Установлено, что вязкости газов, пригодных в качестве газов-носителей, возрастают прямо пропорционально величине абсолютной температуры в степени 0,7.

При работе с постоянной скоростью потока газа-носителя величина перепада давления будет увеличиваться по мере возрастания температуры.

При работе при постоянных давлениях на входе и на выходе из колонки скорость потока газа-носителя на выходе уменьшается пропорционально росту температуры в степени -1.7.

Хроматографические колонки

Основной узел хроматографа - колонка, в которой непосредственно происходит разделение анализируемой пробы на компоненты. Основная задача хроматографической колонки состоит в том, чтобы разделить многокомпонентную анализируемую смесь на серию последовательно выходящих из колонки бинарных смесей, индивидуальный компонент-газ-носитель, которые затем используются в соответствии с назначением хроматографической колонки.

Хроматографические колонки в соответствии с их назначением подразделяются на колонки аналитические, колонки препаративные и так называемые предколонки.

Главное назначение аналитической хроматографической колонки состоит в том, чтобы разделить многокомпонентную смесь на серию бинарных смесей компонент-газ-носитель , для которых уже может быть применен прибор, регистрирующий состав этой смеси и позволяющий установить качественный состав анализируемой смеси и количественное содержание каждого из компонентов.

Препаративные хроматографические колонки предназначены для получения методами газовой хроматографии в чистом виде необходимых количеств тех или иных компонентов, присутствующих во вводимой в колонку пробе.

Предколонки позволяют решить задачу предварительного концентрирования компонентов пробы из достаточно больших объемов для последующего их разделения или решить задачу извлечения из объема анализируемой пробы мешающих разделению компонентов.

На данном этапе изучения программного материала наибольший интерес для нас представляют хроматографические колонки аналитического назначения.

Аналитические колонки в зависимости от величины внутреннего диаметра, способа размещения неподвижной фазы и соответственно организации внутреннего пространства подразделяются следующим образом:

· насадочные колонки, характеризующиеся величиной внутреннего диаметра 2 - 5 мм;

· микронасадочные колонки с величиной внутреннего диаметра 1.0 -2.0 мм;

· макрокапиллярные колонки с величиной внутреннего диаметра 0.3 - 0.5 мм;

· микрокапиллярные колонки с величиной внутреннего диаметра 0.10 - 0.25 мм.

Основные требования, предъявляемые к материалу колонки следующие:

· материал колонки не должен быть химически активным или действовать каталитически по отношению к неподвижной фазе и разделяемым компонентам;

· должен обеспечивать возможность изготовления колонок необходимой формы;

Рис.1.14. Колонки для газо-жидкостной хроматографии: а - насадочная, б – тонкопленочный капилляр, в – тонкослойный капилляр

должен выдерживать нагревание до нужной температуры.

Из насадочных колонок наиболее удобны в изготовлении и эксплуатации металлические колонки из нержавеющей стали, меди, алюминия. В этом плане следует, однако, обязательно учитывать, что медь реагирует с ацетиленовыми углеводородами, катализирует разложение спиртов. Алюминиевые колонки, в свою очередь, непригодны для заполнения молекулярными ситами. Разделение хелатов металлов следует производить в основном на колонках из боросиликатного стекла.

Длина насадочных колонок обычно от 1 до 3 м, реже до 10 м. Форма колонок – прямая, U-образная, W-образная, спиральная. Длина и форма насадочных колонок определяется, как правило, размерами термостата колонок.

При изготовлении спиральных колонок следует учитывать, что диаметр витка спирали не должен быть чрезмерно маленьким, так как длина пути газа по внешней и внутренней поверхности трубки будет существенно различаться, и это вызывает дополнительное размывание зоны. Обычно отношение радиуса спирали к радиусу колонки составляет величину порядка 80.

Промежуточное положение между насадочными и капиллярными колонками занимают микронасадочные колонки. Они появились в 1962 году в результате попытки сочетать достоинства насадочных и капиллярных колонок.

Капиллярные колонки изготавливают преимущественно из стекла, так как стекло обладает наименьшей адсорбционной и каталитической активностью. Колонки, изготовленные из меди, нержавеющей стали, применяют в основном для анализа углеводородов.

С 1977 года широко применяются капиллярные колонки из кварца. Их преимущество заключается в низком содержании оксидов металлов: щелочных, алюминия, железа, бора. Оксиды способны легко взаимодействовать с молекулами-донорами электронов, сильные основания (например, амины) могут хемосорбироваться и вообще не выходить из колонки. Для придания капиллярным колонкам дополнительной прочности их внешняя поверхность покрывается лаком специального состава.

Для капиллярных колонок существует дополнительная классификация:

· колонки, содержащие неподвижную жидкую фазу непосредственно на гладких внутренних стенках колонки ОКК (WCOT-колонки);

· колонки, содержащие на гладких внутренних стенках слой пористого сорбента ОКК-ПС (РLОТ-колонки);

· колонки, содержащие на внутренних стенках твердый носитель, пропитанный неподвижной жидкой фазой ОКК-ТН (SCOT-колонки);

· колонки с химически привитой неподвижной жидкой фазой, в которых неподвижная жидкая фаза химически связана с внутренней поверхностью капилляра.

В настоящее время открытые капиллярные колонки, в которых тонкая пленка неподвижной фазы нанесена непосредственно на внутреннюю поверхность колонки (WCOT-колонки), используются наиболее часто. Выпускаемые промышленностью капиллярные WCOT-колонки имеют внутренний диаметр от 0,05 до 0,53 мм. Слой неподвижной фазы (НФ) толщиной от 0,1 до 0,8 мкм равномерно покрывает внутреннюю поверхность колонки. В качестве НФ используют полимеры, представляющие собой невязкую жидкость (OV-225), каучуки (OV-1, SB-30) или твердые вещества (карбовакс 20 М, суперокс). Эти фазы растворяют в соответствующих растворителях и наносят на внутреннюю поверхность капилляра.

WCOT-колонки обладают высокой эффективностью по отношению к различным трудноразделяемым смесям, состоящим из большого числа компонентов. Однако стандартная толщина пленки неподвижной фазы не позволяет достичь достаточно высокой емкости колонки, необходимой при анализе концентрированных растворов. На этих колонках также нельзя провести эффективное разделение соединений с очень низкой молекулярной массой или инертных газов при обычных температурах. Чтобы преодолеть эти ограничения, были предложены WCOT-колонки с очень толстым слоем неподвижной фазы. Для решения этих задач можно также использовать PLOT-, SCOT- и микронасадочные колонки.

PLOT-колонки – это кварцевые капиллярные колонки, на внутренние стенки которых нанесен слой адсорбента. В настоящее время в качестве адсорбента используют А1₂О₃/KС1, молекулярные сита или пористые полимеры (близкие по составу к порапаку Q). К недостаткам этих колонок можно отнести меньшую эффективность по сравнению с WCOT-колонками, невысокую инертность и снижение стабильности и воспроизводимости во времени.

SCOT-колонки – капиллярные колонки, на внутренних стенках которых нанесен слой носителя с неподвижной фазой, – реже используются в высокоэффективной газовой хроматографии из-за низкой инертности носителя. В SCOT-колонках неподвижная фаза наносится на твердый носитель, прикрепленный к стенке колонки. Основным достоинством колонок этого типа является возможность применения широкого ассортимента неподвижных фаз. Многие специалисты, работающие в области высокоэффективной газовой хроматографии, считают, что для достижения высокой эффективности не требуется большого количества различных фаз, а можно обойтись ограниченным набором. Поэтому для внедрения SCOT-колонок в хроматографическую практику необходимо показать их перспективность.

Микронасадочные капиллярные колонки – это капиллярные колонки, практически целиком заполненные носителем. В будущем микронасадочные и SCOT-колонки, вероятно, найдут большее применение для проведения некоторых анализов, но их широкое использование в настоящее время выглядит проблематично.

Второй класс хроматографических колонок составляют препаративные колонки. Вследствие своего назначения - получения доста-точно больших количеств особо чистых веществ - хроматографические колонки этого класса характеризуются величиной внутреннего диаметра от 10 мм и более, длиной от одного до нескольких десятков метров. Основной материал для их изготовления – нержавеющая сталь.

Хроматографические колонки третьей группы (предколонки) изготавливаются из материалов и имеют характеристики, отвечающие их назначению в каждом конкретном случае.

Длина хроматографической колонки в зависимости от цели анализа и состава анализируемой пробы может составлять от нескольких десятков сантиметров до нескольких десятков и даже сотен (капиллярные колонки) метров.

Появление на рынке в конце 1979 г. кварцевых капиллярных колонок, по существу, явилось главным прорывом в области капиллярной газовой хроматографии. В 1979 г. менее 10% выпускаемых промышленностью хроматографов были приспособлены для работы с капиллярными колонками, а в 1989 г. их число превысило 60%. Можно ожидать, что число таких приборов будет расти, поскольку в результате развития метода появилась возможность анализа как высококипящих, так и легколетучих соединений.

Устройства ввода пробы в хроматограф

Дозатор - это устройство для ввода в хроматографическую колонку газовой, жидкой или твердой анализируемой пробы. Дозатор должен удовлетворять следующим требованиям:

- обеспечивать воспроизводимость величины пробы;

- его внутренняя поверхность должна быть индифферентна к компонентам анализируемой пробы;

- должен быть конструктивно прост, удобен в работе и дешев.

Правильный ввод пробы предполагает обязательное выполнение трех основных требований:

· обеспечение минимального размывания пробы в системе ввода пробы;

· обеспечение максимальной точности и воспроизводимости дозируемого количества образца;

· обеспечение неизменности количественного и качественного состава смеси до и после дозирования.

Первое требование исходит из того, что в упрощенной теории линейной хроматографии идеальная модель исключает какое-либо размывание пробы в системе ввода, поскольку предполагается, что образец в начале хроматографической колонки занимает объем неподвижной фазы, эквивалентный одной теоретической тарелке.

Теоретическая тарелка характеризует такую часть колонки по высоте, на протяжении которой однократно реализуется процесс перехода исследуемого соединения из подвижной фазы в неподвижную и обратно.

На практике конечный объем пробы и конечное время дозирования препятствуют этому. Тем не менее при стремлении к идеальной модели следует вводить минимально возможные по объему пробы за минимально короткий промежуток времени.

Для практической нелинейной хроматографии мгновенный ввод пробы не всегда приводит к оптимальным результатам, поскольку чем выше концентрация компонента на слое сорбента, тем сильнее размывание полосы, когда изотерма адсорбции исследуемого соединения в этой области его концентраций нелинейна.

Таким образом, при мгновенном вводе пробы разбавление образца газом-носителем будет гораздо меньшим, чем при медленном дозировании, и, следовательно, в первом случае в колонку войдет узкая полоса с высокой концентрацией, а во втором – более широкая полоса с меньшей концентрацией.

Оптимальное соотношение этих двух противоположно действующих факторов – ширины полосы и концентрации, обусловленное степенью влияния каждого из них на размывание полосы, определяет время дозирования.

Следует учитывать, что существенное влияние на размывание пробы в системе ввода пробы оказывает конструкция дозатора. В соответствии с этим основными требованиями, предъявляемыми к конструкции дозатора, являются следующие:

· минимальный внутренний объем дозатора;

· отсутствие непродуваемых газом-носителем полостей во внутреннем объеме дозатора;

· хорошо сформированный поток газа-носителя должен быстро переносить весь анализируемый образец непосредственно в колонку.

Второе требование к вводу пробы предполагает дозирование образца с высокой точностью и воспроизводимостью, поскольку хроматография является сравнительным методом анализа. Это требование усугубляется стремлением к вводу минимального количества образца, что на современном уровне составляет примерно 1 мкл газовой пробы и 0.05 мкл жидкой пробы.

Третье требование к вводу пробы предусматривает исключение изменения качественного состава пробы и количественного соотношения анализируемых компонентов в системе ввода, например, за счет разложения при контакте с нагретыми металлическими стенками испарителя, каталитических превращений, полимеризации, селективной сорбции.

В целях устранения этих помех следует:

· использовать полностью стеклянные (еще лучше кварцевые) системы ввода пробы;

· ввод пробы целесообразно осуществлять непосредственно в хроматографическую колонку;

· температура зоны испарения обязательно должна быть выше температуры кипения самого высококипящего компонента.

Следует обязательно учитывать, что при недостаточно высокой температуре в зоне испарения образца может происходить процесс фракционирования пробы. При этом тяжелые компоненты пробы не могут испариться мгновенно, и поступающий в первый момент в колонку пар будет обеднен ими. В особых случаях температура испарителя может программироваться, если стоит задача фракционирования сложной по составу анализируемой смеси уже в испарителе.

Кроме отмеченных общих требований имеются и специфические требования к дозирующим устройствам для каждого из агрегатных состояний проб: газообразных, жидких, твердых.

В зависимости от агрегатного состояния анализируемой пробы используются различные способы их ввода.

Ввод газообразных проб можно осуществить либо с помощью обычного медицинского шприца, либо используя специальные дозирующие устройства.

Использование шприца приводит к существенным ошибкам вводимых объемов пробы (± 10 %) вследствие того, что конец иглы шприца открыт и давление в шприце равно атмосферному, в то время как давление в устройстве для ввода пробы выше атмосферного, и поэтому выше, чем во внутреннем объеме шприца. Следовательно, для ввода пробы необходимо создать поршнем давление большее, чем на входе в хроматограф. Поэтому остаточный объем газа в игле шприца всегда находится при повышенном давлении, его количество отличается от значения при нормальных условиях и не является постоянным.

Специальные дозирующие устройства подразделяются: газовый кран, газовый шток, газовая петля.

При использовании этих дозирующих устройств анализируемая проба становится частью объема газа-носителя и вместе с ним поступает в колонку.

Устройство газового крана приведено на рис. 3.

Сначала анализируемая газообразная смесь, подаваемая из газометра или газопровода под постоянным давлением, заполняет внутренний объем канала 1–2 газового крана. Затем поворотом крана канал с анализируемой газовой смесью помещается в поток газа-носителя и поступает в колонку.

выход пробы

вход пробы

выход газа-носителя

дозируемый объем (отверстие в пробке крана)

вход газа-носителя

Рис. 3. Схема устройства газового крана

вход пробы

вход газа-носителя

ввыход пробы

ввыход газа-носителя

ддозируемый объем

Рис. 4. Схема устройства газового штока

На рис. 4 приведена схема дозирующего устройства с движущимся штоком.

Основным недостатком обеих конструкций является невозможность изменения величины дозирующего объема.

Этого недостатка лишен кран-дозатор со сменными дозирующими газовыми петлями. Схема крана-дозатора приведена на рис. 5.

Ввод пробы

Вход газа-носителя

выход газа-носителя

резиновый уплотнитель

выход пробы

вход пробы

дозирующая петля

Отбор пробы

вход газа-носителя

отбор пробы ввод пробы

Рис. 5. Устройство газовой петли

Ввод жидких проб. В первых газохроматографических приборах жидкая проба вводилась в колонку с помощью микропипетки. При этом поток газа-носителя прерывался. В 1954 году Рэй предложил метод ввода пробы в непрерывно движущийся поток газа-носителя с помощью шприца через самоуплотняющуюся резиновую мембрану (септу).

Устройство для ввода жидких проб должно быть обязательно снабжено испарителем, в котором образец мгновенно испаряется, смешивается с газом-носителем и поступает в хроматографическую колонку.

К испарителям проб предъявляются следующие требования:

· обеспечение равномерного обогрева в интервале температур 50-500 ^оС с точностью 5 ^оС;

· минимальный объем зоны испарения;

· отсутствие непродуваемых газом-носителем полостей;

· самоуплотняющаяся прокладка (септа) из специального материала должна поддерживаться при более низкой температуре, чем испаритель, за счет постоянного обдува;

· проба должна вводиться в горячую зону испарителя достаточно длинной иглой;

· поток газа-носителя должен формироваться таким образом, чтобы свести к минимуму обратную диффузию паров образца в холодную зону возле прокладки и в подводящие линии;

· газ-носитель до контакта с парами вещества должен нагреваться до температуры испарителя;

· внутренняя поверхность испарителя должна быть доступна для чистки;

· химические превращения разделяемых соединений в испарителе проб должны отсутствовать.

В современных хроматографах используются несколько типов испарителей или способов введения пробы при различных режимах работы испарителя:

1. Ввод пробы с делителем потока (split injection).

2. Ввод пробы без делителя потока (splitless injection).

3. Ввод пробы в колонку (on-column injection).

4. Прямой ввод пробы (direct injection).

5. Ввод пробы с программированием температуры испарителя (programmed temperature vaporizing injection).

Поскольку объем анализируемых проб при использовании капиллярных хроматографических колонок должен составлять 0.01 - 0.001 мкл, обычными способами осуществить введение таких объемов непосредственно в испаритель невозможно. Обычное устройство ввода пробы с делением потока представляет собой испаритель. Проба жидкости мгновенно испаряется и небольшая часть парообразной пробы поступает в колонку. Основная же часть пробы выводится из системы. Использование делителя потока гарантирует получение узких зон пробы на входе в колонку.

Если гомогенизация введенной в испаритель пробы полная, то образец будет делиться в отношении, определяемом отношением скоростей двух указанных потоков. Численное значение величины отношения этих потоков называется отношением деления. На практике используются делители потока с отношением деления от 1:10 до 1:1000.

Для достижения эффективного теплопереноса и тщательного смешения газа-носителя с испаренной пробой были предложены различные виды стеклянных вкладышей (лайнеры): незаполненные трубки; короткие трубки, заполненные стекловатой и помещаемые в месте деления потока или в области ввода пробы; длинные и узкие трубки со стекловатой; трубки, заполненные носителем или стеклянными шариками; трубки, переменного диаметра; трубки Дженнингса и т. д.

Использование таких вкладышей в некоторых случаях помогает уменьшить дискриминацию компонентов пробы, но иногда может привести к еще большей дискриминации других компонентов.

Еще одно преимущество ввода пробы с делением потока при анализе сложных смесей, содержащих компоненты с близкими температурами кипения, состоит в том, что можно подсоединить две колонки к одному отверстию ввода пробы. В этом случае, однократно введя пробу, можно одновременно провести разделение смеси на двух различных неподвижных фазах. При вводе пробы с делением потока получают очень высокую воспроизводимость величин удерживания. Можно легко рассчитать индексы удерживания на обеих колонках и сравнить их с табличными данными.

Рекомендации по вводу проб с делением потока:

• При проведении количественного анализа предпочтение отдается методам стандартной добавки или внутреннего стандарта. Использование метода внешнего стандарта, при котором сравнивают абсолютные площади пиков, допустимо в сочетании с вводом пробы охлажденной иглой, программированием температуры испарителя или быстрым автоматическим вводом пробы.

•Воспроизводимость результатов улучшается, если объем вводимой пробы неизменен. Обычно вводят от 0,5 до 2,0

мкл пробы.

•Необходимо подбирать температуру устройства ввода пробы с учетом поставленной задачи. Следует избегать чрезмерно высоких температур испарителя.

•При ручном вводе предпочтение отдается быстрому вводу пробы горячей иглой.

•По возможности следует избегать легколетучих растворителей.

•Если использование вкладышей без насадки неэффективно, можно заменить их вкладышами, неплотно упакованными стекловатой или стеклянными шариками. Однако следует помнить о возможности адсорбции и разложения компонентов пробы на этих насадках.

•Одной из основных проблем, связанных с вводом пробы с делением потока, является работа со шприцем. Эту При вводе пробы без делителя потока вентиль делителя поток» закрыт. Введенная проба мгновенно испаряется в камере испарителя. Отсюда потоком газа-носителя пары пробы переносят в колонку. Перенос пробы продолжается несколько сотен миллисекунд, поэтому можно предположить, что исходные зоны буду довольно широкими. Однако размывание исходной зоны можно подавить, если использовать эффекты фокусирования: эффект растворителя, термическое фокусирование и фокусирование неподвижной жидкой фазой.

Основным преимуществом ввода пробы без делителя потока является то, что вся введенная проба попадает в колонку и в результате этого чувствительность существенно выше, чем при пользовании делителя. В течение долгого времени ввод проб деления потока был единственным методом, применяемым в капиллярных ГХ при определении следовых концентраций.

Ввод жидких проб чаще всего осуществляется с помощью микрошприца. Микрошприц состоит из стеклянного цилиндра с калиброванным внутренним каналом, металлического поршня и иглы (рис. 6).

Шприцы для малых дозировок имеют рабочий объем, заключенный лишь во внутреннем объеме иглы (рис. 6 б).

Рис. 6. Микрошприцы для ввода жидких (а), (б) и твердых образцов (в)

Поршень – проволочка, диаметром около 0.2 мм доходит до самого конца иглы, поэтому мертвый объем отсутствует.

Точность дозировки – 1 мкл 2 %.

Современные газовые хроматографы оснащаются системами автоматического ввода анализируемых проб, позволяющими существенно повысить точность и воспроизводимость вводимых объемов.

Ввод твердых образцов проб осуществляется в тех случаях, когда нет возможности перевести анализируемый образец в растворенное состояние, но имеется возможность перевода твердого образца сразу в парообразное без его разрушения.

Образец помещают в микрокапсулах из стекла или легкоплавкого металла или сплава (сплав Вуда, Т_пл = 60.5^оС) в испаритель. В испарителе капсула разбивается или расплавляется, проба испаряется и переносится газом-носителем в колонку.

В специальных шприцах для ввода твердых образцов проба помещается в тонко измельченном виде на язычок, которым заканчивается поршень. Затем язычок с пробой втягивается во внутренний объем иглы, иглой прокалывается мембрана пробоотборника, язычок выталкивается из иглы, и образец испаряется с язычка (рис. 6 в).

1.3.5. Детекторы.

Детектор - это специальный блок хроматографической системы, реагирующий на различие в составе подвижной фазы, не содержащей компонентов разделяемой смеси, и подвижной фазы с разделенными компонентами, выходящими из колонки. Сигнал детектора после необходимого усиления подается на регистрирующее устройство.

Результаты детектирования, а следовательно, и результаты всего анализа в значительной степени зависят от правильного выбора типа детектора, его конструкции. Принятая классификация детекторов позволяет правильно установить возможности и оптимальные варианты использования каждого из них.

Хроматографический детектор предназначен для обнаружения и измерения количеств компонентов в потоке подвижной фазы на выходе из хроматографической колонки.

В основе работы хроматографических детекторов лежит то положение, что при попадании в газ-носитель компонентов анализируемой смеси образовавшаяся бинарная смесь компонент – газ-носитель отличается по физико-химическим свойствам от чистого газа-носителя. Эти изменения регистрируются во времени и представляются в форме, удобной для дальнейшей обработки.

Основные требования, предъявляемые к хроматографическим детекторам следующие:

· детектор должен обладать высокой чувствительностью – регистрировать даже малые изменения физико-химических свойств подвижной фазы;

· величина сигнала детектора должна изменяться пропорционально изменению концентрации определяемого компонента в подвижной фазе;

· детектор должен регистрировать определяемые компоненты по возможности мгновенно (иметь достаточное быстродействие);

· рабочий объем детектора должен быть, по возможности, наименьшим, чтобы исключить дополнительное размывание пиков в детекторе;

· желательно, чтобы показания детектора отражали изменения физико-химических свойств подвижной фазы только от ее состава.

По возможности следует исключить влияние температуры, давления, других параметров хроматографического процесса на функционирование детектора. Если этого не удается достичь, необходимо поддерживать эти параметры во время всего процесса разделения строго постоянными.

Среди многообразия хроматографических детекторов следует различать детекторы интегральные и детекторы дифференциальные.

Интегральные детекторы регистрируют суммарное количество всех разделяемых веществ, выходящих из хроматографической колонки. Хроматограмма смеси, при условии полного разделения компонентов, состоит из ряда ступеней, отделенных друг от друга участками, параллельными нулевой линии. Число ступеней на хроматограмме соответствует числу компонентов в анализируемой смеси, а высота каждой ступени характеризует количество данного компонента в смеси.

Интегральные детекторы не требуют специальной калибровки.

Типичным примером интегрального детектора является обычная бюретка, заполненная раствором щелочи и погруженная открытым концом в стакан с этим раствором. В качестве газа-носителя используется углекислый газ, который, попадая в бюретку, реагирует со щелочью с образованием гидрокарбоната. При этом изменение положения верхнего уровня жидкости в бюретке наблюдается лишь при попадании в нее компонентов разделяемой смеси, не реагирующих со щелочью.

Устройство детектора приведено на рис. 26, а вид хроматограммы приведен на рис. 27.

CO₂

сигнал

время

Рис. 26. Схема устройства

Рис. 27. Вид хроматограммы итегрального детектора при использовании интегрального детектора

Дифференциальный детектор дает отклик на приращение концентрации каждого из разделяемых компонентов в зависимости от времени (т.е. DС/Dt от t). В этом случае хроматографический пик является дифференциальной кривой количества компонента, выходящего из колонки (рис. 28) по времени.

Сигнал дифференциального детектора может быть пропорционален или концентрации определяемого компонента в газе-носителе, или потоку этого компонента, т.е. количеству компонента, попадающему в камеру детектора в единицу времени (рис. 29).

Для концентрационного детектора существует прямая пропорциональность между величиной сигнала детектора Е_с и концентрацией компонента в газе-носителе - С:

Е_с = А_сС , (52)

где А_с - коэффициент пропорциональности, характеризующий чувствительность концентрационного детектора.

Для концентрационного детектора площадь регистрируемого пика обратно пропорциональна скорости потока газа-носителя и прямо пропорциональна количеству (массе) компонента. Поэтому при увеличении скорости потока газа-носителя площадь пика уменьшается, а высота пика остается постоянной. Концентрация компонента рассчитывается по величине площади пика.

b – ширина пика у основания

время

сигнал

E_c E_i

C,q

Рис. 28. Форма сигнала Рис. 29. Характер зависимости

дифференциального детектора сигнала детектора от концентрации вещества

В потоковом детекторе сигнал определяется количеством вещества, попадающим в детектор в единицу времени, т.е. потоком вещества q:

E_i = A_i q, (53)

где А_i - коэффициент пропорциональности, характеризующий чувствительность потокового детектора.

Для потокового детектора с увеличением скорости потока газа-носителя величина площади регистрируемого на хроматограмме пика не меняется, а высота пика увеличивается, поскольку при этом увеличивается поток анализируемого компонента.

Площадь пика определяемого компонента в этом случае прямо пропорциональна количеству вещества и скорости потока газа-носителя. Количество определяемого компонента рассчитывается по величине площади пика.

lg u

lg S

Для того, чтобы определить к какому типу детектора относится данный детектор, следует установить характер зависимости показаний детектора от скорости потока газа-носителя. В билогарифмических координатах (логарифм площади пика – логарифм скорости потока газа-носителя) идеальный концентрационный детектор характеризуется линейной зависимостью с углом наклона к оси абсцисс равном 45 ^о, а идеальный потоковый – зависимостью, параллельной оси абсцисс (рис. 30).

Рис. 30. Характер зависимости lg S – lg u для концентрационного (1) и потокового (2) детекторов

Некоторые типы детекторов нельзя отнести к идеальным концентрационным или идеальным потоковым. Для таких детекторов угол наклона билогарифмической зависимости принимает промежуточные значения.

Для решения вопроса о применимости данного детектора необходимо знать его следующие основные характеристики:

· предельную чувствительность (предел обнаружения);

· диапазон концентраций, для которого сохраняется линейность градуировочной характеристики;

· специфическую чувствительность к различным компонентам анализируемой смеси;

· размеры камеры, в которой происходят физические процессы, определяющие сигнал детектора (чувствительный объем).

Рис. 2. Зависимость показаний детектора от расхода подвижной фазы: а) — концентрационного; h1=h2=h3=h; S1 > S2 > S3; б — потокового; h3>h2>h1; S1 = S2 = S3; W1 > W2 > W3 — расходы подвижной фазы.

Сигнал потокового детектора определяется количеством вещества, попадающего в детектор в единицу времени, т. е. потоком вещества, j=dG/dt. Для потокового детектора сигнал aj = Ajj, где Aj — коэффициент пропорциональности, постоянный в линейной области детектора. Для потокового детектора с увеличением расхода ПФ площадь пика не изменяется, а его высота увеличивается, так как при этом увеличивается поток компонента (рис. 2, б).

Можно также выделить массовые детекторы, сигнал которых прямо пропорционален массе поступающего в них вещества. К массовым детекторам относятся все ИД, в которых происходит накопление вещества и, следовательно, сигнала. Следует отметить, что если для концентрационного детектора расход ПФ не остается постоянным, то его нельзя отнести ни к одному из указанных выше типов детекторов. На практике, чтобы установить, является детектор концентрационным или потоковым, строят зависимость показаний детектора от расхода ПФ. Существуют статический и динамический методы определения типа детекторов. При статическом методе обычно при различных расходах ПФ вводят пробы и измеряются площади полученных пиков. Строят зависимости площади пика от расхода (рис. 3, а) или логарифма площади от логарифма расхода ПФ (ряс. 3, б).

Рис 3. Зависимость площади пика от расхода ПФ детекторов: 1— потокового; 2 — концентрационного; 3 — промежуточного.

В логарифмических координатах идеальный концентрационный детектор имеет характеристику в виде прямой с наклоном 45° к оси расходов, а идеальный потоковый детектор — в виде прямой, параллельной оси расходов. Некоторые типы детекторов не всегда можно отнести к потоковому или концентрационному. Для них зависимости площади от расхода имеют промежуточное вначение (рис. 3, б).И потоковые, и концентрационные детекторы широко используются в хроматографии. Так как высота хроматографических пиков для концентрационного детектора не зависит от расхода, можно применять метод измерения высот пиков при постоянной температуре колонки. Для потоковых детекторов проводить анализ хроматограмм по высотам пиков можно только в случае постоянного расхода ПФ. Однако их показания мало зависят от температуры анализа и не зависят от давления, что является их определенным преимуществом по сравнению с концентрационными детекторами. В то же время с помощью концентрационных детекторов можно более точно измерить время удерживания, так как их показания зависят от расхода газа (при ГХ).

9.2. ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТЬ ДЕТЕКТОРА. ПРЕДЕЛ ОБНАРУЖЕНИЯ

Чувствительностью детектора обычно называют отношение величины выходного сигнала детектора к входному сигналу, который определяется количеством вещества, поступающего в детектор вместе с газом-носителем.

Другими словами – чувствительность детектора определяется как коэффициент преобразования детектором величины изменения физико-химического свойства чистого газа-носителя к такому же физико-химическому свойству бинарной смеси компонент – газ-носитель в регистрируемый сигнал.

На рис. 31 представлена зависимость величины сигнала детектора Е от количества введенного в него вещества Q.

Рис. 31. К расчету чувствительности детектора

В этих координатах чувствительность детектора А_с выражается следующим образом:

. (54)

На практике значения величины чувствительности детектора могут быть определены на основании значений параметров процесса разделения и полученных результатов.

Сигнал детектора, а следовательно, и его чувствительность можно увеличить с помощью электронной схемы. Следовательно, чувствительность детектора не является исчерпывающей характеристикой для оценки того минимального количества вещества, которое детектор может надежно регистрировать с хорошей воспроизводимостью, причем, увеличение чувствительности не всегда приводит к снижению этого минимального количества вещества.

Поэтому вводится еще одна величина, характеризующая чувствительность детектора, которая обычно называется порогом чувствительности, пределом детектирования или минимально детектируемым количеством. При этом исходят из того, что порогом чувствительности Q_minназывается такое количество определяемого вещества в газе-носителе, которое обуславливает появление сигнала, равного удвоенной величине шумов.

E_min = 2 . (58)

Таким образом, на практике минимальным сигналом Е_min считается сигнал, амплитуда которого вдвое превышает уровень шумов “d “, фиксируемых регистратором (рис. 32).

Концентрация анализируемого вещества, вызывающая этот сигнал, для концентрационного детектора определяется соотношением:

. (59)

Для потокового детектора минимально определяемое количество вещества определяется соотношением:

. (60)

Учитывая, что

I_min = C_min F, (61)

где F- скорость потока газа-носителя; получаем выражение для расчета минимально определяемой потоковым детектором концентрации:

. (62)

Величина С_min также называется порогом чувствительности и позволяет оценить предельные возможности детектора.

Рис. 32. Определение величины минимального

сигнала детектора

Таким образом, следует различить понятия чувствительность и порог чувствительности. Чувствительность характеризуется наклоном зависимости: сигнал детектора – концентрация вещества, а порог чувствительности – величиной отрезка на оси абсцисс, соответствующего точке пересечения градуировки с ординатой, равной удвоенному уровню шума (2d) (рис. 33).

Далее необходимо учитывать, что порог чувствительности детектора соответствует концентрации вещества в газе-носителе, создаваемой в детекторе, а не концентрации анализируемых веществ в пробе при введении в хроматографическую колонку. Учитывая процесс размывания пробы в ходе разделения, для анализа следует брать вещества в концентрациях, в 5-10 раз превышающих порог чувствительности детектора.

C_min1

C_min2

Рис. 33. Сопоставление характеристик чувствительности и порога чувствительности детекторов

9.3. ЛИНЕЙНОСТЬ ДЕТЕКТОРА

Для определения линейности детектора используют зависимость сигнала детектора от количества (или концентрации) введенного в него вещества.

Обычно эта зависимость имеет вид, приведенный на рис. 34.

Для этой зависимости следует определить верхнюю и нижнюю границу использования данного детектора.

Нижняя граница использования детектора C_minопределяется его пороговой чувствительностью - 2d.

Верхняя граница определяется по положению точки, для которой отклонение от линейности составляет 3 %. Эта точка и называется верхним пределом линейности детектора C_max.

C_min

C_max

Рис. 34. Определение линейного диапазона детектирования

Отношение называют линейным динамическим диапазоном детектора – ЛДД.

9.4. СЕЛЕКТИВНОСТЬ ДЕТЕКТОРА

Селективность детектора определяют как величину отношения чувствительности детектора для одного вещества А - А_А к чувствительности детектора для другого вещества В - А_В:

Детектор считается селективным, если чувствительность детектора для двух веществ различается хотя бы на порядок. Если значение S<10, такой детектор является неселективным или универсальным и используется, как правило, для обнаружения широкого круга соединений, присутствующих в смеси в соизмеримых количествах.

1.3.5.1. Детекторы по теплопроводности

В основе функционирования всех типов детекторов по теплопроводности лежат закономерности передачи тепла от разогретого чувствительного элемента детектора в окружающую газовую среду.

В зависимости от особенностей устройства чувствительного элемента следует различать два основных типа детекторов по теплопроводности:

· детектор с чувствительным элементом, изготовленным в виде проволочки или спирали. Детекторы этого типа получили название катарометрических;

· детектор с чувствительным элементом, роль которого выполняет термистор - термисторные детекторы.

Рассмотрим последовательно особенности этих типов детекторов по теплопроводности.

Детектор по теплопроводности (Катарометр)

Детектор по теплопроводности - (катарометр) является дифференциальным концентрационным детектором. Принцип его действия основан на том, что нагретое тело теряет теплоту со скоростью, зависящей от теплопроводности окружающего газа. Поэтому скорость теплопередачи может быть использована для определения состава газа. При применении катарометра в качестве газа-носителя следует использовать газы, наиболее сильно отличающиеся по коэффициенту теплопроводности от анализируемых веществ. Чаще всего это водород и гелий. Катарометр представляет собой сплошной металлический блок, внутри которого высверлены две одинаковые по конфигурации и объему камеры. В центре каждой камеры помещаются чувствительные элементы детектора, выполненные в виде проволочных или спиральных сопротивлений с абсолютно одинаковыми электрическими характеристиками (рис.35).

Через одну из камер в течение всего процесса хроматографического разделения течет чистый газ-носитель, и эта камера выполняет роль камеры сравнения.

выход газа-носителя

вход газа-носителя

вход газа-носителя из колонки

Рис. 35. Схема устройства камер катарометра

Вторая камера подключается к выходу из хроматографической колонки и является рабочей камерой.

На оба чувствительных элемента от стабилизированного источника питания подается одинаковое по величине постоянное напряжение, в зависимости от численного значения которого чувствительные элементы приобретают соответствующую температуру.

При контакте нагретого чувствительного элемента с окружающей его газовой средой возможна реализация следующих 4 основных механизмов тепловых потерь:

1) передача тепла от нагретого чувствительного элемента к более холодной стенке камеры детектора. Интенсивность отвода тепла в этом случае определяется величиной коэффициента теплопроводности газовой среды в камере, а величина тепловых потерь обозначается как Q₁;

2) передача тепла от нагретого чувствительного элемента за счет конвекции газового потока в камере детектора. При этом основным источником тепловых потерь является принудительная конвекция, в результате которой тепло уносится из ячейки с газом-носителем. Интенсивность потерь тепла в этом случае определяется величиной теплоемкости газового потока и обозначается как Q₂;

3) тепловые потери за счет излучения обозначаются как Q₃ и их величина прямо пропорциональна разности абсолютных температур нагретого чувствительного элемента и стенок камеры детектора в четвертой степени;

4) концевые тепловые потери Q₄ через соединения нагретого чувствительного элемента с проводами, подводящими электрический ток.

Из перечисленных, основными тепловыми потерями, составляющими 75 % от общего теплообмена в ячейке, являются тепловые потери Q₁ и Q₂. Отсюда следует, что наблюдаемая величина тепловых потерь в основном определяется величинами теплоемкости и теплопроводности газового потока, протекающего через камеру детектора.

Таким образом, теоретической основой функционирования детекторов по теплопроводности являются следующие положения:

· при изменении состава газового потока в рабочей камере детектора вследствие изменения величин теплоемкости и теплопроводности, соответствовавших чистому газу-носителю, имеет место изменение величины тепловых потерь и, как следствие, изменение температуры чувствительного элемента.

Величина этого изменения описывается уравнением:

, (63)

где Т_эл - величина изменения температуры чувствительного элемента; Т_эл - температура чувствительного элемента; Т_ст- температура стенки камеры детектора; _г - теплопроводность чистого газа-носителя; _x - теплопроводность анализируемого вещества; х - мольная доля анализируемого вещества в смеси с газом-носителем;

· изменение температуры чувствительного элемента приводит к изменению величины его сопротивления, которые связаны между собой соотношением:

, (64)

где - температурный коэффициент сопротивления материала, из которого изготовлен чувствительный элемент;

· изменение величины сопротивления чувствительного элемента при сохраняющемся постоянным подаваемом напряжении, в соответствии с законом Ома, приведет к изменению величины силы тока на участке цепи, содержащем этот чувствительный элемент.

Таким образом, изменение состава газового потока в рабочей ячейке детектора приводит к изменению первоначальной величины силы тока, которое можно зафиксировать и использовать для регистрации момента выхода разделяемых компонентов из хроматографической колонки, а величину степени изменения первоначальной силы тока использовать для характеристики количества разделяемых компонентов.

Поскольку на практике очень трудно осуществить абсолютное измерение величины тепловых потерь от нагретого чувствительного элемента, обычно применяется разностный метод измерения.

Именно с этой целью два одинаковых по своим электрическим характеристикам чувствительных элемента и объединяются в одном блоке, включаются в общую электрическую схему и являются плечами компенсационного моста Уинстона (рис. 36).

управление током моста детектора

управление чувствительностью

к регистратору

ячейка сравнения

измерительная ячейка

балансировка моста

При пропускании чистого газа-носителя через обе камеры детектора мост оказывается сбалансированным, тепловые потери в обеих камерах одинаковы, величины силы тока в обоих плечах моста также одинаковы и, как следствие этого, регистрируется нулевая линия. Когда выходящая из колонки проба попадает в рабочую ячейку детектора, изменяется теплопроводность и теплоемкость газовой среды в ячейке, что приводит к изменению условий отвода тепла и вызывает изменение температуры чувствительного элемента в рабочей камере.

Изменение температуры, в свою очередь, вызывает изменение величины сопротивления чувствительного элемента, следствием чего является разбаланс моста и возникновение сигнала детектора по теплопроводности.

На практике используют 4 режима работы детектора по теплопроводности:

· режим постоянного тока на чувствительных элементах;

· режим постоянного напряжения на чувствительных элементах;

· режим постоянной температуры чувствительных элементов;

· режим постоянной средней температуры чувствительных элементов.

Установлено, что чувствительность в режиме постоянной температуры в 7-10 раз выше, а отношение сигнала к шуму и пределы детектирования во всех случаях близки.

В режимах постоянного тока и напряжения линейность повышается при высоких концентрациях анализируемых веществ в связи с более высокими потерями тепла на концах чувствительных элементов.

Для получения оптимальных характеристик детектора газ-носитель должен быть как можно чище. Для предохранения элементов детектора от перегорания и окисления необходимо сначала подать поток газа-носителя, а затем включить ток моста и выключать ток моста прежде, чем прекратится подача газа-носителя. По этим же причинам после выключения прибора, особенно после проведения анализа при высоких температурах, рекомендуется продувать газ-носитель до охлаждения детектора с целью предотвращения обратной диффузии воздуха к нагретым элементам детектора.

Для увеличения продолжительности работы элементов детектора по теплопроводности следует работать при минимальной температуре элементов (минимальном токе моста), необходимой для данного анализа.

Для получения максимальной чувствительности следует увеличивать ток моста, принимая во внимание, однако, термическую стабильность и химическую активность анализируемых веществ.

N₂

°C

Рис. 37. Зависимость температуры чувствительных элементов от силы тока моста детектора и природы газа-носителя

Зависимость температуры чувствительных элементов от силы тока моста детектора и используемого газа-носителя приведена на рис. 37.

Пороговая чувствительность детектора по теплопроводности для большинства соединений находится на уровне нескольких микрограммов.

Чувствительность детектора увеличивается пропорционально току моста в третьей степени и разности температур чувствительного элемента и стенки камеры детектора.

Камеры детектора имеют внутренний диаметр 3-6 мм, длину 20-100 мм.

Корпус детектора обычно металлический: нержавеющая сталь, латунь, алюминий.

В соответствии с характером прохождения газа-носителя камеры детектора подразделяются на проточные (рис. 38 а), диффузионные (рис. 38 б) и проточно-диффузионные (рис. 38 в).

а б в

Рис. 38. Проточные (а), проточно-диффузионные (б) и диффузионные (в) камеры катарометра

Проточные камеры малоинерционны (постоянная времени меньше 1 с), однако чувствительны к колебаниям скорости потока газа-носителя.

Диффузионные камеры обладают большей инерционностью (постоянная времени до 20 с), однако практически нечувствительны к изменению расхода газа-носителя через детектор.

Проточно-диффузионные камеры обладают промежуточными характеристиками.

Чувствительные элементы катарометра могут быть двух типов: в виде нитей (рис. 39 а) и в виде спиралей (рис. 39 б).

Иногда чувствительные элементы изготавливаются в виде биспиралей (рис. 39 в).

Нитевые элементы характеризуются очень малой инерционностью, однако достаточно трудно получить большую величину сопротивления прямой нити. В этой связи чаще используются спиральные элементы, величина сопротивления которых достигает 100 и более Ом. Увеличение сопротивления чувствительного элемента способствует повышению его чувствительности.

Изготавливают спирали чаще всего из никеля, золоченого вольфрама, сплава платина-иридий, тефлонированного вольфрама, т.е. материалов, характеризующихся высоким температурным коэффициентом сопротивления a. Железо, хотя и имеет высокое значение a, легко окисляется; из висмута и сурьмы спирали изготовить невозможно.

Рис.39. Чувствительные элементы катарометра:

а – нитевые, б – спиральные, в – биспиральные

Для успешной работы с детектором по теплопроводности рекомендуется в качестве газа-носителя использовать гелий, поскольку в ряду используемых газов-носителей гелий характеризуется величиной теплопроводности близкой к водороду, имеет большое отличие по этому параметру от разделяемых соединений, что позволяет обеспечить более высокую чувствительность при их обнаружении и установлении количественного содержания.

В табл. 7 приведены величины теплопроводностей газов-носителей и паров некоторых из разделяемых соединений, рассчитанные относительно теплопроводности воздуха.

Т а б л и ц а 7 Величины теплопроводностей газов-носителей и паров веществ

водород	7.100	н-бутан	0.744
гелий	5.530	метанол	0.727
метан	1.450	н-пентан	0.702
аммиак	1.040	углекислый газ	0.700
воздух	1.000	этанол	0.700
азот	0.996	н-гексан	0.662
этан	0.970	ацетон	0.557
ацетилен	0.900	хлорметан	0.530
пропан	0.832	трихлорметан	0.328

Поскольку каждое из разделяемых соединений характеризуется индивидуальными величинами теплоемкости и теплопроводности, величина сигнала детектора при использовании одного и того же газа-носителя для одинаковых концентраций различных соединений будет различной.

Следовательно, для количественных определений регистрируемые величины площадей хроматографических пиков разделяемых компонентов должны умножаться на величины поправочных коэффициентов, предварительно экспериментально установленных для каждого из исследуемых соединений в выбранных условиях процесса разделения.

В практической хроматографии эти коэффициенты получили название специфических поправочных коэффициентов и при использовании детектора по теплопроводности являются весовыми поправочными коэффициентами.

Рассчитываются величины весовых поправочных коэффициентов исходя из установленных для каждого соединения величин относительных молярных поправочных коэффициентов f_Mi.

Величины относительных молярных поправочных коэффициентов определяются как отношение площадей пиков соответствующих данному веществу и 1,3-дифенилбензолу при их равных молярных концентрациях. При этом предполагается, что для 1,3-дифенилбензола величина относительного поправочного коэффициента принимается равной единице.

Величины относительных молярных поправочных коэффициентов, отнесенные к 1 г массы вещества, дают значение весовых поправочных коэффициентов f_mi.

Между весовым и молярным относительными поправочными коэффициентами, таким образом, существует следующая взаимосвязь:

f_mi = f_Mi , (65)

где M_i и M_B - молекулярные массы исследуемого соединения и 1,3-дифенилбензола соответственно.

В качестве примера весовые поправочные коэффициенты для некоторых веществ приведены в табл. 8:

Т а б л и ц а 8 Значения весовых поправочных коэффициентов

1.3-дифенилбензол	1.00	этанол	0.72
метан	0.45	ацетон	0.68
этан	0.59	бензол	0.78
гептан	0.70	вода	0.55
тетрадекан	0.85	аммиак	0.42
метанол	0.64	кислород	0.80

К приведенным в литературе данным по величинам весовых поправочных коэффициентов следует подходить критически, так как их численные значения сильно зависят от геометрии детектора и существующих в нем аэродинамических условий.

Основные характеристики детектора по теплопроводности, определенные по отношению к пропану следующие:

· коэффициент чувствительности - 2×10⁸;

· минимальная определяемая масса - 7×10^-6 г;

· минимальная определяемая концентрация - 1.5 объемных %;

· линейный диапазон детектирования 10⁵.

Термисторный детектор

Разновидностью детектора по теплопроводности является термисторный детектор. Чувствительным элементом детектора является термистор.

Рис. 40. Устройство термисторного детектора, микродетектора и комбинированного детектора

Это шарик диаметром около 0.5 мм, изготовленный из смеси оксидов марганца, кобальта, никеля со специальными добавками для получения необходимых электрических характеристик. Термистор покрывается тонкой стеклянной оболочкой для защиты от разрушающего действия газа-носителя и анализируемых веществ. За счет увеличения сопротивления термистора может быть реализована более высокая чувствительность, чем у катарометра.

Существует возможность создания микродетектора с очень малым внутренним объемом камеры (рис. 40), а также комбинированного детектора.

Детектор по плотности. Универсальным является также детектор по плотности (денситометр, плотномер), в котором поток газа-носителя поступает в камеру детектора (1) и омывает чувствительные элементы (2), которыми могут быть как проволочные элементы, так и термисторы. Газ-носитель, прошедший через хроматографическую колонку и содержащий компоненты анализируемой пробы, встречается с чистым газом-носителем после прохождения последним чувствительных элементов, подключенных в мост Уинстона. Если газ-носитель, прошедший через колонку, не содержит посторонних веществ и, следовательно, его плотность одинакова с плотностью чистого газа-носителя, то газовые потоки находятся в равновесии и сигнал отсутствует. Если плотность газа-носителя ввиду присутствия в нем анализируемых веществ растет, то его поток направляется вниз камеры детектора, уменьшая скорость нижнего потока и увеличивая скорость верхнего. Нарушение баланса потоков вызывает изменение сопротивления чувствительных элементов, вследствие чего возникает сигнал.

Большим достоинством детектора по плотности является возможность проведения количественного анализа без калибровки детектора. По интенсивности сигнала можно рассчитать содержание компонентов q в пробе, если площади пиков S умножить на поправочные коэффициенты, которые связаны с молекулярными массами анализируемых веществ М_s и газа-носителя М_г:

, (1.52)

где ,

b - константа данного прибора.

Выбор газа-носителя для ДП имеет большое значение. Наилучшими газами-носителями являются газы с низкой теплопроводностью и высокой теплоемкостью. Это необходимо для того, чтобы тепло от нагреваемых чувствительных элементов отводилось в основном за счет уноса его с газом-носителем, а детектор был бы чрезвычайно чувствительным к изменениям потока. Поэтому для получения высокой чувствительности на ДП применение газов-носителей Не и Н₂ не рекомендуется. Однако при использовании таких газов, как Аг, N₂ и СО₂, чувствительность детектора не хуже, чем чувствительность ДТП с газами-носителями Н₂ и Не. Это является большим преимуществом ДП, так как Не сравнительно дорогой газ, а Н₂ – взрывоопасен. Кроме того, следует также иметь в виду, что газ-носитель и анализируемые вещества должны значительно различаться по молекулярной массе.

Для ДП характерен высокий линейный диапазон (5-10⁵) и возможность расчета по его показаниям количества компонента, если известна его молекулярная масса. Поэтому при работе с ДП не требуется проведения калибровки, кроме введения 5% поправки для газа-носителя водорода, учитывающей его высокую теплопроводность. С применением двух и более газов-носителей могут быть рассчитаны молекулярные массы анализируемых соединений с целью их идентификации.

ДП используют для определения молекулярных масс соединений с температурой кипения до 400 °С. Погрешность определения составляет около 4%, что вполне достаточно для большинства случаев идентификации компонентов по их молекулярной массе.

Пламеино-фотометрический детектор (ДПФ)

Впервые пламенно-фотометрический детектор (ДПФ) был предложен для обнаружения серы и фосфорсодержащих соединений в воздухе в 1962 г. В 1966 г. был создан первый ДПФ специально для газовой хроматографии.

В связи с высокой чувствительностью при детектировании серо- и фосфорсодержащих соединений ДПФ широко применяют в хроматографической практике. Принцип действия детектора основан на возбуждении анализируемых соединений в обогащенном по водороду пламени. При возвращении возбужденных молекул в основное состояние возникает эмиссия света на определенной длине волны, характерной для данного соединения. Интенсивность характеристической длины волны является количественной мерой испускающего ее соединения. Эмиссия света регистрируется фотоумножителем, который выдает сигнал в виде хроматографического пика. Основное применение ДПФ нашел для анализа серосодержащих органических и неорганических соединений. ДПФ достаточно чувствителен и селективен также к галогенам, азоту, бору, таким металлам, как олово, хром, селен и германий. ДПФ был использован для анализа алифатических вторичных аминов и их производных. Такие соединения, как СО, СО₂, N₂0₄, S0₂, N₂F₄, HF, CS₂, H₂S, которые практически не определяются с помощью пламенно-ионизационного детектора анализируются на ДПФ с высокой чувствительностью.

Пламя в ДПФ выполняет три функции: в горячей зоне пламени исходные соединения, содержащие серу, разлагаются; из продуктов разложения прямо или косвенно выделяются атомы серы; в более холодной зоне пламени образуются возбужденные молекулы серы S₂^*. Можно представить следующие реакции, происходящие в ДПФ:

а) на первой стадии в горячей области водородного пламени происходит разложение исходных серосодержащих соединений (S-R) с образованием атомов серы или сероводорода:

б) на второй стадии происходят различные обратимые реакции в верхней части пламени с образованием S₂:

в) на третьей стадии молекулы серы возбуждаются по одному из механизмов:

(рекомбинация атомов водорода),

(образование воды),

(двойное сочетание).

г) на четвертой стадии в холодном внешнем конусе пламени возбужденная молекула серы возвращается в основное состояние и происходит излучение света в диапазоне длин волн от 300 до 450 нм:

Наиболее интенсивные полосы эмиссии серы приходятся на 384,0 и 394,1 нм. Имеются и другие пики средней интенсивности при 374,1; 404,7 и 415,0 нм.

Основными узлами детектора являются водородная горелка. В корпус (1) ДПФ подается газ-носитель из хроматографической колонки, водород и воздух. В детекторе предусмотрены спираль для поджига пламени и светонепроницаемая крышка (3). Эмиссия пламени через кварцевую трубку (2), тепловой фильтр (4) и оптический фильтр (5) попадает на фотоумножитель (6) и далее сигнал передается на регистрирующее устройство. Для анализа соединений, содержащих Р и S, пригодны оптические фильтры, пропускающие максимальную длину волны 526 и 394 нм, соответственно. Иногда используют двухканальные детекторы, на которых при наличии одного пламени можно одновременно регистрировать Р и S, применяя два разных оптических фильтра и два фотоумножителя.

Зависимость сигнала (I) ДПФ от массы попадающего в детектор содержащего серу анализируемого вещества (т) нелинейна и выражается уравнением:

где К и п – постоянные для выбранных экспериментальных условий.

В большинстве случаев значения п равны 1,5–2. Линейный динамический диапазон для ДПФ обычно составляет 10². Предел обнаружения для соединений, содержащих фосфор, обычно составляет около 1∙10^-12г фосфора. Предел обнаружения галоген содержащих соединений составляет 1∙10^-11 моль.

Чувствительность ДПФ зависит от интенсивности эмиссии света, связанной с хемилюминесценцйей. Интенсивность эмиссии увеличивается с уменьшением температуры пламени и увеличением расхода водорода в диффузном пламени. Температура пламени уменьшается с относительным уменьшением массы горючих газов и увеличением теплопроводности газа-носителя (Н₂или Не по сравнению с N₂). Если расход горючих газов уменьшается, фоновый ток и уровень шумов ДПФ также уменьшаются, при этом отношение сигнала к шуму становится больше. Предполагают, что показания ДПФ пропорциональны концентрации Н₂ в третьей степени. По этой причине обычно работают при высоких концентрациях Н₂ и точном контроле расхода. Максимальная концентрация Н₂ лимитируется нестабильностью пламени, которое может погаснуть при выходе пиков растворителя или основных компонентов. При использовании Н₂ в качестве газа-носителя для капиллярных колонок важно поддерживать поток постоянным с целью проведения количественных измерений с малой погрешностью. Предпочтителен в качестве газа-носителя Не по сравнению с Н₂.

3.3.3 Принципы ионизационного детектирования

Ионизационные методы детектирования наиболее универсальны, с высокой чувствительностью, используются для определения малых количеств анализируемых веществ, пригодны для соединения как с капиллярными, так и насадочными колонками.

В основе этих методов лежит зависимость электрической ионизированной газовой среды от ее состава. Сигналом ионизационных детекторов является изменение силы тока, вызванное введением в детектор анализируемого вещества. Ионный ток – электрический ток, создаваемый между электродами детектора всеми заряженными частицами (ионами или электронами) в газе.

Ионный ток возникает в детекторе под действием какого-либо источника ионизации (радиоактивного изотопа, пламени, разряда, фотоио-низации, электронной и ионной эмиссии) и электрического поля (разности потенциалов) между электродами детектора.

В любой момент времени в детекторе достигается равновесие, характеризующиеся тем, что скорость образования заряженных частиц рав на сумме скоростей рекомбинации и сбора заряженных частиц на электродах детектора. Скорость сбора определяет ток детектора. В ионизационных детекторах создаются такие условия, при которых либо плотность (концентрация) заряженных частиц, либо скорость переноса их в электрическом поле зависит от состава газа.

Зависимость силы тока (I) в газовой среде от приложенного напряжения (U) называется вольт-амперной характеристикой (рис. 12).

I-зона – слабое поле – неполный сбор заряженных частиц со значительной частью их рекомбинации. При постоянной скорости образования и рекомбинации заряженных частиц в детекторе и постоянном напряжении на электродах ток детектора определяется скоростью переноса заряженных частиц в направлении поля. Скорость зарядов в направлении поля характеризуется подвижностью, которая численно равна скорости, приобретаемой зарядом в поле напряженностью 1В/см. Подвижность пропорциональна величине заряда и обратно пропорциональна массе частиц.

Попадая в детектор вещество вызывает увеличение числа рекомбинаций и уменьшение подвижности заряженных частиц. При этом ток детектора падает. Это уменьшение тока регистрируется на хроматограмме как пик данного вещества. На этом принципе основана работа детектора электронного захвата (ДЭЗ).

Следующая зона – участок насыщения (II зона), для которого характерно отсутствие рекомбинации и полный сбор всех образующихся заряженных частиц. В этом случае ионный ток определяется только скоростью образования зарядов. Сигналом детекторов, работающих на этом участке вольт-амперной характеристики, является увеличение тока, вызванное значительным возрастанием скорости образования заряженных частиц вследствие ионизации анализируемых компонентов, поступающих в детектор. При этом ионизация газа-носителя должна отсутствовать и уровень фонового тока должен быть минимальным. Представителями этого типа детекторов является ДИП, термоионный (ДТИ), пламенно-фотометрический детектор (ПФД) и др.

Последний участок (III зона) при введении в детектор анализируемых веществ характеризуется высокой напряженностью поля за счет размножения зарядов (вторичной ионизации). В этой области работают аргоновые и гелиевые ионизационные детекторы.

1.3.5.3. Пламенно-ионизационный детектор

Пламенно-ионизационный детектор (рис. 41) является одним из наиболее распространенных и популярных детекторов в газовой хроматографии. Впервые он был предложен в 1958 году, и с тех пор этот детектор по некоторым своим характеристикам не был превзойден ни одним из вновь предложенных детекторов.

Принцип работы детектора заключается в том, что при обычных условиях газы не проводят электрический ток, но если в результате какого-либо воздействия в газе образуются ионы, радикалы или свободные электроны, то даже при очень небольшой концентрации этих частиц газы становятся проводниками электрического тока.

К потенциальному электроду прилагается напряжение для сбора ионов, а с коллекторного электрода снимается сигнал детектора.

Рис. 41. Схема устройства пламенно-ионизационного детектора

В пламени чистого водорода число ионов очень мало, сопротивление межэлектродного пространства очень велико (10¹⁴ – 10¹⁵ Ом) и ток детектора весьма мал (10^-12 – 10^-11 А).

Этот ток возникает за счет ионизации примесей, содержащихся в газе-носителе, водороде и воздухе, и является постоянным фоновым током детектора.

При горении чистого водорода в пламенно-ионизационном детекторе протекают следующие процессы, приводящие к образованию ряда элементарных частиц:

Н₂ + 2 О₂→2 О + 2 ОН

Н₂ + О→ Н + ОН

Н₂ + ОН→ Н₂О + Н

Продукты этих процессов уносятся из камеры детектора избытком воздуха.

Если в водородное пламя из хроматографической колонки попадают органические соединения НОРГ, то сначала они подвергаются пиролизу в достаточно горячей, однако неокисляющей зоне пламени. В результате процесса пиролиза образуются в основном радикалы СН*

HOPГ →CH*

Далее, в окислительной зоне пламени эти радикалы реагируют по следующей схеме:

СН* + О →СНО⁺ + е^-

с образованием положительно заряженных молекулярных ионов и электронов, обеспечивающих протекание электрического тока в цепи, т.е. появление сигнала детектора.

Следует учитывать, что концентрация заряженных частиц в пламени, а следовательно, и величина сигнала может уменьшаться в результате протекания реакций рекомбинации:

CHO⁺ + H₂O→ CO + H₃O⁺

H₃O⁺ + e^- →H₂O + H

Из последних реакций рекомбинации следует, что величина сигнала детектора зависит от концентрации воды в анализируемой пробе. Поэтому, поскольку вода этим детектором не обнаруживается, при количественном анализе важно знать, не находится ли анализируемый компонент на хроматограмме вблизи области элюирования воды, возможно, присутствующей в пробе в довольно больших количествах.

Если в анализируемых соединениях присутствуют такие гетероатомы, как галогены, сера, фосфор, азот, то возможны и другие реакции рекомбинации.

Корпус детектора обычно представляет собой металлический цилиндр, который должен разбираться таким образом, чтобы был возможен удобный доступ к электродам и горелке детектора.

Горелки детектора обычно изготавливаются либо из нержавеющей стали, либо из никеля или кварца. К материалу горелки предъявляются следующие требования: он должен обладать термической и химической стабильностью и не должен плавиться при температуре водородного пламени.

Рис. 42. Варианты взаимного расположения электродов детектора

Форма пламени имеет большое значение для работы детектора и определяется его конструкцией. Варианты взаимного расположения электродов и пламени приведены на рис. 42.

Существует определенное оптимальное соотношение между расходами водорода, воздуха, газа-носителя и диаметром сопла горелки. При работе с насадочными колонками и при расходе газа-носителя 30-50 см³/мин этот диаметр обычно составляет 0.5-0.8 мм.

Для капиллярных колонок применяют горелки с выходным отверстием диаметром около 0.3 мм.

Электроды детектора с целью увеличения их термической и химической стабильности обычно изготавливают из никеля или нержавеющей стали и полируют. Расстояние между электродами определяется размером пламени и влияет на чувствительность, уровень шумов и напряжение питания.

Поскольку пламенно-ионизационный детектор применяется при температурах выше 500 ^оС, к изоляторам электродов предъявляются достаточно жесткие требования. Их изготавливают чаще всего из керамики и размещают в достаточно горячей части детектора. Иногда изолятор предохраняют от контакта с потоком газа-носителя и пробы из колонки, и с продуктами их сгорания. Такое размещение изолятора позволяет работать с детектором длительное время без его очистки и ухудшения характеристик детектора. Для дополнительного охлаждения изоляторов их выносят в холодную зону или обдувают потоком инертного газа.

Отрицательный электрод не должен раскаляться в пламени во избежание термоионной эмиссии с металлической поверхности отрицательного электрода. Расстояние между электродами не имеет большого значения, поскольку влияет только на напряжение, необходимое для достижения тока насыщения. Например, при обычно применяемых расстояниях от 10 до 12 мм может потребоваться напряжение от 40 до 180 В.

При расстоянии выше 15 мм наблюдается увеличение уровня регистрируемых шумов.

Для обеспечения работы пламенно-ионизационного детектора необходимы газ-носитель, водород, воздух. В качестве газа-носителя чаще всего используется азот или гелий, иногда применяется водород.

Основные требования, предъявляемые к используемым газам следующие: отсутствие примесей органических веществ, отсутствие солей щелочных металлов, отсутствие частичек пыли.

Для получения нужной температуры пламени необходимо поддерживать правильное соотношение между водородом и воздухом. Недостаток воздуха приводит к неполному сгоранию водорода и уменьшению чувствительности, избыток воздуха приводит к увеличению шумов детектора, что связано с появлением турбулентности потока.

Чувствительность пламенно-ионизационного детектора очень высока по отношению ко всем органическим веществам.

Пламенно-ионизационный детектор является одним из наиболее линейных детекторов в газовой хроматографии. По различным оценкам, его линейный диапазон детектирования составляет 10⁶-10⁷.

Элементарные стадии процесса детектирования позволяют полагать, что пламенно-ионизационный детектор чувствителен не столько к массе определяемого органического соединения, сколько к структуре и количественному соотношению структурных групп, которые совместно и определяют выходной сигнал, соответствующий данной массе вещества.

Поэтому при количественных определениях следует учитывать значения величин поправочных коэффициентов в полученную величину площади пика.

Величины поправочных коэффициентов могут быть либо определены экспериментально, либо рассчитаны теоретически на основании величин относительной молярной чувствительности (ОМЧ).

При экспериментальном определении поправочных коэффициентов исходят из того, что для соединений с более чем шестью-семью атомами углерода в молекуле, связанными с атомами водорода, величина поправочного коэффициента равна единице и, следовательно, соотношение анализируемых компонентов, найденное на основе измерения площади пиков ( в % ), равно их процентному отношению по массе.

Тогда, зная величину отношения числа молей стандарта (М_ст) и исследуемого соединения (М_х) из соотношения

, (66)

приняв величину К_ст = 1, рассчитывают величину поправочного коэффициента для вещества Х – К_х.

Система теоретического расчета величин относительной молярной чувствительности была предложена Акманом. В этой системе каждой группе -СН₂- алифатического соединения приписывается значение вклада в суммарную величину относительной молярной чувствительности, равное 100 единицам.

Тогда, например, для гептана величина относительной молярной чувствительности оказывается равной 700.

Т а б л и ц а 9

Значения инкрементов функциональных групп и связей

В табл. 9 приведены значения инкрементов для наиболее встречающихся функциональных групп и связей. При теоретическом расчете ОМЧ исследуемое соединение делится на фрагменты и в… Нерегистрируемыми считают такие атомы углерода, которые наряду с одной связью с водородом имеют двойную связь с…

Величины относительных молярных поправочных коэффициентов

Пламенно-ионизационный детектор не дает показаний для следующего ряда соединений: COS, CS2, H2S, NO, NO2, NH3, CO, CO2, H2O, SiCl4, SiHCl3, SiF4. … В случае присутствия в анализируемой пробе указанных соединений… Пламенно-ионизационный детектор – типичный представитель классического потокового детектора.

Величины относительных коэффициентов захвата электронов

Линейный диапазон детектирования детектора электронного захвата 102 – 104, предел обнаружения по линдану – 10-14 г/c. Детектор электронного захвата – потоковый детектор. Детектор электронного захвата применяют для анализа:

Фотоионизационный детектор (ДФИ)

Проведено изучение работы ДФИ с различными газами-носителями, определены его линейности и чувствительности для большого круга органических веществ.… Принцип работы ДФИ состоит в следующем: фотоны от ультрафиолетовой (УФ) лампы… Теоретические вычисления чувствительности ДФИ не дают достоверных результатов. Однако практически установлено, что ДФИ…

Силы дисперсионного взаимодействия

, (84) где k - коэффициент пропорциональности, зависящий от потенциала ионизации… Поскольку каждая частица обладает определенной поляризуемостью, дисперсионные силы проявляются при взаимодействии…

Силы ориентационного взаимодействия

. (87) Под взаимодействующими частицами в данном случае подразумеваются химически… В отличие от дисперсионных и индукционных сил для ориентационных сил характерна векторная природа, т.е. энергия…

Силы полухимического и химического взаимодействий

Образование водородных связей имеет место в том случае, когда молекулы, находящиеся на поверхности адсорбента, имеют, например, протоно-донорные… Образование комплексов переноса заряда происходит тогда, когда адсорбируемая… И, наконец, хемосорбция – процесс адсорбции, протекающий за счет образования прочной химической связи – ковалентной…

Классификация адсорбентов по способности к различным типам межмолекулярных взаимодействий

Адсорбенты можно рассматривать как большие молекулы, поэтому их удобно классифицировать по такому же принципу, как и разделяемые соединения, т.е. рассматривать их как соответствующих партнеров в межмолекулярном взаимодействии с адсорбатами.

В этой связи специфичность взаимодействия адсорбентов с молекулами разделяемых соединений связана прежде всего с химией поверхности адсорбентов.

Таким образом, целесообразно, также в некоторой степени условно, выделить три основных типа адсорбентов:

1 тип – неспецифические неполярные адсорбенты – насыщенные углеводороды (кристаллические, полимерные), а также химически инертные поверхности атомных решеток (в частности, базисная грань графита);

2 тип – специфические адсорбенты с локализованными на поверх-ности положительными зарядами или другими электроно-акцепторными центрами.

Это, например, адсорбенты, на поверхность которых выходят функциональные группы протонных кислот (например, гидроксилированная поверхность кремнезема), а также адсорбенты с апротонными кислотными центрами.

На таких адсорбентах молекулы группы А в отсутствии химических реакций адсорбируются неспецифически, а молекулы групп В и С адсорбируются специфически.

3 тип – специфические адсорбенты, несущие на поверхности отри-цательные заряды: грани кристаллов, образованные преимущественно анионами, или поверхности пористых полимеров с выходящими наружу нитрильными, карбонильными или эпоксигруппами.

Классификация адсорбентов по особенностям внутренней геометрической структуры

Кроме химической структуры следует учитывать и особенности внутренней геометрической структуры адсорбентов.

С этой точки зрения адсорбенты делятся на две группы:

первая группа - непористые адсорбенты;

вторая группа - пористые адсорбенты, подразделяющиеся на однородно пористые и неоднородно пористые.

Пористые адсорбенты отличаются от непористых наличием системы пор, имеющих характерную структуру. Форма и ширина пор могут быть самыми разными: это могут быть и микроскопические углубления, и бороздки глубиной порядка 1 мкм, и пустоты, диаметр которых близок к диаметру молекулы адсорбируемого соединения.

Структура пустот играет важную роль в адсорбции.

Размеры отверстий пор влияют на массообмен, т.е. на скорость переноса вещества к внутренней поверхности, на которой происходят процессы адсорбции и десорбции, наиболее важные для осуществления процесса газохроматографического разделения.

Независимо от химического состава адсорбента его внутреннюю структуру принято оценивать следующими параметрами:

· геометрическая площадь поверхности стенок пор, приходящихся на 1 грамм адсорбента (удельная поверхность S_а);

· общий объем пор, приходящийся на 1 грамм адсорбента (удельный объем пор V_р);

· средний диаметр пор d₅₀, который определяется как такой диаметр, по отношению к которому поры с меньшим и большим диаметром составляют половину общей пористости;

· распределение пор по величине диаметра (функция распределения dV_p / dd₅₀ ).

Если рассматривать важное для процессов адсорбции на пористых материалах отношение среднего диаметра пор к диаметру молекул разделяемых соединений, то следует отметить две крайние ситуации:

· Средний диаметр пор по порядку величины значительно больше размеров адсорбированной молекулы. В этом случае адсорбционное равновесие устанавливается очень быстро.

· Средний диаметр пор мало отличается от диаметра молекулы.

В этом случае скорость процесса адсорбции зависит от размеров адсорбируемых молекул и формы пор адсорбента. В узких порах адсорбированные молекулы одновременно взаимодействуют с адсорбционными центрами, расположенными на противоположных стенках пор.

Такой подход приводит к делению пористых адсорбентов на три группы:

· микропористые адсорбенты, для которых величина d₅₀ < 3 нм, а S_a > 500 м²/г;

· мезопористые адсорбенты с порами переходного диаметра от 3 до 200 нм;

· макропористые адсорбенты, для которых величина d₅₀ > 200 нм, а S_a < 10 м²/г;

Для того чтобы массообмен проходил достаточно быстро, адсорбент должен быть преимущественно макропористым. В то же время большая удельная поверхность обуславливает высокий коэффициент емкости, а следовательно, и критерий разделения. В этой связи приходится искать оптимальные соотношения между желаемым временем анализа и степенью разделения.

Таким образом, если сформулировать основные требования, которые предъявляются к адсорбентам, то следует отметить следующие:

· высокая химическая, механическая и термическая стабильность;

· адсорбционная активность должна быть известна и должна соответствовать области применения;

· поверхность адсорбента должна быть физически и химически однородна;

· распределение пор по размерам должно быть равномерным;

· свойства адсорбента должны быть легко воспроизводимы;

· адсорбент должен характеризоваться селективностью по отношению к разделяемым соединениям;

· размеры гранул адсорбента должны быть оптимальными для обеспечения высокой скорости диффузии разделяемых веществ и плотности упаковки колонки.

12.4. ВАЖНЕЙШИЕ АДСОРБЕНТЫ И ХАРАКТЕРИСТИКА ИХ СВОЙСТВ

Наиболее часто используемые в газовой хроматографии твердые адсорбенты целесообразно разделить на четыре группы:

· углеродные адсорбенты;

· адсорбенты с высоким содержанием кремниевой кислоты;

· оксид алюминия;

· органические адсорбенты.

Углеродные адсорбенты

· графитированная термическая сажа; · активированный уголь; · углеродные молекулярные сита;

Адсорбенты с большим содержанием кремниевой кислоты

Основными представителями этой группы адсорбентов являются: силикагель, пористые стекла, цеолитовые молекулярные сита.

Силикагель представляет собой аморфный продукт конденсации поликремниевых кислот и характеризуется очень высокой величиной удельной поверхности. На поверхности силикагеля находятся силанольные группы Si-OH, проявляющие кислотные свойства, а также силоксановые группы Si-O-Si , являющиеся донорами электронов.

На 1 нм² поверхности силикагеля приходится от 4 до 8 геминальных, вицинальных и изолированных силанольных групп:

HO OH HO OH OH

Si O Si

Si Si

геминальные вицинальные изолированные

В большинстве случаев силикагель во влажном состоянии получают нейтрализацией растворов силиката натрия минеральными кислотами. Изменением рН можно регулировать диаметр пор образующегося геля. После промывки и нагревания образуется твердый пористый силикагель, структуру пор которого можно модифицировать гидротермальной или химической обработкой кислотами.

Высокодисперсные образцы силикагеля с малой плотностью назы-вают аэрогелями.

Силикагель можно также получать пирогенным методом: так, например, получают аэросил из хлорида кремния.

Высокая концентрация свободных гидроксильных групп с частич-но протонированным водородом является причиной того, что силикагель специфически адсорбирует молекулы с высокой электронной плотностью (спирты, эфиры, кетоны и амины), а также неполярные молекулы с поляризующимися p-связями (ароматические соединения, олефины).

Адсорбционная активность силикагеля зависит от содержания в нем воды и снижается по нелинейному закону при увеличении ее количества.

На поверхности гидратированного силикагеля в обычных условиях адсорбирован полимолекулярный слой воды.

Третий от поверхности силикагеля – слой слабо адсорбированной воды, обратимое ее удаление происходит от комнатной температуры до 70 ^оС. Этот слой воды удаляется сухим растворителем.

O H

-О-Si-OH … O-H … O-H … O-H

O H H

носитель

Второй слой также слабо адсорбированной воды полностью удаляется при 120 ^оС, максимум удаления при 100 ^оС. Процесс является обратимым. Этот слой также удаляется сухим растворителем.

Первый слой – слой сильно адсорбированной за счет водородной связи воды. Удаление этого слоя начинается при 200 ^оС и завершается при 650 ^оС. Процесс является обратимым, этот слой не удаляется сухим растворителем.

В процессе нагревания силикагеля силанольные группы Si-OH теряют воду и превращаются в силоксановые Si-O-Si . Потеря воды – процесс необратимый; начинается при 450 ^оС и завершается при температуре 1100 ^оС.

В хроматографии силикагель применяется как в неактивном (полностью гидратированный), так и активном состоянии (безводный). В активном состоянии его используют для разделения смесей углеводородов, в неактивном состоянии – для разделения смесей полярных соединений.

Основными преимуществами силикагеля являются:

· практическое отсутствие каталитической активности;

· способность к модифицированию поверхности с помощью химических реакций.

Модифицирование поверхности силикагеля заключается в замещении силанольных групп на другие функциональные группы.

Это позволяет наряду с устранением мешающих активных центров и повышением однородности поверхности адсорбента оказывать направленное воздействие на величину полярности этой поверхности.

С другой стороны, появляется возможность получения неподвижных жидких фаз, закрепленных на носителе и используемых в газо-жидкостной хроматографии и в высокоэффективной жидкостной хроматографии.

Пористые стекла. Нагреванием натрийборосиликатных стекол (обычный состав – 70 % SiO₂, 23 % B₂O₃, 7 % Na₂O) при 1400 ^оС получают гомогенный расплав, распадающийся при 500-600 ^оС на две фазы, одна из которых состоит из практически чистого диоксида кремния, а вторая из бората натрия, как бы пронизывающего скелет диоксида кремния.

После охлаждения боратно-натриевую фазу вымывают разбавленными кислотами и получают поликремниевый скелет.

Поскольку структуру пористых стекол можно регулировать, меняя состав исходного стекла и условия процесса, этим методом получают пористые стекла с воспроизводимым диаметром пор с размером от диаметра молекулы до нескольких нанометров, причем с абсолютно одинаковым размером пор как на поверхности, так и внутри зерен.

Следует иметь в виду, что стекла с внутренними порами имеют существенный недостаток, мешающий экспресс-анализу: процесс проникновения разделяемых молекул внутрь зерна протекает сравнительно медленно, что замедляет массообмен.

Стекла с поверхностными порами, которые можно получить целенаправленным выщелачиванием раствором соляной кислоты, не имеют этого недостатка.

Цеолитовые молекулярные сита. Природные и синтетические цеолиты представляют собой кристаллические алюмосиликаты с трехмерной структурой из тетраэдров SiO₄ и AlO₄, объединенных в те или иные полиэдры.

Общая формула цеолитов следующая:

M_2/_nO, Al₂O₃, xSiO₂, yH₂O,

где М - щелочной или щелочноземельный металл; n - степень его окисления.

Наиболее распространены цеолиты формулы:

Na₂O, СаО, Al₂O₃, xSiO₂, yH₂O.

Цеолиты относятся к группе микропористых скелетных силикатов с большой внутренней удельной поверхностью (700-800 м²/г). Эта поверхность образована ионами, которые несут значительные положительные и отрицательные заряды и придают ей гидрофильность.

Характерной особенностью цеолитов является строго регулярная система пор – набор больших одинаковых пустот, связанных между собой однородными микропорами с шириной окон порядка диаметра молекулы. Заполняющая пустоты гидратная вода слабо связана с решеткой и удаляется при нагревании без заметного изменения структуры цеолита.

Ввиду многообразия комбинаций катионов, возможности изменения отношения Si/Al, а также различных допустимых вариантов построений каркаса, класс цеолитов весьма велик и разнообразен.

В цеолитах марки А трехмерные структурные единицы соединяются через четырехчленные кислородные кольца, в цеолитах Х и Y они соединяются через шестичленные кислородные кольца.

Для цеолитов Х характерно отношение Si/Al от 1.0 до 4.0, а для цеолитов Y – от 2 до 3. Стенки пор образованы атомами кислорода и входные окна в поры могут в различной степени блокироваться катионами. Меняя катионы, можно направленно изменять величину диаметра пор.

В газовой хроматографии наиболее часто применяются молекулярные сита марок 5А, 10Х и 13Х со средними геометрическими размерами пор 5, 7 и 9 ангстрем.

Оксид алюминия

Из-за наличия кислотных и основных (по Льюису) центров его поверхность имеет гетерополярный характер. Адсорбент существует в нескольких полиморфных модификациях, из которых… Получают оксид алюминия обезвоживанием гидроксида алюминия:

Органические сорбенты

Особенно важным свойством этих полимеров является их гидрофобность, обусловленная отсутствием гидроксильных групп. Малое сродство к соединениям,… Такие важные для газохроматографического применения свойства пористых…

Диатомовые носители

Диатомовая горная порода состоит в основном из аморфного кремнезема, содержащего от 20 до 80 % физически связанной воды. Диатомит промывают водой, чтобы отделить загрязняющий материал, например… Далее диатомит измельчают, просеивают и, если необходимо, освобождают от оксидов железа.

Размеры молекул

Влияние размеров молекул неподвижной жидкой фазы следует особенно учитывать при использовании полимерных материалов, состоящих из большого числа соединений с различной молекулярной массой. Такие полимеры в зависимости от состава исходной полимеризационной смеси могут иметь различные свойства: различное давление паров, температуру кипения и состав продуктов разложения.

Поэтому важно, чтобы распределение по молекулярным массам было достаточно узким, что исключает вероятность испарения молекул с меньшей молекулярной массой, которое приводит к снижению количества неподвижной жидкой фазы и изменению ее свойств.

Вязкость

Если разделение проводится на неподвижных жидких фазах с очень высокой вязкостью, хорошие результаты можно получить только при повышении температуры и соответствующем снижении вязкости, так как сопротивление переносу вещества пропорционально вязкости неподвижной жидкой фазы.

Исключение составляют неполярные линейные полимеры, для которых увеличение длины цепи мало влияет на диффузию маленьких молекул.

Способность к образованию пленок

Хорошая эффективность разделения достигается в случае, если поверхность носителя покрыта равномерной пленкой неподвижной жидкой фазы. Образование такой пленки возможно лишь при такой температуре, при которой неподвижная жидкая фаза находится в жидком состоянии и вязкость ее не слишком велика, кроме того, химическая структура молекул неподвижной жидкой фазы должна обеспечивать минимальный угол смачивания на поверхности раздела носитель – неподвижная жидкая фаза.

Это возможно в том случае, если обе фазы имеют близкое химическое строение.

Поэтому следует предпочтительно использовать силанизированные носители, т.е. такие носители, поверхность которых частично покрыта алкилсилильными группами. На такой поверхности легче образуются пленки многих органических соединений (исключение составляют соединения, в молекулах которых содержатся группы -ОН или -NH₂).

Способность к растворению разделяемых соединений

Для того, чтобы на жидкой фазе могло происходить разделение смесей, она должна растворять их с тем, чтобы они перемещались вдоль колонки не слишком быстро.

Поэтому неподвижные жидкие фазы близкие по своей химической природе к разделяемым соединениям, применяются преимущественно для исследования смесей, компоненты которых относятся к одному и тому же гомологическому ряду, так как для них характерны различия в давлении паров и результаты хроматографирования зависят исключительно от эффективности разделения.

Разделительные свойства

Если требуется разделить соединения, имеющие одинаковую темтепературу кипения, но принадлежащие к различным гомологическим рядам, следует пользоваться неподвижной жидкой фазой, характеризующейся достаточной селективностью.

Неподвижная жидкая фаза обладает селективностью, если в процессе разделения веществ, принадлежащих к различным гомологическим рядам с одинаковой температурой кипения, обнаруживается существенное различие в их относительном удерживании.

Разделение происходит, например, в том случае, если один из компонентов смеси хорошо растворяется в неподвижной жидкой фазе, а другой – плохо.

При разделении соединений одного и того же класса следует отказываться от правила подобия. Здесь наибольшим разделительным действием обладают неподвижные жидкие фазы, отличающиеся от разделяемых соединений полярностью. Например, углеводороды с одинаковой температурой кипения интенсивнее разделяются на таких полярных неподвижных фазах, как нитрилы, а разделение полярных соединений успешно проходит на малополярных силиконовых маслах или неполярных фазах на основе углеводородов (парафиновое масло, сквалан).

Особенно высокую селективность проявляют неподвижные жидкие фазы, образующие с отдельными компонентами анализируемой смеси слабосвязанные аддукты, как, например, нитрат серебра, удерживающий олефины, или пикраты, селективно присоединяющие ароматические соединения.

13.4. КЛАССИФИКАЦИЯ НЕПОДВИЖНЫХ ЖИДКИХ ФАЗ

В газо-жидкостной хроматографии априорный выбор оптимальной неподвижной жидкой фазы для решения задачи разделения конкретной смеси – довольно сложная задача.

Это объясняется тем, что теория растворов к настоящему времени еще не разработана до такой степени, чтобы можно было охарактеризовать все возможные типы взаимодействий разделяемых веществ с неподвижной жидкой фазой легко определяемыми константами или коэффициентами.

Достаточно обоснованный выбор оптимальной неподвижной жидкой фазы может быть осуществлен только лишь при наличии рациональной классификации этих фаз.

Классификация неподвижных жидких фаз по величинам относительной полярности

Исторически первой была классификация неподвижных жидких фаз, основанная на величинах их относительной полярности, предложенная Роршнейдером.

Относительная полярность неподвижной жидкой фазы определяется из соотношения исправленных удерживаемых объемов вещества, выступающего в качестве стандарта полярного растворенного вещест-ва, и вещества, выступающего в качестве стандарта неполярного растворенного вещества, измеренных на колонках с полярной исследуемой неподвижной жидкой фазой и стандартной неподвижной жидкой фазой, полярность которой принята за нуль:

, (106)

где Р_р - полярность полярной неподвижной жидкой фазы р; V_p^RX, V_p^RH - удерживаемые объемы компонентов RX и RH на полярной неподвижной жидкой фазе соответственно; V_n^RX, V_n^RH - удерживаемые объемы компонентов RX и RH на стандартной неполярной неподвижной жидкой фазе соответственно.

Для любого другого анализируемого вещества, не являющегося стандартным, соотношение удерживаемых объемов на неподвижной жидкой фазе р можно представить в виде:

, (107)

где А^RX’ - характеристическая константа растворенного вещества RX’.

Уравнение (106) позволяет составить шкалу полярности исследуемых неподвижных жидких фаз. Для этого выбирают стандартные вещества – полярное (RX) и неполярное (RH) - и определяют их удерживаемые объемы на неполярной и исследуемой полярной неподвижных жидких фазах.

Роршнейдер предложил применять в качестве стандартных веществ бутадиен (полярное) и бутан (неполярное). В качестве неподвижной жидкой фазы с величиной относительной полярности равной нулю был предложен сквалан (разветвленный насыщенный углеводород с числом атомов углерода в молекуле, равным 30). Наиболее полярной неподвижной жидкой фазой, которой Роршнейдер установил полярность, равную 100 единицам, выбран b, b’ – оксидипропионитрил.

Тогда, приняв в уравнении (107) величину относительной полярности Р_р, равную 100 для b,b’-оксидипропионитрила, можно рассчитать величину характеристической константы А^RX^{^}для соединений олефинового ряда из уравнения

. (108)

Можно использовать и графический способ определения величины относительной полярности исследуемой неподвижной жидкой фазы.

В табл. 12 приведена шкала относительной полярности некоторых неподвижных жидких фаз, рассчитанная по удерживаемым объемам бутадиена и н-бутана при 30 ^оС в случае разделения молекул олефинового ряда.

Т а б л и ц а 12

Шкала относительной полярности неподвижных жидких фаз

· неполярные (Р = 0-5 ); · слабополярные (Р = 5-15); · среднеполярные (Р = 15-50);

Классификация неподвижных жидких фаз по индексам удерживания Ковача

В основу следующей классификации неподвижных жидких фаз Роршнейдер положил индексы удерживания исследуемых соединений, предложенные Ковачем.

В системе индексов удерживания Ковача в качестве стандартных соединений используется не одно вещество, а гомологический ряд нормальных углеводородов. Для этого ряда величина индекса удерживания каждого его представителя рассчитывается как произведение числа атомов углерода в молекуле на 100. Величина индекса удерживания любого члена гомологического ряда алифатических углеводородов всегда остается постоянной, не зависит от используемых колонок, температуры и вообще любых условий хроматографического разделения и является основой для установления индексов удерживания соединений других гомологических рядов в выбранных условиях разделения.

Таким образом, величина индекса удерживания Ковача для метана оказывается равной 100 единицам, этана – 200, гексана – 600 и т.д.

Для всех других соединений обязательно следует указывать тип неподвижной жидкой фазы, ее концентрацию, тип носителя неподвижной жидкой фазы, температуру колонки и другие параметры процесса разделения; все эти данные должны приводиться вместе с полученным индексом удерживания для каждого соединения.

Для сопоставления величин полярностей двух различных неподвижных жидких фаз а и b сначала определяют величины логарифмов исправленных удерживаемых объемов веществ, представителей гомологического ряда алифатических углеводородов, строят зависимость полученных величин от соответствующих значений индексов удерживания Ковача для этих веществ на колонках с исследуемыми фазами.

Затем в этих же условиях определяют величины логарифмов удерживаемых объемов исследуемого полярного соединения на обеих фазах, из графических зависимостей для каждой неподвижной жидкой фазы определяют индексы удерживания данного соединения и сопоставляют полученные значения I_a и I_b.

Фаза b будет более полярной, чем фаза а, если индекс I_b больше индекса I_a.

Количественной характеристикой различия в полярности исследуемых фаз является величина разности полученных значений индексов удерживания:

DI = I_b – I_a . (109)

Это соотношение и является исходным пунктом для дальнейшего обобщения.

Если для данного анализируемого вещества DI на какой-то другой неподвижной фазе больше, то или полярность этой фазы больше, или на данной неподвижной фазе анализируемое вещество ведет себя как более полярное.

В соответствии с этим можно представить разность индексов удерживания следующим образом:

DI = a x , (110)

где а - фактор полярности анализируемого вещества; х - фактор полярности неподвижной фазы.

Однако и эти представления не позволяют достаточно полно описать особенности взаимодействий любого анализируемого вещества с любой неподвижной жидкой фазой.

Классификация неподвижных жидких фаз по веществам-стандартам

Следующий шаг в вопросе классификации неподвижных жидких фаз вновь был сделан Роршнейдером.

Он предложил сопоставлять величины индексов удерживания Ковача для строго определенного набора веществ, полученные на колонке со скваланом (характеризующейся величиной относительной полярности равной нулю) и на колонке с исследуемой неподвижной жидкой фазой в абсолютно одинаковых условиях процесса хроматографирования..

В состав набора веществ-стандартов были выбраны соединения с очень близкими температурами кипения, однако способные к преимущественно какому-то одному определенному типу взаимодействий с неподвижной жидкой фазой.

Роршнейдер предложил в качестве веществ-стандартов следующие соединения: бензол, этанол, метилэтилкетон, нитрометан, пиридин.

Действительно, для бензола основным типом взаимодействия является донорно-акцепторное взаимодействие, для этанола (акцептор электронов) – образование водородных связей, для метилэтилкетона (донор электронов) – образование водородных связей, для нитрометана – донорно-акцепторное взаимодействие, для пиридина – ориентационное взаимодействие.

Так, например, величина индекса удерживания Ковача для бензола, полученная на колонке с 20 % сквалана на носителе хромосорб WAW при 100 ^оС оказалась равной 649 единицам. Замена сквалана на динонилфталат в тех же условиях эксперимента дает величину индекса удерживания для бензола, равную 733.

Полученные величины индексов удерживания для бензола на этих неподвижных жидких фазах свидетельствуют о том, что при переходе от сквалана к динонилфталату удерживание бензола колонкой увеличивается.

В таком случае, полученная разность в индексах удерживания бензола, равная 84 единицам, выступает в качестве характеристики меры полярности динонилфталата по сравнению со скваланом для углеводородов ароматического ряда.

Опять получаем выражение

DI = I_{полярная}– I_{неполярная} = а х , (111)

где а - фактор полярности бензола; х - фактор полярности динонилфталата, характеризующий степень замедления движения в колонке с динонилфталатом соединений ароматического ряда по сравнению со скваланом.

Если определить индексы удерживания других веществстандартов, то получим численные значения параметров, характеризующих степень замедления движения в колонке с динонилфталатом соединений других гомологических рядов, способных к отличным от бензола типам взаимодействий с неподвижной жидкой фазой.

Эти типы взаимодействий неподвижной жидкой фазы с разделяемыми соединениями в системе Роршнейдера количественно характеризуются величинами коэффициентов y, z, u, s. Коэффициент у характеризует способность неподвижной жидкой фазы к образованию водородных связей (донор электронов), z – способность выступать в качестве акцептора электронов, u – способность к донорно-акцепторным взаимодействиям, s – способность к ориентационным взаимодействиям.

Тогда для любого вещества степень замедления движения в колонке с любой неподвижной жидкой фазой описывается уравнением

DI = ax + by + cz + du + es , (112)

в котором каждое слагаемое характеризует способность данного вещества и данной неподвижной жидкой фазы к определенному типу взаимодействий.

В приведенном уравнении константы a, b, c, d, e характеризуют вещество, а константы x, y, z, u, s характеризуют неподвижную жидкую фазу.

Величины констант определяются из экспериментальных данных.

Так, например, величина множителя х определяется из полученных численных значений индексов удерживания бензола на колонке с исследуемой неподвижной жидкой фазой и колонке со скваланом с использованием известного уже выражения DI = a x, в котором а = 1, поскольку бензол является веществом-стандартом для характеристики данного типа взаимодействий, а остальные слагаемые уравнения (112) равны нулю.

Аналогично определяются величины констант y, z, u, s, характеризующие способность исследуемой неподвижной жидкой фазы к другим типам взаимодействий, при использовании полученных значений индексов удерживания других стандартов.

Следовательно, для того чтобы охарактеризовать какую-либо неподвижную жидкую фазу, следует определить на этой неподвижной жидкой фазе индексы удерживания пяти веществ-стандартов и вычесть из полученных величин индексы удерживания этих же пяти веществ-стандартов для колонки со скваланом.

Роршнейдер предложил делить полученные значения DI на 100.

В табл. 13 приведены величины констант Роршнейдера для некоторых неподвижных жидких фаз.

Константы a, b, c, d, e, относящиеся к характеристике исследуемого соединения, его способности к различным типам взаимодействий, можно вычислить из матрицы DI, полученной экспериментально для этого соединения с использованием пяти неподвижных жидких фаз с известными значениями констант x, y, z, u, s для каждой из фаз:

DI₁ = ax₁ + by₁ + cz₁ + du₁ + es₁

DI₂ = ax₂ + by₂ + cz₂ + du₂ + es₂

DI₃ = ax₃ + by₃ + cz₃ + du₃ + es₃

DI₄ = ax₄ + by₄ + cz₄ + du₄ + es₄

DI₅ = ax₅ + bu₅ + cz₅ + du₅ + es₅.

Т а б л и ц а 13

Величины констант Роршнейдера для неподвижных жидких фаз

Неподвижная фаза	Константы
х	y	z	u	s
сквалан
апиезон L	0.32	0.39	0.25	0.48	0.55
силикон OV-1	0.16	0.20	0.50	0.55	0.42
силикон OV-3	0.44	0.81	0.85	1.22	0.88
силикон OV-7	0.69	1.13	1.19	1.68	1.28
силикон OV-11	1.02	1.57	1.69	2.44	1.78
силикон OV-17	1.21	1.66	1.79	2.53	2.30
силикон F-1	1.76	3.22	2.58	4.14	2.99
полиэтиленгликоль 1000	3.47	6.10	3.90	5.21	5.89
полиэтиленгликоль 4000	3.22	5.46	3.86	7.15	5.17
полиэтиленгликоль 20000	3.18	5.33	3.81	7.02	5.04
дибутилфталат	1.30	2.53	2.18	3.57	2.27
диэтиленгликоль	3.78	5.58	5.21	8.61	6.58
этиленгликольсукцинат	5.37	7.06	5.67	8.24	8.89
диэтиленгликольсукцинат	4.85	7.58	6.14	9.50	8.37
диизодецилфталат	0.83	1.65	1.43	2.53	1.54
динонилфталат	0.84	1.76	1.48	2.70	1.53
этиленгликольадипинат	3.43	5.46	4.52	7.11	6.00
трикрезилфосфат	1.74	3.22	2.58	4.14	2.95
- оксидипропионитрил	8.71	7.94	11.53	9.15	-
силиконовая SE-30	0.16	0.20	0.50	0.85	0.48

Система классификации неподвижных жидких фаз Роршнейдера позволяет:

· выявить взаимозаменяемые неподвижные жидкие фазы;

· осуществить рациональный выбор неподвижной жидкой фазы для разделения конкретной смеси веществ.

Практическим примером может служить задача выбора оптимальной неподвижной жидкой фазы для разделения смеси бензола (температура кипения 80.1 ^оС), этанола (78.5 ^оС) и ацетона (56.2 ^оС). При этом следует иметь в виду, что поскольку этанол является основным компонентом в смеси, он должен элюироваться из колонки последним.

Обычно порядок выхода разделяемых веществ таков – ацетон и сумма этанола и бензола, что соответствует их температурам кипения.

Для успешного решения этой задачи нужна неподвижная жидкая фаза, имеющая большое значение константы у относительно констант х и z, т.е. колонка, сильно удерживающая спирты.

Классификация неподвижных жидких фаз Мак-Рейнольдса

Дальнейшее развитие система классификации Роршнейдера получила в работах Мак-Рейнольдса, который предложил изменить список веществ-стандартов таким образом, чтобы в нем были представлены члены большего числа гомологических рядов с близкими температурами кипения.

Список предложенных Мак-Рейнольдсом соединений следующий: бензол, бутанол, метилпропилкетон, нитропропан, пиридин, 2-метил-пентанол-2, 1-иодбутан, октин-2, 1.4-диоксан, цис-гидриндан.

Кроме этого Мак-Рейнольдс предложил использовать температуру колонки при разделении равной 120 ^оС и отказаться от деления полученных индексов удерживания на 100. Используемые количества неподвижных жидких фаз – 20 % по массе.

На практике в большинстве случаев для характеристики неподвижных жидких фаз используются пять первых веществ-стандартов Мак-Рейнольдса.

13.5. ВАЖНЕЙШИЕ НЕПОДВИЖНЫЕ ЖИДКИЕ ФАЗЫ

Известно более 1000 неподвижных жидких фаз, нашедших применение в газовой хроматографии. Стремление резко ограничить число применяемых неподвижных жидких фаз неправомерно, поскольку именно возможность реализации различного типа межмолекулярных взаимодействий – сильная сторона газо-жидкостной хроматографии.

Применение нашли около 100 достаточно часто используемых неподвижных жидких фаз, из которых 20 используют примерно в 60-70 % всех хроматографических анализов.

Использование капиллярных хроматографических колонок с их высокой эффективностью в какой-то мере дало возможность снизить требования к селективности и сделать эти 20 фаз достаточными примерно для 80 % разделений. Однако всегда найдутся задачи, для которых селективность каких-либо неподвижных фаз является уникальной.

Поскольку каждый из классов соединений характеризуется своей спецификой взаимодействий, в каждом классе можно подобрать вещества, пригодные для использования в качестве неподвижных фаз.

Неароматические углеводороды

Взаимодействие таких фаз как с неполярными, так и с поляризуемыми или полярными анализируемыми веществами определяется исключительно или… Углеводороды в качестве неподвижных фаз особенно пригодны для отделения… Поскольку все типы углеводородов хорошо растворяются в углеводородных неподвижных фазах и поэтому удерживаются ими…

Силиконы

Эти преимущества особенно заметны при работе в области средних и высоких температур, особенно в условиях программирования температуры колонки. Метилсиликоны обладают весьма слабой полярностью, поэтому последовательность… Представители неподвижных жидких фаз этого класса – силиконовые масла, силиконовый каучук.

Фенилсиликоны

Фенилсиликоны характеризуются повышенной устойчивостью к окислению и воздействию температуры C6H5 CH3 C6H5 CH3 [- Si – O - ]m [- Si – O - ]n ; [ - Si – O - ]m [ -Si – O - ]n.

Спирты, эфиры и производные углеводов

Большое значение имеет способность эфирных и гидроксильных атомов кислорода, являющихся акцепторами электронов, образовывать водородные связи с… Из одноатомных спиртов используются гексадециловый спирт (интервал температур… Из многоатомных спиртов – диглицерин (20-100 оС), полиглицерин (20-200 оС).

Полигликоли

Одновременное присутствие атомов-акцепторов (кислород гидроксила и простых эфиров) и атомов-доноров (водород гидроксила) приводит, благодаря… Селективность полигликолей зависит главным образом от концентрации… Полиэтиленгликоль является наименее селективной неподвижной жидкой фазой для кислородных соединений: минимальная…

Ароматические простые эфиры

Для разделения олефинов и ароматических углеводородов решающее значение имеют ароматические составляющие этих фаз. Относительно небольшая эфирная часть с атомами-акцепторами, способными к образованию водородной связи, оказывает довольно сильное влияние на силы удерживания, достаточное для разделения спиртов и эфироспиртов.

Поли-м-фениловый эфир С₆Н₅-[-O-C₆H₅-]_n-O-C₆H₅. Минимальная температура колонки 20 ^оС, максимальная 200 ^оС для n = 1, 375 ^oC для n > 5.

Сложные эфиры

Динонилфталат – минимальная температура колонки 20 оС, максимальная – 130 оС. Диоктилсебацинат, диоктиладипат – максимальная температура 130 оС и 125 оС… Трифенилфосфат, трикрезилфосфат – максимальная температура колонки 100 и 110 оС соответственно.

Жидкостная хроматография

Особенности всех видов жидкостной хроматографии обусловлены тем, что подвижной фазой в ней является жидкость, а сорбция компонентов из газообразного… Применяя различные элюенты, можно изменять параметры удерживания и… H V Рис.1.9. Зависимость…

Характеристики растворителей, используемых в жидкостной хроматографии

В жидкостной хроматографии часто используют не индивидуальные растворители, а их смеси. Часто незначительные добавки другого растворителя, особенно… При разделении многокомпонентных смесей одна подвижная фаза в качестве элюента… В жидкостной хроматографии существуют некоторые эмпирические правила, которые очень полезны при выборе элюента:

Схема изократического хроматографа

Подвижная фаза из емкости (1) через входной фильтр (9) подается прецизионным насосом высокого давления (2) в систему ввода образца (3) - ручной инжектор или автосамплер, туда же вводится проба. Далее, через in-line фильтр (8), образец с током подвижной фазы поступает в элемент (элементы) разделения (4) - через предколонку в разделительную колонку. Затем, элюат поступает в детектор (5) и удаляется в сливную емкость (7). При протекании элюата через измерительный контур детектора происходит регистрация хроматограммы и передача данных на аналоговый регистратор (самописец) (6) или иную систему сбора и обработки хроматографических данных (интегратор или компьютер). В зависимости от конструкции функциональных модулей управление системой может осуществляться с клавиатуры управляющего модуля (как правило насоса или системного контролера), с клавиатур каждого из модулей системы или производиться управляющей программой с персонального компьютера.

В случае градиентного элюирования используются два принципиально различных типа жидкостных хроматографов. Они отличаются точкой формирования градиента состава подвижной фазы.

Схема градиентного хроматографа с формированием градиента состава подвижной фазы на линии низкого давления.

Подвижная фаза из емкостей (1) через входные фильтры (9) и программатор градиента (10) подается прецизионным насосом высокого давления (2) в систему ввода образца (3) - ручной инжектор или автосамплер, туда же вводится проба. Работой клапанов программатора градиента управляет либо управляющий модуль системы (насос или контроллер), либо управляющая программа ПК. Системы такого типа формируют бинарный, трехмерный и четырехмерный градиент. Форма функции отработки градиента зависит от конкретного управляющего модуля или программы управления, а также функциональных возможностей управляемых и управляющих модулей. Далее, через in-line фильтр (8), образец с током подвижной фазы поступает в элемент (элементы) разделения (4) - через предколонку в разделительную колонку. Затем, элюат поступает в детектор (5) и удаляется в сливную емкость (7). При протекании элюата через измерительный контур детектора происходит регистрация хроматограммы и передача данных на аналоговый регистратор (самописец) (6) или иную систему сбора и обработки хроматографических данных (интегратор или компьютер). В зависимости от конструкции функциональных модулей управление системой может осуществляться с клавиатуры управляющего модуля (как правило, насоса или системного контролера), или производиться управляющей программой с персонального компьютера. В случае управления управляющим модулем возможно независимое управление детектором с его собственной клавиатуры.

Несмотря на кажущуюся привлекательность таких систем (в них используется всего лишь один прецизионный насос высокого давления), данные системы обладают рядом недостатков, среди которых основным, пожалуй, является жесткая необходимость тщательной дегазации компонентов подвижной фазы еще до смесителя низкого давления (камеры программатора градиента). Она осуществляется с помощью специальных проточных дегазаторов. Из-за этого факта стоимость их становится сравнимой с другим типом градиентных систем - систем с формированием состава градиента подвижной фазы на линии высокого давления.

Принципиальным отличием систем с формированием состава градиента подвижной фазы на линии высокого давления является смешение компонентов в линии высокого давления, естественно, что при данном подходе количество прецизионных насосов определяется количеством резервуаров для смешивания подвижной фазы. При таком подходе требования к тщательности дегазации компонентов существенно снижаются.

Схема градиентного хроматографа с формированием градиента состава подвижной фазы на линии высокого давления.

Подвижная фаза из емкостей (1) через входные фильтры (9) подается прецизионными насосами высокого давления (2 и 11) через статический или динамический смеситель потока (10) в систему ввода образца (3) - ручной инжектор или автосамплер, туда же вводится проба. Работой управляемых насосов управляет либо управляющий модуль системы (насос “master pump” или контроллер), либо управляющая программа ПК. В этом случае все насосы являются управляемыми. Системы такого типа формируют бинарный или трехмерный градиент. Форма функции отработки градиента зависит от конкретного управляющего модуля или программы управления, а также функциональных возможностей управляемых и управляющих модулей. Далее, через in-line фильтр(8), образец с током подвижной фазы поступает в элемент (элементы) разделения (4) - через предколонку в разделительную колонку. Затем элюат поступает в детектор (5) и удаляется в сливную емкость (7). При протекании элюата через измерительный контур детектора происходит регистрация хроматограммы и передача данных на аналоговый регистратор (самописец) (6) или иную систему сбора и обработки хроматографических данных (интегратор или компьютер). В зависимости от конструкции функциональных модулей управление системой может осуществляться с клавиатуры управляющего модуля (как правило, насоса или системного контролера), или производиться управляющей программой с персонального компьютера. В случае управления управляющим модулем возможно независимое управление детектором с его собственной клавиатуры.

Предложенные схемы являются достаточно упрощенными. В состав систем могут быть включены дополнительные устройства - термостат колонок, системы постколоночной дериватизации, системы пробоподготовки и концентрирования образца, рециклер растворителя, мембранные системы подавления фоновой электропроводности (для ионной хроматографии), дополнительные защитные системы (фильтры, колонки) и т.д. На схемах, также отдельно не показаны манометрические модули. Как правило, эти устройства встраиваются в насосные блоки. Эти блоки могут объединять в себе несколько насосов, насос с программатором градиента, а также общий системный контроллер. Структура системы зависит от ее комплектации и каждого конкретного производителя.

Такое радикальное усложнение технического сопровождения хроматографического процесса приводит к возникновению ряда требований к свойствам подвижной фазы, отсутствующих в классической колоночной и планарной хроматографии. Жидкая фаза должна быть пригодна для детектирования (быть прозрачной в заданной области спектра или иметь низкий показатель преломления, определенную электропроводность или диэлектрическую проницаемость и т.д.), инертна к материалам деталей хроматографического тракта, не образовывать газовых пузырей в клапанах насоса и ячейке детектора, не иметь механических примесей.

В жидкостной хроматографии используют множество типов насосов. При ЖХ низкого давления зачастую используют перистальтические насосы (Рис.1).

Рис.1 Програмируемый перистальтический насос MasterFlex.

При ВЭЖХ для обеспечения расхода подвижной фазы через колонку с указанными параметрами используются насосы высокого давления.

К наиболее важным техническим характеристикам насосов для ВЭЖХ относятся: диапазон расхода; максимальное рабочее давление; воспроизводимость расхода; диапазон пульсаций подачи растворителя.

По характеру подачи растворителя насосы могут быть постоянной подачи (расхода) и постоянного давления. В основном при аналитической работе используется режим постоянного расхода, при заполнении колонок - постоянного давления.

По принципу действия насосы для ВЭЖХ делятся на шприцевые и на плунжерные возвратно-поступательные.

Шприцевые насосы

Основной отличительной особенностью данных насосов является цикличность их работы, в связи с чем хроматографы, в которых применяются данные насосы, также отличаются цикличностью работы.

Рис. 2. Принципиальное устройство шприцевого насоса для ВЭЖХ.

Рис. 2А. Шприцевой насос.

Блок управления БУ подает напряжение на двигатель Д, определяющее скорость и направление его вращения. Вращение двигателя с помощью редуктора Р преобразуется в перемещение поршня П внутри цилиндра Д. Работа насоса осуществляется в 2 цикла. В цикл заполнения клапан К2 закрыт, К1 - открыт, растворитель поступает из резервуара в цилиндр Ц. В режиме подачи клапан К1 закрыт, а через клапан К2 подвижная фаза поступает в дозирующее устройство.

Для насосов этого типа характерно практически полное отсутствие пульсаций потока подвижной фазы в ходе работы.

Недостатки насоса:

а) большой расход времени и растворителя на промывку при смене растворителя;

б) ограниченный объемом шприца объем ПФ, а следовательно ограниченное время разделения;

в) приостановка разделения во время заполнения насоса;

г) большие габариты и вес при обеспечении большого расхода и давления (нужен
мощный двигатель и большое усилие поршня с его большой площадью).

Плунжерные возвратно-поступательные насосы.

Рис. 3. Принципиальное устройство плунжерного насоса.

Принцип действия.

Двигатель Д через редуктор Р приводит в возвратно-поступательное движение плунжер П, перемещающийся в рабочей головке насоса. Клапаны К1 и К2 открываются, когда насос находится в фазе всасывания и подачи соответственно. Величина объемной подачи определяется тремя параметрами: диаметром плунжера (обычно 3.13; 5.0; 7.0 мм), его амплитудой (12-18 мм)и частотой(что зависит от скорости вращения двигателя и редуктора).

Насосы этого типа обеспечивают постоянную объемную подачу подвижной фазы длительное время. Максимальное рабочее давление 300-500 атм, расход 0.01-10 мл/мин. Воспроизводимость объемной подачи -0.5%. Основной недостаток - растворитель подается в систему в виде серии последовательных импульсов, поэтому существуют пульсации давления и потока (Рис.4). Это является основной причиной повышенного шума и снижения чувствительности почти всех детекторов, применяемых в ЖХ, особенно электрохимического.

Рис.4. Пульсации плунжерного насоса.

Способы борьбы с пульсациями.

Это спиральные трубки специального профиля из нержавеющей стали, включенные последовательно или параллельно в систему между насосом и дозатором. Рис. 5. Спиральный демпфер.

Ионообменная, ионная, ион-парная хроматография. В основе методов ионообменной, ионной и ион-парной хроматографии лежит динамический процесс замещения ионов, связанных с неподвижной фазой, ионами элюента, поступающими в колонку. Основная цель хроматографического процесса - разделение неорганических или органических ионов одного и того же знака. Удерживание в этих видах хроматографии определяется изменением свободной энергии реакции ионного обмена. Соотношение концентраций обменивающихся ионов в растворе и в фазе сорбента характеризуются ионообменным равновесием. Ионный обмен заключается в том, что некоторые вещества (ионообменники) при погружении в раствор электролита поглощают из него катионы или анионы, выделяя в раствор эквивалентное количество других ионов с зарядом того же знака. Между катионообменником и раствором происходит обмен катионами, между анионообменником и раствором – обмен анионами.

Катионообменники представляют собой чаще всего специально синтезированные нерастворимые полимерные вещества, содержащие в своей структуре ионогенные группы кислотного характера: –SO₃H; –COOH; –OH; –PO₃H₂; –AsO₃H₂.

Химические формулы катионообменников схематически можно изобразить как R-SO₃H; R-SO₃Na. В первом случае катионообменник находится в Н-форме, во втором - в Na-форме. R – полимерная матрица.

Катионообменные реакции записывают как обычные гетерогенные химические реакции:

RН + Na⁺ RNa + H⁺

Анионообменники содержат в своей структуре ионогенные группы основного характера: –N(CH₃)₃⁺; =NH₂⁺; =NH⁺ и др. Их химические формулы могут быть изображены как RNH₃OH и RNH₃Cl или ROH, RCl. В первом случае анионообменник находится в ОН-форме, во втором – в Сl-форме. Анионообменную реакцию можно записать следующим образом:

R – OH + Cl^– RCl + OH^–

Известны амфотерные ионообменники, содержащие в своей структуре и кислотные, и основные группы. Ионообменники, имеющие в своем составе однотипные (например, -SO₃H) кислотные (основные) группы, называют монофункциональными; ионообменники, содержащие разнотипные (например, -SO₃H, -ОН) кислотные (основные) группы - полифункциональными.

Монофункциональные ионообменники получают реакцией полимеризации. Реакция поликонденсации позволяет получать полифункциональные ионообменники. Для того, чтобы полученные ионообменники имели достаточно высокие эксплуатационные характеристики, они должны быть нерастворимыми, но набухающими в соответствующем растворителе и иметь достаточно большое количество ионогенных групп, способных к обмену с ионогенными группами анализируемой пробы. Это может быть достигнуто, если полученные полимерные цепи достаточно разветвлены и связаны друг с другом «сшивающими мостиками». Например, при получении катионообменников полимеризационного типа на основе стирола в качестве сшивающего агента чаще всего используется дивинилбензол, введение которого в количестве до 16% обеспечивает получение ионообменников с различной степенью набухания и, следовательно, позволяет регулировать пористость ионообменника. Степенью набухания ионита, выражаемой в миллилитр/грамм, называют объем упакованного в колонку 1 г воздушно-сухого ионообменника.

Содержание в ионообменнике ионогенных групп, способных к обмену с ионогенными группами анализируемой пробы, определяет так нназываемую обменную емкость ионита. Обменную емкость ионита выражают в миллиэквивалентах или миллимолях обмениваемых ионов на 1 г сухого или 1 мл набухшего ионообменника.

Ионообменник поглощает, как правило, один из противоионов - ионов, находящихся в подвижной фазе, т. е. проявляет определенную селективность. Экспериментально установлены ряды сродства, или селективности, ионов по отношению к ионообменникам разных типов. Например, при низких концентрациях раствора на сильнокислотных катионообменниках ионы с одинаковым зарядом сорбируются в такой последовательности:

Li⁺ < Na⁺ < K⁺ < Rb⁺ < Cs⁺

Mg²⁺ < Ca²⁺ < Sr²⁺ < Ba²⁺.

Для ионов с разными зарядами сорбируемость увеличивается с увеличением заряда:

Na⁺ < Ca²⁺ < Al³⁺ < Th⁴⁺.

Однако изменение условий проведения реакции ионного обмена может привести к обращению ряда. Ряды сродства установлены и для анионообменников. Например, сорбируемость анионов на сильноосновных анионитах увеличивается в ряду:

F^– < OH^– < Cl^– < Br^– < NO₃^– < J^– < SCN^– < ClO₄^–.

Ионообменики, содержащие в своей структуре сильнокислотные или сильноосновные группы, вступают в реакции ионного обмена с любыми ионами, находящимися в растворе обладающими зарядами того же знака, что и знак противоиона. Такие ионообменники называют универсальными.

Процесс ионного обмена между анализируемым веществом и ионообменником может быть осуществлен одним из трех способов: статическим, динамическим (способ ионообменного фильтра) и хроматографическим.

Статический метод ионного обмена заключается в том, что навеску ионита приводят в контакт с определенным объемом раствора и перемешивают или встряхивают определенное время до установления равновесия. Это быстрый и простой способ ионного обмена, применяющийся для концентрирования ионов из разбавленных растворов, удаления ненужных примесей, но он не обеспечивает полного поглощения ионов, так как ионный обмен - это неравновесный процесс, и вследствие этого не гарантирует полного разделения ионов.

При проведении ионного обмена динамическим способом через колонку с ионитом пропускают раствор, который по мере перемещения по колонке контактирует с новыми гранулами ионита. Этот процесс обеспечивает более полный обмен, чем статический метод, так как продукты обмена удаляются потоком раствора. Им можно концентрировать ионы из разбавленных растворов и разделять ионы, сильно различающиеся по свойствам, например, разнозарядные ионы (отделять катионы от анионов), но разделение ионов одного знака заряда практически невозможно. Количественное разделение таких ионов возможно только при многократном повторении сорбционно-десорбционных элементарных актов в динамических условиях, т. е. хроматографическим методом. При работе этим методом применяют высокие слои ионита и в этот слой вводят разделяемую смесь в количестве, значительно меньшем емкости колонки, благодаря чему и обеспечивается многократное повторение элементарных актов ионного обмена.

По технике проведения анализа ионообменная хроматография сходна с молекулярной и может осуществляться по элюентному (проявительному), фронтальному и вытеснительному вариантам. Отличие между молекулярной и ионообменной хроматографией состоит в том, что в молекулярной хроматографии разделенные компоненты смеси элюируются из колонки чистым элюентом, а в ионообменной в качестве элюента используют раствор электролита. При этом обмениваемый ион элюента должен сорбироваться менее селективно, чем любой из ионов разделяемой смеси.

При проведении проявительной ионообменной хроматографии, которая применяется наиболее часто, колонку, заполненную ионитом, сначала промывают раствором электролита до тех пор, пока в ионите не произойдет полное замещение всех его ионов на ионы, содержащиеся в элюенте. Затем в колонку вводят небольшой объем раствора анализируемого вещества, имеющего в своем составе разделяемые ионы в количестве около 1% от емкости ионита. Далее колонку промывают раствором элюента, отбирая фракции элюата и анализируя их.

Смесь ионов Cl^–, Br^–, J^– можно разделить на высокоосновном анионите (сшитый полистирол, содержащий группы четвертичных аммониевых оснований -N (CH₃)₃⁺), например, AB-17, имеющем ряд избирательности (селективности): NO₃^– < Cl^– < Br^– < J^–. Вследствие этого в качестве элюента используется раствор NaNO₃. Вначале через ионит пропускается этот раствор до полного насыщения ионами NO₃^–. При введении в колонку разделяемой смеси ионы Cl^–, Br^–, J^– поглощаются анионитом, вытеснив ионы NO₃^–. При последующем промывании колонки раствором NaNO₃ионы Cl^–, Br^–, J^–в верхних слоях анионита постепенно вновь замещаются ионами NO₃^–. Быстрее всех будут вытесняться ионы Cl^–, дольше всех в колонку задержатся ионы J^–. Различие в селективности ионита к ионам смеси приводит к тому, что в колонке образуются отдельные зоны сорбированных ионов Cl^–, Br^– и J^–, перемещающиеся по колонке с различной скоростью. По мере перемещения по колонке расстояние между зонами увеличивается. В каждой зоне находится лишь один из анионов разделяемой смеси и анион элюента, в промежутке между зонами лишь анион элюента. Таким образом, в элюенте на выходе из колонки будут появляться фракции, в которых содержатся отдельные компоненты разделяемой смеси.

Для решения практических задач варьируют условия разделения ионов, подбирая подходящую подвижную фазу (состав, концентрация, рН, ионная сила) или изменяя пористость полимерной матрицы ионита, т. е. число межцепных связей в матрице, и создавая ионитовые сита, проницаемые для одних ионов и способные к их обмену и непроницаемые для других. Можно также изменять природу и взаимное расположение ионогенных групп, а также получать сорбенты, способные к селективным химическим реакциям за счет комплексообразования. Высокой селективностью обладают, например, комплексообразующие ионообменники, содержащие в своей структуре хелатообразующие группы органических реагентов диметилглиоксима, дитизона, 8-оксихинолина и др., а также краун-эфиры.

Наибольшее применение в ионообменной, ионной и ион-парной хроматографии находят синтетические макро- и микросетчатые органические ионообменники, имеющие большую обменную емкость (3–7 ммоль/г), а также неорганические ионообменные материалы. Микросетчатые ионообменники способны к обмену ионов только в набухшем состоянии, макросетчатые – в набухшем и ненабухшем состояниях. Другим структурным типом ионообменников являются поверхностно-пленочные иониты, твердая сердцевина которых изготовлена из непористого сополимера стирола и дивинилбензола, стекла или силикагеля и окружена тонкой пленкой ионообменника. Общий диаметр такой частицы составляет около 40 мкм, толщина пленки ионита – 1 мкм. Недостаток таких ионообменников – сравнительно большой диаметр частиц и малая обменная емкость из-за низкой удельной поверхности, вследствие чего приходится работать с малыми пробами и, соответственно, использовать высокочувствительные детекторы. Кроме того, такие ионообменники достаточно быстро отравляются и не способны к регенерации.

В высокоэффективной ионообменной и ионной хроматографии применяют объемно-пористые полистирольные ионообменники, объемно-пористые кремнеземы с диаметром гранул около 10 мкм, а также практически не набухающие поверхностно-пористые и поверхностно-модифицированные сополимеры стирола и дивинилбензола с ионогенными сульфо- и аминогруппами.

В ион-парной хроматографии используют «щеточные» сорбенты – силикагели с привитыми обращенными фазами С₂, С₈,С₁₈, которые легко превращаются в катионообменник при поглощении из подвижной фазы ионогенных поверхностно-активных веществ, например алкилсульфатов или солей четвертичных аммониевых оснований.

При проведении хроматографического разделения с применениием ионообменников в качестве подвижной фазы чаще всего используют водные растворы солей. Это связано с тем, что вода обладает прекрасными растворяющими и ионизирующими свойствами, благодаря чему молекулы анализируемой пробы мгновенно диссоциируют на ионы, ионообменные группы ионообменника гидратируются и также переходят в полностью или частично диссоциированную форму. Это обеспечивает быстрый обмен противоионов. На элюирующую силу подвижной фазы основное влияние оказывает рН, ионная сила, природа буферного раствора, содержание органического растворителя или поверхностно-активного вещества (ион-парная хроматография).

Значение рН выбирают в зависимости от природы ионогенных групп, разделяемых ионов и матрицы. С сильнокислотными и сильноосновными ионообменниками можно работать при рН = 2–12, со слабокислотными при рН = 5–12, со слабоосновными при рН = 2–6. Сорбенты на основе кремнезема при рН ³ 9 использовать нельзя. Ионная сила подвижной фазы влияет на емкость ионообменника. С увеличением ионной силы сорбция ионов обычно уменьшается, так как растет элюирующая сила подвижной фазы. Поэтому в начале разделения подвижная фаза должна иметь малое значение ионной силы (0,05–0,1), а конечное значение этой характеристики не должно превышать 2. При градиентном элюировании часто используют буферы с увеличивающейся ионной силой.

Для селективного элюирования ионов, поглощенных ионообменником, можно применять воду, буферные растворы (фосфатный, ацетатный, боратный, гидрокарбонатный и др.) с определенным значением рН и ионной силы, растворы минеральных (соляная, азотная, серная, фосфорная) и органических (фенол, лимонная, молочная, винная, щавелевая, ЭДТА) кислот. Выбор элюента облегчается тем, что предельные коэффициенты распределения большинства элементов между водными (водно-органическими) растворами многих комплексантов и ионообменниками стандартного типа определены и представлены в таблицах.

1.6.4. Эксклюзионная хроматография. Эксклюзионная хроматография - это разновидность жидкостной хроматографии, в которой разделение компонентов основано на распределении молекул в соответствии с их размером между растворителем, находящимся в порах сорбента, и растворителем, протекающим между его частицами. В процессе разделения небольшие молекулы попадают в сетку полимера, в порах которой растворитель служит неподвижной фазой, и удерживаются там. Большие молекулы не могут проникнуть в полимерную сетку и вымываются из колонки подвижной фазой. Вначале элюируются самые большие, затем средние и, наконец, небольшие молекулы.

Эксклюзионная хроматография подразделяется на гель-про-никающую и гель-фильтрационную. В гель-проникающей хроматографии разделение происходит на полимерах, набухающих в органических растворителях. Гель-фильтрационный вариант эксклюзионной хроматографии предполагает использование в качестве неподвижных фаз полимеров, набухающих в воде.

Продолжительность удерживания компонентов анализируемой пробы в эксклюзионной колонке зависит от размеров их молекул и диффузии в поры сорбента, а также от размеров пор неподвижной фазы.

В этом виде жидкостной хроматографии коэффициент распределения D для самых маленьких молекул анализируемой пробы, которые движутся в хроматографической колонке с наименьшей скоростью, проникая в сетку неподвижной фазы, равен 1, так как подвижная фаза и растворитель, находящийся в порах неподвижной фазы, имеют один и тот же состав. При этом основное уравнение колоночной хроматографии приобретает вид

Молекулы большого размера, не попадающие в поры неподвижной фазы, элюируют из колонки вместе с подвижной фазой. Для них D = 0, a V_R = V_m. Такой диапазон значений коэффициента распределения (от 0 до 1) характерен только для эксклюзионной хроматографии.

Все молекулы анализируемого многокомпонентного вещества должны вымываться из колонки при пропускании небольшого объема растворителя от V_m до V_m + V_s и разделение заканчивается до выхода пика растворителя. Поэтому в этом виде хроматографии необходимо использовать достаточно длинные колонки с большим свободным объемом V_m и большим числом пор в сорбенте.

Разрешение хроматографических пиков при эксклюзионном разделении может быть улучшено при использовании градиентного элюирования смешанными растворителями.

Каждый сорбент, применяемый в эксклюзионной хроматографии, характеризуется определенным объемом пор и, следовательно, обладает определенной областью разделяемых молекулярных масс и определенным градуировочным графиком. При этом градуировочный график, характеризующий зависимость удерживаемого объема от молекулярной массы или размера молекул, имеет, как правило, сложный вид.

Неподвижные фазы в эксклюзионной хроматографии выбирают исходя из конкретных аналитических задач. Первоначально устанавливают, какая система растворителей может быть использована для анализа (водная или водно-органическая). В зависимости от этого определяют тип сорбента. Если необходимо провести разделение водорастворимых проб, в качестве неподвижных фаз применяют, например, набухающие в воде сшитые декстраны (сефадексы) или полиакриламиды (биогель Р). Разделение веществ, растворимых в органических растворителях, можно проводить на полистиролах с различной степенью сшивки, набухающих в органических растворителях (стирогель, порагель, биобид С). Такие набухшие гели, как правило, неустойчивы к давлению, при их использовании допускаются очень низкие скорости потока подвижной фазы, что увеличивает время анализа. Чтобы осуществить высокоэффективный вариант эксклюзионной хроматографии, необходимо применять неподвижные фазы с жесткими матрицами - силикагели, недостаток которых - высокая адсорбционная активность – устраняется силанизацией поверхности или подбором соответствующего по полярности элюента.

В качестве подвижных фаз в эксклюзионной хроматографии могут использоваться вещества, которые:

- полностью растворяют анализируемый образец;

- хорошо смачивают сорбент;

- противодействуют адсорбции компонентов пробы на сорбенте;

- имеют низкую вязкость и токсичность.

1.6.5. Плоскостная хроматография. К плоскостной хроматографии относятся тонкослойная и бумажная хроматографии. Эти виды жидкостной хроматографии просты по технике выполнения, экспрессны, не требуют дорогостоящего оборудования, что является их неоспоримым достоинством.

Разделение смеси веществ этими методами может быть выполнено с использованием различных хроматографических систем. Поэтому выделяют адсорбционную, распределительную, нормально- и обращенно-фазовую, ионообменную и т. п. бумажную и тонкослойную хроматографии. В настоящее время наибольшее распространение получила тонкослойная хроматография.

Бумажная и тонкослойная хроматографии сходны по технике выполнения. В качестве неподвижной фазы в бумажной хроматографии применяется целлюлозное волокно бумаги, в тонкослойной хроматографии - различные сорбенты (Al₂O₃, силикагель и др.), нанесенные равномерным тонким (100-300 мкм) слоем на стеклянную, металлическую или пластиковую подложку (носитель). Слой адсорбента на носителе может быть закреплен или не закреплен.

Хроматографическое разделение в плоскостных методах, как и на колонке, обусловлено переносом компонентов анализируемого вещества подвижной фазой вдоль слоя неподвижной фазы с различными скоростями в соответствии с коэффициентами распределения разделяемых веществ. В обоих случаях используются хроматографические системы жидкость - твердый сорбент (адсорбционный механизм разделения), жидкость - жидкость - твердый носитель (распределительный, ионообменный и другие механизмы).

В качестве подвижных фаз применяют различные растворители или их смеси, органические или неорганические кислоты.

Практическое получение плоскостных хроматограмм состоит в следующем.

На полоске хроматографической бумаги или на тонком слое сорбента карандашом отмечают стартовую линию на расстоянии 1 см от нижнего края полоски или пластинки. Микропипеткой наносят пробу на линию старта в виде пятна диаметром не более 2-3 мм. Затем край полоски или пластинки опускают в сосуд с подвижной фазой, находящийся в герметичной камере. По мере подъема подвижной фазы по полоске или пластинке и протекания обычных в хроматографии многократных элементарных актов сорбции-десорбции, распределения между двумя жидкими фазами, ионного обмена и др. происходит разделение компонентов анализируемой смеси. Процесс обычно продолжают до тех пор, пока растворитель не пройдет от линии старта ~10 см. После этого полоску или пластинку извлекают из камеры и высушивают. Если компоненты анализируемого вещества окрашены, они дают на хроматограмме соответствующие цветные пятна. Для обнаружения неокрашенных компонентов анализируемого вещества хроматограмму необходимо проявить. Проявление хроматограммы и детектирование компонентов пробы может быть проведено различными методами и зависит от состава анализируемых смесей. Проявление может быть осуществлено:

- с помощью УФ-освещения. Метод применим для обнаружения веществ, способных под действием УФ-излучения испускать собственное излучение (люминесцировать) видимого диапазона длин волн;

- посредством реагентов-проявителей. Например, присутствие в анализируемой смеси аминокислот может быть обнаружено с помощью нингидрина. Высушенную хроматограмму погружают в 0,2%-ный раствор нингидрина в ацетоне, затем высушивают ее. Пятна, соответствующие различным компонентам смеси, приобретают визуальную и, как правило, специфичную для каждого вещества окраску;

- с использованием иода. При этом детектируемую хроматограмму вносят в сосуд, на дне которого находятся кристаллы иода. Пары иода адсорбируются на пятнах сильнее, благодаря чему пятна визуализируются. Иод - это неспецифический реагент-проявитель. Используя специфические реагенты, можно не только определить количество компонентов смеси, но и идентифицировать разделенные вещества по цвету пятен.

Бумажную и тонкослойную хроматографии чаще всего осуществляют в так называемом восходящем варианте, описанном выше. Достаточно часто для улучшения качества хроматограмм приходится использовать и более сложные варианты плоскостной хроматографии, например, нисходящую, круговую, двухмерную. При проведении нисходящей бумажной или тонкослойной хроматографии анализируемое вещество наносится на стартовую линию пластинки или бумажной полоски, находящейся сверху, и элюент подается не снизу, а сверху. Положительный эффект, заключающийся в улучшении разделения, обусловлен вкладом в процесс разделения сил тяжести компонентов.

L₂

фронт

старт

L₁

Рис. 1.10. Вид и характеристики тонкослойной хроматограммы

Как восходящая, так и нисходящая хроматографии могут быть осуществлены в одно и двухмерном вариантах. В отличие от описанного выше одномерного процесса разделения в плоском слое при двухмерном хроматографическом разделении разделение анализируемой пробы сначала проводят в одном растворителе, затем осуществляют разделение в направлении, перпендикулярном первому, с использованием другого растворителя, повернув первую хроматограмму на 90^оС.

При проведении круговой хроматографии анализируемое вещество наносится в виде капли в середину пластинки или листа хроматографической бумаги. Сюда же каплями подается один или несколько растворителей. Это приводит к тому, что получаемая хроматограмма представляет собой набор радиальных пятен.

Положение пятен (зон), которые образуют разделенные компоненты анализируемого вещества на плоской хроматограмме, характеризуется величинами относительной скорости перемещения компонентов в тонком слое R_fi . Экспериментально величину R_fiопределяют как отношение расстояния L_i, пройденного i-м компонентом, к расстоянию L, пройденному растворителем от стартовой линии до линии фронта (рис. 1.10):

(1.41)

Величина R_fi зависит от природы соответствующего компонента анализируемой пробы, природы неподвижной фазы, ее толщины, природы и качества подвижной фазы, способа нанесения пробы и других факторов, но всегда R_fi £ 1.

Величина R_fi фактически тождественна времени удерживания вещества или его удерживаемому объему, характеризующим скорость прохождения вещества через хроматографическую колонку, и может быть использована для качественной идентификации компонентов анализируемой пробы, а диаметр пятна тождественен высоте или площади хроматографического пика и, следовательно, в некоторой степени отражает количественное содержание вещества.

Количественное определение состава анализируемой пробы в простейшем случае может быть оценено визуально по интенсивности собственной окраски пятен или интенсивности флуоресцентного свечения полученных пятен при УФ-детектировании. Для этих целей достаточно широко применяется элюирование хроматографических пятен. При этом пятно, полученное на хроматограмме, аккуратно вырезают или соскребают, обрабатывают подходящим растворителем и полученный раствор исследуют соответствующим физико-химичес-ким методом. Можно использовать и весовой метод, при котором соответствующее пятно вырезают из хроматограммы и взвешивают. Количество вещества определяют по разности весов чистой бумаги такой же площади и бумаги с веществом.

Бумажная (БХ) и тонкослойная хроматография (ТСХ) по механизму разделения относятся к распределительной хроматографии. В методе БХ носителем является специальная хроматографическая бумага с определенными свойствами. Неподвижной фазой служит вода, адсорбированная на поверхности и порах бумаги (до 20%), подвижной - органический растворитель, смешивающийся или несмешивающийся с водой, вода или растворы электролитов.

Механизм хроматографического разделения на бумаге довольно сложен. В неподвижной фазе вещество может удерживаться не только вследствие растворения в адсорбированной бумагой воде, но и адсорбироваться непосредственно целлюлозой. Нанесенные на бумагу разделяемые компоненты переходят в подвижную фазу и по капиллярам бумаги перемещаются с различными скоростями в соответствии с коэффициентом межфазного распределения каждого из них. В начале хроматографирования некоторая часть вещества из бумаги переходит в подвижную фазу и перемещаются далее. Когда органический растворитель достигает участка бумаги, не содержащего растворенное вещество, снова происходит перераспределение: из органической фазы вещество переходит в водную, сорбированную на бумаге. Поскольку компоненты обладают различным сродством к сорбенту, при перемещении элюента происходит разделение: одни вещества задерживаются в начале пути, другие продвигаются далее. Здесь сочетаются термодинамический (установления равновесного распределения веществ между фазами) и кинетический (движение компонентов с различной скоростью) аспекты разделения. В результате каждый компонент концентрируется на определенном участке бумажного листа: образуются зоны отдельных компонентов на хроматограмме. Использование хроматографии на бумаге имеет ряд существенных недостатков: зависимость процесса разделения от состава и свойств бумаги, изменение содержания воды в порах бумаги при изменении условий хранения, очень низкая скорость хроматографирования (до нескольких суток), низкая воспроизводимость результатов. Эти недостатки серьезно влияют на распространение хроматографии на бумаге как хроматографического метода.

В методе ТСХ процесс разделения смеси веществ осуществляется в тонком слое сорбента, нанесенного на инертную твердую подложку, и обеспечивается движением подвижной фазы (растворителя) через сорбент под действием капиллярных сил. По механизму разделения различают распределительную, адсорбционную и ионообменную хроматографию. Разделение компонентов происходит в этих случаях либо в результате их различного коэффициента распределения между двумя жидкими фазами (распределительная хроматография), либо вследствие различной адсорбируемости соединений сорбентом (адсорбционная хроматография). Адсорбционный метод основан на разной степени сорбции-десорбции разделяемых компонентов на неподвижной фазе. Адсорбция осуществляется за счет ван-дер-ваальсовских сил, являющейся основой физической адсорбции, полимолекулярной (образование нескольких слоев адсорбата на поверхности адсорбента) и хемосорбцией (химического взаимодействия адсорбента и адсорбата).

В случае использования для ТСХ таких сорбентов, как окись алюминия или силикагель в разделении играют роль как распределение, так и адсорбция на развитой активной поверхности сорбента (150- 750 м²/г). Распределение компонентов смеси происходит между водой на поверхности носителя (такие адсорбенты, как окись алюминия, крахмал, целлюлоза, кизельгур – и вода образуют неподвижную фазу), и перемещающимся через эту неподвижную фазу растворителем (подвижная фаза). Компонент смеси, легче растворимый в воде, перемещается медленнее, чем тот, который легче растворим в подвижной фазе.

Адсорбция проявляется в том, что между носителем, например, окисью алюминия, и компонентами смеси устанавливаются адсорбционные равновесия – для каждого компонента свое, результатом чего является разная скорость перемещения компонентов смеси. Можно выделить два крайних случая:

а) концентрация вещества на адсорбенте равна нулю. Вещество полностью растворяется в подвижной фазе и увлекается ею (перемещается вместе с фронтом растворителя).

б) вещество адсорбируется полностью, с растворителем не взаимодействует и остается на старте.

На практике при умелом подборе растворителя и адсорбента распределение соединения располагается между этими крайними случаями, и вещество постепенно переносится от одного слоя сорбента к другому за счет одновременно происходящих процессов сорбции и десорбции.

Растворитель, проходящий через сорбент, называют элюентом, процесс перемещения вещества вместе с элюентом - элюированием. По мере продвижения жидкости на пластинке происходит разделение смеси веществ благодаря действию сил адсорбции, распределения, ионного обмена или совокупности действия всех перечисленных факторов. В результате образуются отдельные хроматографические зоны компонентов смеси, т.е. получается хроматограмма.

Правильный подбор сорбента и элюента определяет эффективность разделения смеси. Подвижность исследуемого вещества зависит от его сродства к сорбенту и элюирующей силы (полярности) элюента. С увеличение полярности соединения растет и его сродство к полярному сорбенту. По увеличению степени адсорбции силикагелем органические соединения располагаются в ряд: углеводороды <алкилгалогениды»арены<нитросоединения<простые эфиры <сложные эфиры<альдегиды<спирты<амины<карбоновые кислоты. В свою очередь для силикагеля элюенты можно расположить в порядке возрастания «полярности» (элюирующей способности) и сформировать серию растворителей (элюотропный ряд) в соответствии с экспериментальными данными: алканы>бензол>хлороформ>диэтиловый эфир> этилацетат>спирты С₂-С₄>вода>ацетон>уксусная кислота>метанол. Таким образом, полярное соединение – спирт достаточно сильно адсорбируется на силикагеле и поэтому слабо перемещается под действием такого неполярного растворителя, как гексан, и остается около линии старта. В свою очередь неполярный ароматический углеводород бифенил заметно более подвижен в гексане, но даже здесь для достижения R_f около 0,5 необходим более полярный апротонный элюент – хлористый метилен. Силу элюента регулируют, используя смеси растворителей – соседей по элюотропному ряду с разной полярностью.

В настоящее время в ТСХ применяют главным образом следующие сорбенты: для разделения липофильных веществ - силикагель, окись алюминия, ацетилированную целлюлозу, полиамиды; для разделения гидрофильных веществ - целлюлозу, целлюлозные ионообменники, кизельгур, полиамиды. Важнейшей характеристикой сорбента является его активность, т.е. способность сорбировать (удерживать) компоненты разделяемой смеси. За рубежом ряд фирм производит силикагель, кизельгур и окись алюминия с добавкой 5% гипса, который используется для закрепления слоя сорбента при самостоятельном изготовлении пластин.

Наиболее распространенным сорбентом является силикагель - гидратированная кремниевая кислота, образующаяся при действии минеральных кислот на Na₂SiO₃ и сушкой образовавшегося золя. После размалывания золя используют фракцию определенной зернистости (указанную на пластинке, обычно 5-20 мкм). Силикагель является полярным сорбентом c группами -ОН в качестве активных центров. Он легко сорбирует на поверхности воду и образует водородные связи.

Окись алюминия является слабоосновным адсорбентом и используется в основном для разделения соединений слабоосновного и нейтрального характера. Недостатком пластин на окиси алюминия является обязательная активация поверхности перед использованием в сушильном шкафу при высокой температуре (100-150^оС) и низкая, по сравнению с силикагелем адсорбционная емкость слоя.

Кизельгур - адсорбент, полученный из природных минералов - диатомовых земель. Сорбент обладает гидрофильными свойствами и более низкой адсорбционной емкостью слоя в сравнении с силикагелем.

Целлюлоза: тонкослойные пластины с нанесенной целлюлозой очень эффективны для разделения сложных органических молекул. Адсорбент представляет собой в основном шарики целлюлозы диаметром до50 мкм, закрепленные на носителе крахмалом. Как и в бумажной хроматографии, подъем фронта растворителя происходит очень медленно.

Хроматографический анализ выполняется на промышленных пластинах чешского производства «Силуфол» («Silufol») из алюминиевой фольги, иногда укрепленной картоном, и «Силупласт» из пластмассы, покрытых слоем сорбентов – силикагеля LS 5-40 с крахмалом или гипсом в качестве связующего (до 10%), или оксида алюминия с добавлением и без флуоресцентных индикаторов. Пластинки «Силуфол» имеют высокую скорость элюирования, однако при этом характеризуются низкой разделяющей способностью и невысокой чувствительностью. При хранении чувствительны к условиям (влажность, температура, агрессивные среды и т.п.). Отдельные фирмы поставляют хроматографические пластинки со слоем сорбента различной (обычно до 0,25 мм), но строго постоянной толщины (силикагель, целлюлоза, ионообменная смола), на стекле и подложках из алюминиевой фольги, пластмассы, пропитанного стекловолокна.

Пластины «Sorbfil» (ТУ 26-11-17-89) выпускаются в России на полимерной основе (полиэтилентерефталат, марка П) или алюминиевой подложке (марка АФ) с нанесенным рабочим слоем микрофракционированного сорбента силикагеля марки СТХ-1А и СТХ-1ВЭ (выпускался в СССР как фракционированный силикагель КСКГ) толщиной 90-120 мкм (до 200 мкм), закрепленным специальным связующим - силиказолем. При использовании в качестве связующего золя кремневой кислоты (силиказоля), который после нагревания переходит в силикагель, полученные ТСХ-пластины состоят из двух компонентов: слоя силикагеля и подложки. Равномерность по толщины слоя сорбента на одной пластине составляет ±5 мкм. Пример обозначения: "Сорбфил-ПТСХ-АФ-В-УФ (10х10)" - пластинки для ТСХ высокоэффективные на алюминиевой подложке, с люминофором, 10х10 см.

Если применять стеклянную подложку (марка С), то такие пластины являются многоразовыми и химически прочными. Их химическая устойчивость определяется химической стойкостью силикагеля. В результате ТСХ-пластины могут многократно обрабатываться агрессивными реагентами, например, горячей хромовой смесью, что снимает ограничения в использовании коррелирующих реагентов для детектирования пятен и модификации сорбента, и позволяет проводить многократную (до 30 раз и более) регенерацию пластин хромовой смесью. Стеклянные пластинки могут быть нарезаны по необходимым размерам. Механическая прочность слоя сорбента может регулироваться, обеспечивая, с одной стороны, транспортировку и многократность обработки пластин и, с другой стороны, возможность экстракции слоев адсорбента с разделившимися веществами для последующего вымывания индивидуальных соединений из сорбента и их дальнейшего исследования инструментальными методами (ИК и УФ-спектрометрии, рентгено-структурными методами, ЯМР и т.д.).

Пластины различаются величиной фракций (распределения частиц) силикагеля, из которого состоит слой. На аналитических пластинах (марка А) фракция 5-17 мкм, на высокоэффективных (марка В) - 8-12 мкм. Более узкое распределение повышает эффективность пластин, т.е. пятна разделяемых веществ становятся более компактными (меньшими по размерам) и поэтому лучше разделяются при прохождении фронта элюента на более короткое расстояние. На российских пластинах аналитические и высокоэффективные слои различаются не очень сильно, в отличие от пластин фирмы Merck (Германия). Применять высокоэффективные пластины нужно, если вещества не разделяются на аналитических пластинах. Выпускаются пластины всех модификаций с люминофором (марка УФ) с возбуждением 254 нм. Срок хранения не ограничен, пластины «Sorbfil» широко испытаны в анализе производных аминокислот, пестицидов, липидов, антибиотиков.

Методом ТСХ осуществляется качественная идентификация компонентов. Количественное определение для ТСХ также возможно, для этого требуется нанесение точного количества вещества и дополнительные денситометрические исследования с четким фиксированием интенсивности пятен. Наиболее распространенным является полуколичественный метод. Он основан на визуальном сравнении размера и интенсивности пятна компонента с соответствующими характеристиками серии пятен этого же вещества различной концентрации (стандартные растворы сравнения). При использовании пробы в количестве 1-5 мкг таким простым методом обеспечивается точность определения содержания компонента около 5-10%. Нередко для определения компонентов в образце необходимо провести пробоподготовку для получения смеси, содержащей анализируемые соединения. Пробоподготовка основана на извлечении препаратов из образца органическими растворителями (н-гексан, петролейный эфир, диэтиловый эфир, хлороформ), очистке экстракта и последующем хроматографировании в тонком слое окиси алюминия или силикагеля.

Существует несколько вариантов ТСХ и БХ, различающихся способом подачи растворителя. В зависимости от направления движения подвижной фазы различают:

а) восходящую хроматографию - подвижную фазу наливают на дно разделительной камеры, бумага (пластинка) ставится вертикально;

б) нисходящую хроматографию - подвижная фаза подаётся сверху и перемещается вниз вдоль слоя сорбента пластины или бумаги;

в) радиальную хроматографию - горизонтальное продвижение фронта растворителя: подвижная фаза подводится к центру бумажного диска (пластины), куда нанесена разделяемая смесь.

Наиболее распространенным является восходящее элюирование (хроматографирование). Фронт элюента при этом перемещается снизу вверх. Выбор растворителя (подвижной фазы) определяется природой сорбента и свойствами разделяемых веществ.

Хроматографическое разделение методами БХ и ТСХ проводят в разделительной камере с притёртой крышкой. Количественной мерой скорости переноса вещества при использовании определенного адсорбента и растворителя является величина R_f (от англ. retention factor – коэффициент задержки, этот параметр является аналогией времени удерживания). Положение зоны хроматографируемого компонента устанавливают по величине коэффициента R_f, равной отношению скорости движения его зоны к скорости движения фронта растворителя. Величина R_fвсегда меньше единицы и не зависит от длины хроматограммы. На величину R_f оказывают влияние различные факторы. Так, при низкой температуре вещества перемещаются медленнее; загрязнения растворителей, негомогенность адсорбента, посторонние ионы в анализируемом растворе могут изменять величину R_fдо ±10%. В выбранной системе анализируемые вещества должны иметь различные значения R_fи распределяться по всей длине хроматограммы. Желательно, чтобы значения R_f лежало в пределах 0,05-0,85.

На практике величину R_f рассчитывают как отношение расстояния l, пройденного веществом, к расстоянию L, пройденному растворителем:

R_f = l / L (6.1)

Обычно для расчета выбирают центр пятна (рис. 1). Величина R_f зависит от многих факторов: типа хроматографической бумаги (ее пористости, плотности, толщины, степени гидратации) и сорбента (размера зерен, природы групп на поверхности, толщины слоя, его влажности, природы вещества, состава подвижной фазы), условий эксперимента (температуры, времени хроматографирования и т.п.). При постоянстве всех параметров хроматографирования значение R_f определяется только индивидуальными свойствами каждого компонента.

Рис. 1. Определение на хроматограмме величин Rf для компонентов А и В,

степени их разделения Rs и числа теоретических тарелок N.

Эффективность БХ и ТСХ также зависит от селективности и чувствительности реакций, используемых для обнаружения компонентов анализируемой смеси. Обычно используют реагенты, образующие с определяемыми компонентами окрашенные соединения - проявители. Для более надёжной идентификации разделяемых компонентов применяют «свидетели» -растворы стандартных веществ (в том же растворителе, что и проба), наличие которых предполагается в образце. Стандартное вещество наносят на стартовую линию рядом с анализируемой пробой и хроматографируют в одинаковых условиях. На практике часто используют относительную величину:

R_f rel = R_f x / R_f stand (6.2)

где R_f stand также рассчитывают по формуле (6.1). Эффективность хроматографического разделения характеризуют числом эквивалентных теоретических тарелок и их высотой. Так, в методе ТСХ число эквивалентных теоретических тарелок N_А для компонента А разделяемой смеси рассчитывают по формуле:

N_A = 16 (l_OA / a(A))² (6.3)

Значения l_OA и а(А) определяют, как показано на рис. 6.1. Тогда высота эквивалентной теоретической тарелки Н_А составляет:

H_A = l_OA / N = a(A)² / 16l_OA. (6.4)

Разделение практически возможно, если R_f_(А) - R_f_(В) ³ 0,1.

Для характеристики разделения двух компонентов А и В используют степень (критерий) разделения Rs:

Rs = Dl / (a(A) / 2 + a(B) / 2)= 2Dl / (a(A) + a(B)) (6.5)

где Dl - расстояние между центрами пятен компонентов А и В;

а(А) и а(В) - диаметры пятен А и В на хроматограмме (рис. 6.1). Чем больше Rs, тем чётче разделены пятна компонентов А и В на хроматограмме. Условия хроматографирования подбирают так, чтобы величина Rs отличалась от нуля и единицы, оптимальное значение Rs составляет 0,3-0,7. Для оценки селективности разделения двух компонентов А и В используют коэффициент разделения α:

α = l_B / l_A (6.6)

Если α = 1, то компоненты А и В не разделяются.

Основное оборудование для ТСХ

Для проведения анализа применяют пластины марки «Sorbfil» или «Силуфол» с УФ-индикатором: ПТСХ-АФ-В-УФ (с подложкой из алюминиевой фольги) или ПТСХ-П-В-УФ (с полимерной подложкой) размером 10×10 см или 10×15 см.

Хроматографическая камера 190×195×65 мм может использоваться как для пластин 10×10 см, так и 10×15 см.

Стеклянный капилляр применяются для нанесения анализируемых растворов на пластину. Для ускоренной сушки пластин (как после нанесения анализируемых растворов, так и после хроматографирования) можно применять нагревательные устройства различных конструкций, сушильный шкаф либо промышленные марки сушильных пистолетов.

Для определения положения пятен анализируемых веществ (детектирование) после хроматографирования применяется УФ-облучатель УФС-254/365 (ТУ 42154-004-16943778-99).

Техника эксперимента в ТСХ

Перед активацией в верхнем углу пластины карандашом рисуют стрелку направления движения растворителя, чтобы при хроматографировании оно было таким… Приготовление подвижной фазы.В колбу с притертой пробкой при перемешивании… Использовать одну порцию элюента для последовательного проведения нескольких анализов нежелательно по соображениям…

Сверхкритическая флюидная хроматография

В сверхкритической флюидной хроматографии (СФХ) подвижной фазой служит сверхкритический флюид – вещество, находящееся в сверхкритическом состоянии и… Величины критической температуры и критического давления для некоторых…

Важнейшие характеристики газов, сверхкритических флюидов и жидкостей

СФХ параметрами являются температура около 1,2 Тс и давление от 1 до 3 рс, т. е. находятся в диапазоне обычных для ГХ и ВЭЖХ условий, и,… Таблица 1.4

Критические величины для подвижных фаз в СФХ

Неподвижные фазы в СФХ могут находиться в набивных или капиллярных колонках. Набивные колонки заполняются адсорбентами с диаметром частиц 3–10 мкм,… Следует обратить внимание на важную роль точной установки температуры и… Благодаря тому, что СФХ объединила преимущества газовой и жидкостной хроматографии, она особенно полезна при…

Капиллярный электрофорез

Введение

С начала 80-х годов XX века получил становление и активное развитие новый инструментальный метод, относящийся к комбинированным методам разделения и анализа - капиллярный электрофорез (КЭ). Он позволяет анализировать ионные и нейтральные компоненты различной природы с высокой экспрессностью и уникальной эффективностью. В основе КЭ лежат электрокинетические явления - электромиграция ионов и других заряженных частиц и электроосмос. Эти явления возникают в растворах при помещении их в электрическое поле высокого напряжения. Если раствор находится в тонком кварцевом капилляре, то электрическое поле, наложенное вдоль капилляра, вызывает в нем движение заряженных частиц и пассивный поток жидкости (электроосмотический поток, ЭОП), в результате чего проба разделяется на индивидуальные компоненты, так как параметры электромиграции специфичны для каждого вида заряженных частиц. В то же время, такие возмущающие факторы, как диффузионные, сорбционные, конвекционные, гравитационные и др., в капилляре заметно ослаблены, благодаря чему достигаются рекордные эффективности разделений.

Традиционно КЭ сравнивают с высокоэффективной жидкостной хроматографией (ВЭЖХ), поскольку в обоих методах разделение происходит в ограниченном пространстве (капилляре или колонке) с участием движущейся жидкой фазы (буферного раствора или подвижной фазы (элюента)) и для регистрации сигналов используют схожие принципы детектирования и программы обработки данных. Тем не менее, у методов есть отличия, относящиеся к достоинствам капиллярного электрофореза:

— высокая эффективность разделения (сотни тысяч теоретических тарелок), недоступная ВЭЖХ и связанная с плоским профилем ЭОП

— малый объем анализируемой пробы и буферов (не более 1–2 мл в день), при этом практически не требуется применение высокочистых, дорогостоящих органических растворителей

— отсутствие колонки, сорбента, проблем с его старением и, значит, заменой колонки

— простая и недорогая аппаратура

— экспрессность и низкая себестоимость единичного анализа.

Из ограничений КЭ следует отметить невысокую, по сравнению с ВЭЖХ, концентрационную чувствительность и требование к анализируемым соединениям растворяться в воде или водно-органических смесях. В то же время, недостаточную чувствительность определения при использовании УФ-детектирования (из-за малой длины оптического пути, равного внутреннему диаметру капилляра) может скомпенсировать использование таких видов детектирования, как лазерно-индуцированное флуориметрическое или масс-спектрометрическое в сочетании с различными приемами on-line концентрирования пробы (т. н. стэкинг и свиппинг).

Системы капиллярного электрофореза «Капель» предназначены для количественного и качественного определения состава проб веществ в водных и водно-органических растворах методом КЭ (табл. 1).

Таблица 1.

Технические характеристики приборов серии «Капель»

Характеристики	Капель-103Р	Капель-103РТ	Капель-104Т	Капель-105 (105М)
Фотометричес-кий детектор	254 нм	190-380 нм
Высоковольт-ный блок	Постоянное напряжение 1-25 кВ, с шагом 1 кВ, сменная полярность, ток 0-200 мкА
Ввод пробы	Гидродинамический или электрокинетический
Смена проб	Ручная	Автоматическая, с двумя автосемплерами на 10 входных и 10 выходных пробирок
Промывка	При постоянном давлении 1000 мбар
Капилляр	Кварцевый, длина 30-100 см, внутренний диаметр 50 или 75 мкм
Охлаждение капилляра	Принудительное воздушное	Жидкостное с заданием и контролем температуры теплоносителя (в диапазоне от -10 до +30^оС от внешней температуры)
Возможность задания и изме-нения парамет-ров в ходе анализа	Время анализа, давление, напряжение	Время анализа, давление, температура, напряжение	Время анали-за, длина вол-ны, давление, температура, напряжение
Питание	187-242 В, 50/60 Гц
Потребляемая мощность, Вт
Габариты, мм	420´330´360	420´350´360	500´500´500
Масса, кг		25 (30 для 105М)
Сбор, обработка и ввод данных осуществляется с помощью персонального компьютера, на котором установлена программы сбора и обработки хромато-графических данных «МультиХром» 1,5х и 2,5х или «Эльфоран» для Windows^®.

«Капель-103Р» - наиболее простая модель с ручным управлением и пошаговым принципом работы. В прибор устанавливается только одна пробирка с анализируемым раствором. На приборе любой модификации без ограничений могут быть реализованы методики, использующие основные варианты КЭ - капиллярный зонный электрофорез (КЗЭ) или мицеллярную электрокинетическую хроматографию (МЭКХ). Первый вариант предназначен для анализа только ионных компонентов проб, второй - для анализа ионных и молекулярных форм веществ.

В системах «Капель» можно задавать и изменять в ходе анализа: давление, напряжение, время анализа, температуру (для систем с жидкостным охлаждением капилляра), длину волны (модели 105/105М).

Принятые термины и сокращения

Электроосмотический поток (ЭОП) - течение жидкости в капилляре под действием приложенного электрического поля. Время, необходимое жидкости для… Подвижность ЭОП (µэоп) - представляет собой отношение скорости ЭОП к… Электрофоретическая подвижность частицы (µэф) - по аналогии с предыдущей величиной представляет собой отношение…

Физико-химические основы метода капиллярного электрофореза

Рассмотрим процессы, происходящие в капилляре, заполненном электролитом и помещенном в продольное электрическое поле. Находящиеся на поверхности… В водном растворе силанольные группы способны к кислотной диссоциации. При рН=2,5 диссоциация силанольных групп…

Рис. 1а. Строение двойного электрического слоя.

Положительная часть ДЭС делится на две части: первую (неподвижную), непосредственно примыкающую к поверхности кварца, и вторую (диффузную), располагающуюся на некотором удалении от поверхности. В неподвижной части количество положительных зарядов меньше, чем отрицательных зарядов на поверхности кварца из-за увеличения размеров катионов вследствие гидратации.

В результате в диффузной части ДЭС образуется избыточная концентрация катионов. Между этими двумя слоями проходит т. н. граница скольжения - при наложении вдоль капилляра электрического поля неподвижная часть остается на месте, в то время как диффузная часть начинает мигрировать к катоду, увлекая за собой за счет межмолекулярного сцепления всю массу жидкости в капилляре. Возникает электроосмотический поток (ЭОП), который осуществляет пассивный перенос раствора внутри капилляра. Скорость ЭОП определяется рН: в сильнокислых растворах ЭОП отсутствует, в слабокислых его скорость незначительна, а при переходе в нейтральную и щелочную область рН скорость ЭОП возрастает до максимальной. С другой стороны, эта величина зависит от концентрации электролита в ведущем буфере: чем она больше, тем выше становится доля катионов в неподвижной части ДЭС, а толщина диффузной части уменьшается и, соответственно, уменьшается скорость ЭОП.

На рис. 1бпоказано распределение зарядов в ДЭС. Общий потенциал (Y), создаваемый диссоциированными силанольными группами, пропорционален заряду поверхности кварца. Часть этого потенциала (DY) нейтрализуется положительными зарядами ионов неподвижной части второй обкладки двойного слоя. Остальная часть положительных зарядов создает в приповерхностном слое раствора электрокинетический или x‑потенциал (дзета-потенциал).

Рис. 1б. Распределение зарядов в ДЭС.

Уникальное свойство ЭОП заключается в плоском профиле потока (в отличие от параболического в ВЭЖХ), который при движении зон компонентов внутри капилляра практически не вызывает их уширения (рис. 2). Благодаря этому метод КЭ характеризуется высочайшей эффективностью (10⁵ - 10⁷ теоретических тарелок).

Рис. 2. Влияние профиля потока на ширину зоны вещества.

В приборах для капиллярного электрофореза капилляр, заполненный раствором электролита, своими концами опущен в два содержащих тот же электролит сосуда, в которые введены электроды. Электролит должен обладать буферными свойствами, чтобы препятствовать изменению состава раствора в приэлектродных пространствах и стабилизировать состояние компонентов пробы в процессе анализа. При подаче на электроды высокого напряжения в капилляре быстро устанавливается стационарное состояние: через капилляр протекает постоянный ЭОП, на который накладывается взаимно противоположная электромиграция катионов и анионов.

Если в капилляр со стороны анода ввести небольшой объем раствора пробы, то ЭОП будет переносить эту зону к катоду в область детектирования, и зона некоторое время будет находиться в капилляре под воздействием электрического поля высокого напряжения. В течение этого времени заряженные компоненты пробы будут перемещаться в соответствии с их электрофоретическими подвижностями.

Катионные компоненты пробы, двигаясь к катоду, будут обгонять электроосмотический поток. Скорость их движения складывается из скорости ЭОП и скорости электромиграции, поэтому на выходе капилляра катионы появляются первыми и тем раньше, чем больше их электрофоретическая подвижность.

Нейтральные компоненты пробы перемещаются только под действием электроосмотического потока, тогда как анионные будут перемещаться к аноду со скоростями меньшими, чем скорость ЭОП. Медленно мигрирующие анионы появятся на выходе после ЭОП, а те, чья скорость электромиграции по абсолютной величине превышает скорость ЭОП, будут выходить из капилляра в прианодное пространство.

Если время нахождения пробы в капилляре (которое можно регулировать изменением напряжения, величины рН и концентрации ведущего электролита) достаточно, чтобы проявились различия в подвижности ионов, то на выходе капилляра у катода наблюдаются зоны раствора, в которых находятся индивидуальные компоненты пробы.

Ведущий электролит (рабочий буферный раствор) должен иметь такую концентрацию, при которой электрическое сопротивление раствора в капилляре будет достаточно велико. Это требование связано с тем, что при прохождении электрического тока в проводнике выделяется тепло. При чрезмерном нагреве и закипании жидкости пузыри пара прерывают ток в капилляре, что делает анализ невозможным. Выделяющаяся теплота расходуется на нагревание раствора, кварцевых стенок и полиимидной оболочки капилляра. Низкая теплоёмкость и высокая теплопроводность кварца способствуют эффективному отводу тепла во внешнюю среду, но без специальных мер жидкость в капилляре быстро закипает. Поэтому в приборах для КЭ всегда есть системы воздушного или жидкостного охлаждения.

Тепловое равновесие в капилляре устанавливается достаточно быстро и характеризуется небольшим различием температуры раствора в радиальном направлении во внутреннем канале капилляра и устойчивым градиентом температур между внутренней и внешней стенками капилляра. Нагрев жидкости не вызывает появления конвективных потоков, так как нагревание происходит равномерно по всему просвету капилляра. В результате не происходит перемешивание жидкости, приводящее к размыванию зон определяемых компонентов.

В зависимости от концентрации электролитов в растворах буфера и пробы поведение компонентов при разделении может несколько различаться. Если электропроводности ведущего электролита и пробы одинаковы, то падение напряжения на всей длине капилляра равномерно, и компоненты пробы равномерно перемещаются каждый с присущей ему скоростью. В этом случае на выходе капилляра (точнее, в зоне окна детектора) ширина пика будет приблизительно равна ширине зоны пробы (если пренебречь размыванием). Следовательно, эффективное разделение может быть достигнуто при введении возможно меньшего объема пробы (но для обеспечения необходимой чувствительности концентрация определяемых компонентов в пробе должна быть возможно выше).

Иное поведение наблюдается в случае, если электропроводность раствора пробы меньше электропроводности ведущего электролита. В этом случае в капилляре появляется участок с высоким сопротивлением и в соответствии с законом Ома падение напряжения на участке, занятом пробой, возрастает во столько раз, во сколько раз сопротивление пробы больше, чем сопротивление равного участка ведущего электролита. Таким образом, если сопротивление раствора пробы в капилляре будет в 10 раз больше, чем сопротивление ведущего электролита, градиент потенциала в зоне пробы будет в 10 раз выше, чем в остальной части капилляра. Высокий градиент потенциала в зоне пробы заставляет компоненты пробы быстрее мигрировать к границе зоны, где они в сконцентрированном и предварительно разделенном виде переходят в ведущий электролит, и там продолжают, но уже медленнее, движение к детектору. Описанное явление называется стекингом и широко используется в практике. Оно позволяет получать очень узкие пики определяемых компонентов и, как следствие, концентрация их в пике оказывается значительно выше, чем в исходной пробе. Практически стекинг осуществляется путем разбавления пробы перед вводом специальным буферным раствором (с концентрацией в 10 раз меньше, чем в рабочем буферном растворе) или дистиллированной водой.

В случае, когда электропроводность раствора пробы больше, чем электропроводность ведущего электролита, падение напряжения на участке пробы резко уменьшается. В результате скорость электромиграции компонентов пробы уменьшается, они медленнее достигают границы зоны, а при переходе в ведущий электролит скорость их движения увеличивается. Происходит размывание пиков, они накладываются друг на друга, эффективность разделения резко ухудшается.

В методе КЭ тонкий кварцевый капилляр, выполняющий основную разделяющую функцию, также служит электролитическим мостиком, замыкающим электрическую цепь. В электрических цепях, содержащих одновременно проводники первого и второго рода, протекание тока невозможно без электрохимических реакций на границах металл–раствор. В КЭ стараются использовать такие составы буферных ведущих электролитов, в которых на электродах происходит разложение воды (одним из самых распространенных буферов является раствор буры). На катоде происходит восстановление Н⁺, выделение Н₂ и образование в прикатодном пространстве ОН^-. На аноде - окисление ОН^-, выделение О₂ и образование в прианодном пространстве Н⁺.

На катоде: 2Н₂О + 2е^- ® Н₂ + 2ОН^-

На аноде: 4Н₂О – 4е^- ® О₂ + 4Н⁺

Эти два элементарных акта электрохимических реакций на электродах эквивалентны переходу через раствор электронов. Образующиеся ионы ОН^- и Н⁺ нейтрализуются буферными компонентами ведущего электролита: при использовании боратного буфера в прикатодном слое борной кислотой, в прианодном - борат-ионом. Таким образом, в приэлектродных пространствах происходит лишь изменение мольного соотношения компонентов буферной смеси, приводящее к незначительному изменению рН раствора. Нарушение стехиометрии растворов, т. е. образование в приэлектродных слоях избыточных концентраций катионов (в прианодном) и анионов (в прикатодном), а также нарушение электрического баланса в приэлектродных слоях вызывают электромиграцию избыточных ионов ведущего электролита во взаимно противоположных направлениях по эстафетному механизму. Каждый элементарный акт электродных реакций заставляет всю массу ионов в растворе переместиться на величину межионного расстояния в растворе. Скорость перемещения такова, что во всём объёме капилляра в любой его точке и в любой момент времени соблюдается электронейтральность раствора.

На рис. 4показано расположение капилляра и электрода в пробирке с раствором электролита, принятое в системах «Капель».

Рис. 4. Типичное расположение капилляра и электрода в пробирке с раствором.

Устье капилляра располагается в нижней трети объёма пробирки; электрод находится в верхней трети раствора. При таком расположении продукты электрохимических реакций - пузырьки газов и раствор ведущего электролита, содержащий продукты нейтрализации и отличающийся по составу от первоначального, не могут проникнуть в просвет капилляра. В то же время расход ведущего электролита вследствие ЭОП происходит за счет неизменённого раствора из средней трети объёма. Расчет показывает, что за 5–6 анализов буферная емкость ведущего электролита исчерпывается полностью. Для получения воспроизводимых результатов необходимо в среднем через каждые 3–4 анализа заменять свежими порциями растворы ведущего электролита в рабочих пробирках.

Основные варианты капиллярного электрофореза

Капиллярный зонный электрофорез (КЗЭ)является самым простым вариантом КЭ. Компоненты сложной смеси движутся в среде электролита с разными скоростями, образуя дискретные зоны. Отличительная особенность КЗЭ состоит в том, что он пригоден для разделения только ионогенных компонентов пробы, тогда как нейтральные соединения, не обладающие собственной электрофоретической подвижностью, движутся со скоростью ЭОП и выходят в зоне нейтральных компонентов, зоне маркера ЭОП.

В приборах КЭ с кварцевым капилляром полярность входного конца чаще всего положительная (анод), и ЭОП переносит зону пробы к катоду. Вблизи катодного выхода установлен детектор. При этих условиях катионные компоненты пробы, тоже мигрируя к катоду, обгоняют ЭОП и первыми достигают детектора в виде отдельных зон, которые на электрофореграмме регистрируются индивидуальными пиками. Через некоторое время детектора достигает зона исходного раствора, в которой остались нейтральные компоненты пробы. В зависимости от того, поглощают они или нет, на электрофореграмме регистрируется прямой (или обратный) системный пик. Для идентификации системного пика в пробу добавляют соединения - маркеры ЭОП, например, бензиловый спирт. Что касается анионных компонентов пробы, то их поведение зависит от соотношения скоростей ЭОП и электромиграции анионов. Если скорость миграции аниона превышает скорость ЭОП, то такой анион рано или поздно выйдет из капилляра в прианодное пространство. Если же скорость электромиграции аниона меньше скорости ЭОП, то такой анион может быть зарегистрирован на той же электрофореграмме после выхода системного пика. В этом варианте КЗЭ с положительной полярностью определяются катионные компоненты проб и большинство органических анионов.

Чтобы методом КЗЭ можно было определять все анионные компоненты проб (в основном, неорганические) необходимо изменить полярность прикладываемого напряжения. Однако в этом случае изменится не только направление миграции анионов, но также направление ЭОП. Для преодоления этого противоречия необходимо модифицировать поверхность кварцевого капилляра так, чтобы знаки зарядов двойного электрического слоя поменялись на обратные. Это достигается введением в рабочий буферный раствор катионного поверхностно-активного вещества, например, бромида цетилтриметиламмония (ЦТАБ). Катион ЦТА⁺ активно сорбируется на кварцевой поверхности, занимая при достаточной его концентрации все вакансии в ближайшем к поверхности слое. Поверхность как бы «ощетинивается» длинными цетильными (С₁₆Н₃₃-) цепочками. Ставшая гидрофобной поверхность при дальнейшей промывке рабочим буферным раствором сорбирует еще один слой поверхностно-активного катиона, ориентированного аммонийным концом наружу (сорбция «щетка в щетку»). В результате первый слой двойного электрического слоя становится положительным, а второй, включая диффузную часть, - отрицательным, и ЭОП снова движется от входного конца к детектору, несколько отставая от мигрирующих быстрее анионов.

Повышение селективности КЗЭ может быть достигнуто за счет изменения рН ведущего электролита и введения в состав буфера различных добавок: ПАВ, макроциклов, органических растворителей.

Мицеллярная электрокинетическая хроматография (МЭКХ) объединяет электрофорез и хроматографию; получила наиболее широкое распространение среди других вариантов капиллярного электрофореза за счет способности разделять как ионогенные, так и незаряженные компоненты пробы. Разделение нейтральных соединений стало возможным благодаря введению в состав ведущего электролита поверхностно-активных веществ (ПАВ) - мицеллообразователей. Чаще всего используют анионные ПАВ (например, додецилсульфат натрия - ДДСН) в концентрациях выше критической концентрации мицеллообразования (ККМ), которая для ДДСН в водном растворе составляет 8 мМ. В этом случае в растворе электролита находятся преимущественно мицеллы и небольшая доля мономерной формы ПАВ. Мономеры состоят из гидрофобного «хвоста» и гидрофильной (в случае анионного ПАВ отрицательно заряженной) «головы». При формировании прямых мицелл мономерные фрагменты агрегируются неполярными концами внутрь, а внешняя сферическая поверхность мицеллы становится отрицательно заряженной. Каждая мицелла окружена собственным двойным электрическим слоем (ДЭС), внешнюю диффузную часть которого формируют катионы, присутствующие в растворе ведущего электролита. Число мономеров, образующих мицеллу, может колебаться от 60 до 100 молекул, однако общий заряд мицеллы существенно меньше из-за наличия в неподвижной части второго слоя ДЭС гидратированных катионов. Ни мицеллярная, ни мономерная форма АПАВ не взаимодействуют со стенкой кварцевого капилляра, но при подаче на капилляр высокого напряжения обе формы мигрируют к аноду, в то время как ЭОП направлен к катоду. Если в капилляр на анодной стороне ввести пробу, содержащую нейтральные и заряженные компоненты, то ЭОП будет переносить их к катоду, а навстречу будет двигаться поток отрицательно заряженных мицелл АПАВ. Нейтральные компоненты пробы распределяются между фазой раствора и мицеллярной фазой, причем константа распределения специфична для каждого соединения. В результате на выходе капилляра регистрируется электрофореграмма нейтральных компонентов, а также медленно мигрирующих анионов пробы.

Аппаратура

Общее устройство систем КЭ

Минимальный состав системы, реализующей метод капиллярного электрофореза, должен включать следующие узлы: кварцевый капилляр, источник высокого напряжения, устройство ввода пробы, детектор и систему сбора, обработки и вывода информации (рис. 5).

Рис. 5. Устройство системы капиллярного электрофореза.

Дополнительными устройствами в системах КЭ являются автосемплер и блок жидкостного охлаждения капилляра.

Капилляры

Большинство разделений в КЭ ведут на непокрытых изнутри немодифицированных капиллярах. Их подготовка к анализу начинается с промывки раствором… В зоне ввода пробы торцевой срез должен быть выполнен строго под углом 90° к… С точки зрения анализа кондиционное состояние капилляра следует понимать так, что выполняемые последовательно анализы…

Источники высокого напряжения

Обычно переключение полярности происходит в ручном режиме со сменой высоковольтных блоков. Также существуют приборы с автоматическим переключением… Безопасность работы достигается автоматическим отключением высокого напряжения… Запись кривых тока и напряжения и визуальный контроль их значений на мониторе компьютера могут указать на случайные…

Ввод пробы

Непосредственно перед вводом пробы капилляр промывают рабочим буферным раствором, удаляя остатки пробы от предыдущего ввода. Различают гидродинамический, электрокинетический и гидростатический способы… Ввод пробы давлением (гидродинамический, пневматический) обеспечивается созданием разницы давлений между сосудом для…

Детекторы

Детектирование в системах КЭ может осуществляться: непосредственно у выходного конца капилляра в режиме реального времени. Этот… непосредственно на выходном конце капилляра;

Системы термостабилизации. Сбор и обработка данных

Наиболее простым вариантом охлаждения капилляра является интенсивный обдув комнатным воздухом. Дополнительно используют жидкостные системы термостатирования с диапазоном температур 4-70°С ± 0,1°С. Как правило, термостатируют только капилляры. Термостатирование автозагрузчика пробы ценно при анализе термолабильных образцов. После загрузки в автосемплеры проб, рабочих буферов и вспомогательных растворов измерения проводятся в автоматическом режиме по заданным параметрам.

Все приборы КЭ комплектуются программными продуктами, позволяющими записывать данные, проводить их качественную и количественную обработку, формировать отчеты. Некоторые программы способны также управлять системами капиллярного электрофореза.

Эффективность разделения

Метод КЭ характеризуется высокой эффективностью. Эффективность N, выраженная числом теоретических тарелок, может быть определена непосредственно из электрофореграммы по уравнению (1):

N = 5,55 * (t_м/ W_1/2)² (1)

где t_м - время миграции аналита, W_1/2- ширина пика на ½ высоты.

Основными причинами, приводящими к снижению N, являются:

величина зоны вводимой пробы, определяемая длительностью ввода: в идеале она должна быть как можно меньше, однако достижение низких пределов обнаружения требует увеличения объема пробы или ее концентрирования;

температурный градиент: при анализе в капилляре протекает электрический ток, величина которого зависит от удельной проводимости буфера и диаметра капилляра (D). Отвод тепла происходит через стенки капилляра, что приводит к возникновению в буфере радиального температурного градиента. Разница в температуре между серединой и стенками капилляра возрастает пропорционально D². Температура в центре капилляра может быть на 10°С выше, чем на внутренней стенке. Возникающий вследствие этого градиент вязкости приводит к тому, что вещество у стенки перемещается медленнее, чем в центре, что влечет за собой уширение полос и снижение эффективности;

адсорбция на стенках капилляра - взаимодействие веществ со стенками капилляра ведет к искажению формы пиков («хвосты»);

различия в электропроводности пробы и ведущего электролита: уширение пика, обусловленное электрофоретическими эффектами, пропорционально проводимости раствора образца относительно буфера. В случае высокой концентрации пробы градиент потенциала (и линейные скорости ионов) в зоне образца заметно ниже, чем в ведущем электролите. Благодаря этому происходит дестэкинг - уширение пиков. Обратная ситуация в соотношении проводимостей (стэкинг), наоборот, приводит к формированию узких пиков на электрофореграмме;

различия в уровне буферов во входном и выходном сосудах приводят к возникновению гидродинамического потока с параболическим профилем; чем больше диаметр капилляра, тем значительней это сказывается на эффективности разделения.

продольная диффузия в КЭ практически не дает уширения зоны вещества, что в основном обусловлено плоским профилем ЭОП.

Чувствительность метода

Подходы к увеличению чувствительности делятся на 3 категории: стратегия концентрирования образца; увеличение длины оптического пути; использование… Стэкинг (stacking) - один из наиболее общих подходов к увеличению… Свипинг (sweeping) - техника концентрирования нейтральных частиц в МЭКХ, суть которой заключается в том, что аналиты…

Разрешение и селективность разделения

Полное или частичное разделение компонентов пробы характеризуется параметром Rs(разрешение). Чаще всего в КЭ разрешение двух компонентов определяют так же, как в ВЭЖХ:

Rs = 2 * (t₁ – t₂) / (W₁ + W₂) (2)

где t₁ и t₂ - времена миграции компонентов, мин.;

W₁ и W₂ — ширина пиков 1 и 2 при основании, мин.

Разрешение в КЭ, в основном, управляет эффективностью, а не селективностью. В этом заключается отличие КЭ от ВЭЖХ, где картина прямо противоположная. Благодаря узким зонам компонентов в КЭ даже очень малые различия в электрофоретической подвижности веществ (<0,05 %) оказываются достаточны для полного разделения.

Если выразить Rsчерез эффективность:

Rs = 0,25 * (N)^1/2 * (Dm / m_ср) (3)

где Dm = m₁ - m₂, а m_ср = (m₁ + m₂) / 2

то становится очевидным, что в противоположность эффективности, линейно возрастающей при увеличении рабочего напряжения, разрешение будет расти не так заметно.

Существующее многообразие вариантов КЭ обеспечивает различную селективность разделения вследствие отличающихся механизмов разделения. Так, в зонном варианте КЭ при разделении компонентов 1 и 2 фактор селективности (α) определяется выражением:

α = m₁ / m₂ (4)

где m₁ и m₂ - электрофоретические подвижности компонентов 1 и 2.

При концентрации ПАВ в растворе электролита больше ККМ реализуется вариант МЭКХ с главным принципом разделения на основе распределения компонентов пробы между гидрофильной (водной) и гидрофобной (мицеллярной) фазами, селективность которого будет определяться отношением факторов емкости двух компонентов: α = k'₂ / k'₁. В режиме МЭКХ k'можно найти по уравнению (5):

k' = (t_a – t₀) / t₀ * (1 – t_a / t_m) (5)

где t_a - время миграции анализируемого вещества,

t₀ - t_удерж компонента, абсолютно не удерживаемого мицеллой,

t_m - t_удерж компонента, полностью удерживаемого мицеллой.

Для нахождения t₀и t_mв пробу вводят маркер ЭОП (ацетон) и метку мицелл (судан 3 или судан 4), соответственно.

Задача повышения селективности разделения в КЭ требует знания факторов, ее определяющих, и может быть решена за счет изменения рН ведущего электролита, введения в состав буфера различных добавок ПАВ, макроциклов, органических растворителей (табл. 3). Скорость ЭОП не изменяет селективности разделения и определяет лишь изменение времени миграции на равную величину для всех компонентов пробы.

Таблица 3.

Факторы, определяющие параметры разделения в методе КЭ.

Факторы селективности	Характер влияния
рН ведущего электролита	Изменение заряда и формы нахождения вещества в растворе, скорости ЭОП
Ионная сила ведущего электролита	Изменение скорости ЭОП
Напряжение	Скорость ЭОП и электромиграции ионов, температурный градиент в капилляре
Параметры гидродинамического или электрокинетического способа ввода пробы	Селективное концентрирование при вводе пробы, объемная и концентрационная перегрузка системы разделения
Длина и внутренний диаметр капилляра	Изменение времени анализа и скорости ЭОП, температурный градиент
Температура	Вязкость электролита, сольватация и химические равновесия
Добавка ПАВ в ведущий электролит	Мицеллообразование при ККМ. Ион-парные взаимодействия. Обращение ЭОП
Добавка органических растворителей в ведущий электролит	Преимущественно снижение скорости ЭОП. Сольватация
Добавка макроциклов в ведущий электролит	Образование комплексов включения. Растворение гидрофобных компонентов Селективное хиральное распознавание

Ведущий электролит чрезвычайно важен для успешного разделения в любом варианте КЭ. Величина рН электролита определяет как скорость течения жидкости в капилляре (величину ЭОП), так и заряд компонента в растворе. Чувствительность ЭОП к изменению рН раствора предполагает использование ведущих электролитов с высокой буферной емкостью и диапазоном рН равным рКа ± 1. Вследствии высокой стабильности кварцевого капилляра, при электрофоретическом разделении можно использовать буферные системы с рН от 2 до 12. Среди наиболее распространенных электролитов следует упомянуть фосфатный (рК₁ = 2,1 и рК₂ = 7,2), ацетатный (рКа = 4,7), имидазольный (рК_ВН+ = 7,0), триоксиметиламинометановый (TRIS, рК_ВН+ = 8,1), боратный (рК₁ = 9,2) и 2-(N-циклогексиламино)этансульфонатный (CHES, рКа = 9,5) буферные растворы.

Буфер для проведения КЭ должен обладать достаточной буферной емкостью в выбранном диапазоне рН, иметь малое поглощение на длине волны детектирования и низкую подвижность ведущего иона.

Список оптимальных буферов возглавляют боратный буфер и TRIS, так как они могут использоваться в широком диапазоне концентраций без существенного увеличения тока, что позволяет, в свою очередь, применять максимально высокие напряжения в ходе анализа.

Среди используемых в КЭ добавок наиболее популярны ПАВ. Их введение в состав буферов позволяет влиять на селективность разделения, причем определяющими факторами являются тип и концентрация ПАВ. В КЭ используются ионогенные (катионные КПАВ и анионные АПАВ), а также цвиттер-ионные и нейтральные ПАВ.

При концентрации ниже ККМ мономерные формы ионогенных ПАВ модифицируют стенки капилляра (ЦТАБ), влияют на поведение зоны пробы в капилляре и на стенки самого капилляра, модифицируя ЭОП (уменьшая, увеличивая или обращая).

Органические растворители (метанол, ацетонитрил и др.), которые вводят в буферный раствор в концентрации до 30 %, повышают растворимость анализируемых соединений, делая КЭ пригодным для анализа веществ с ограниченной растворимостью в водных средах.

Макроциклические реагенты как компоненты ведущих электролитов широко распространены в КЭ. Макроциклическими называют органические соединения, молекулы которых содержат не менее 9 атомов в цикле, причем не менее 3 из них - гетероатомы (О, N и S). К макроциклическим соединениям относят циклодекстрины, краун-эфиры, криптанды, каликсарены и др. Все они способны взаимодействовать как с неорганическими веществами, так и с органическими субстратами различной природы, при этом происходит включение фрагментов анализируемых веществ в полость макроцикла (МЦ). В образующихся при этом комплексах включения по типу «гость–хозяин» «хозяином» служит макроцикл, а «гостем» - субстрат. В зависимости от своего строения МЦ могут связывать молекулярные, катионные или анионные субстраты за счет нековалентных взаимодействий: ион-ионных, ион-дипольных, гидрофобных, водородных связей.

Использование макроциклических добавок для хиральных и ахиральных разделений возможно в зонном и мицеллярном вариантах, причем селективность последнего будет выше за счет распределения компонентов смеси между тремя фазами: водной, псевдостационарной мицеллярной и псевдостационарной фазой макроцикла.

Обработка результатов в капиллярном электрофорезе.

Качественный и количественный анализ

В КЭ используют те же принципы интегрирования пиков, методы градуировки, способы формирования отчетов, как в газовой хроматографии и ВЭЖХ. По… Качественный анализ обычно состоит в сравнении времен миграции (для КЗЭ) или… При качественном анализе близких пиков рекомендуется использование метода добавок. Если на электрофореграмме…

Количественная обработка результатов анализа

Основным методом градуировки является метод внешнего стандарта (абсолютной градуировки), для которого необходимо иметь ГСО или химически чистые… Современные программные комплексы позволяют собирать и обрабатывать…

Объекты для анализа методом КЭ. Подготовка пробы

Первым этапом анализа является отбор и подготовка пробы. Отобранная проба должна быть представительной, а процедура отбора пробы - легко… Схема анализа пробы, разбавленной буфером с минимальной электропроводностью… а) для анализа катионов используют 25мМ фосфатный буфер (рН 2,5);

Области применения метода капиллярного

Электрофореза и примеры использования

Анализ объектов окружающей среды.

Анализ NH₄⁺, щелочных и щелочноземельных металлов (рис. 9-10)

Рис. 9. Электрофореграмма модельного раствора катионов.

«Капель-105», капилляр: внутр. диаметр 75 мкм, Lэфф / Lобщ = 50/60 см.

Ведущий электролит: 6 мМ БИА, 2,5 мМ винная кислота, 2 мМ 18-краун-6.

Ввод пробы: гидродинамический 150 мбар*с. Напряжение: +10 кВ.

Температура: 20°С. Детектирование: 254 нм, косвенное.

Определение 8 катионов в одной порции пробы. Макроцикл 18-краун-6 используется как селективная добавка для разделения К⁺ и NH₄⁺. Методики определения катионов щелочных и щелочноземельных металлов и важнейших неорганических анионов методом КЭ нашли широкое применение в экологическом контроле природных, питьевых, сточных и технологических вод, метрологически аттестованы и реализованы на системах КЭ «Капель».

Анализ NH4+, K+, Na+, Mg2+, Ca2+ в реальных водах

Рис. 9. Электрофореграмма очищенной сточной воды (разбавлена в 5 раз).

«Капель-105», капилляр: внутр. диаметр 75 мкм, Lэфф / Lобщ = 50/60 см.

Ведущий электролит: 10 мМ БИА, 5 мМ винная кислота, 2 мМ 18-краун-6.

Ввод пробы: гидродинамический 300 мбар*с. Напряжение: +13 кВ.

Температура: 20°С. Детектирование: 254 нм, косвенное.

Предложенная схема анализа применима к питьевым, природным и сточным водам. Подготовка пробы заключается в обязательном ее фильтровании, при необходимости разбавлении, центрифугировании.

Анализ неорганических анионов с обращением ЭОП (рис. 9)

Рис. 9. Электрофореграмма модельного раствора анионов, модификатор электроосмотического потока ЦТАБ.

«Капель-105», капилляр: внутр. диаметр 75 мкм, Lэфф / Lобщ = 50/60 см.

Ведущий электролит: 5 мМ СrO₃, 20 мМ ДЭА, 1,7 мМ ЦТАБ.

Ввод пробы: гидродинамический 300 мбар*с. Напряжение: -18 кВ.

Температура: 20°С. Детектирование: 254 нм, косвенное.

При анализе анионов применяют косвенное детектирование. Модификатор ЭОП цетилтриметиламмония бромид (ЦТАБ) дает отрицательный пик Br^- между пиками Cl^- и NO₂^-. Последний отрицательный пик обусловлен избытком HCO₃^- в буфере по сравнению с пробой.

Анализ неорганических анионов без обращения ЭОП (рис. 9)

Рис. 9. Электрофореграмма раствора анионов без модификатора ЭОП.

«Капель-105», капилляр: внутр. диаметр 75 мкм, Lэфф / Lобщ = 50/60 см.

Ведущий электролит: 5 мМ СrO₃, 20 мМ ДЭА. Ввод пробы: гидродинамический 300 мбар*с. Напряжение: -18 кВ. Температура: 20°С.

Детектирование: 254 нм, косвенное.

Разделение неорганических анионов можно проводить без модификации внутренней поверхности капилляра, с отрицательной полярностью напряжения и косвенным режимом детектирования.

Анализ неорганических катионов в яблочном соке (рис. 9)

Рис. 9. Электрофореграмма неорганических катионов в яблочном соке.

«Капель-105», капилляр: внутр. диаметр 75 мкм, Lэфф / Lобщ = 50/60 см.

Ведущий электролит: 6 мМ БИА, 2,5 мМ винная кислота, 2 мМ 18-краун-6. Ввод пробы: гидродинамический 200 мбар*с. Напряжение: +12 кВ. Температура: 20°С. Детектирование: 254 нм, косвенное.

Определение неорганических катионов в свежевыжатых и консервированных соках (разбавление 1:9).

Анализ ионного состава воды. Определение неорганических

Катионов (NH4+, K+, Na+, Li+, Mg2+, Sr2+, Ba2+, Ca2+).

Особенности методики, практические рекомендации

Для определения катионов щелочных и щелочноземельных металлов используют источник высокого напряжения положительной полярности. Это классическая…

Рис. 9. Электрофореграмма модельного раствора катионов.

«Капель-105», капилляр: внутр. диаметр 75 мкм, Lэфф/Lобщ = 50/60 см.

Ведущий электролит: 10 мМ БИА, 5 мМ винная кислота, 2 мМ 18-краун-6.

Ввод пробы: гидродинамический 30 мбар*10 с. Напряжение: +13 кВ.

Температура: 20°С. Детектирование: 267 нм, косвенное.

Важно знать катионный состав дистиллированной воды, так как от этого будет зависеть возможность и достоверность определения низких концентраций анализируемых катионов (особенно NH₄⁺).

Определение анионов (Cl^-, SO₄²^-, NO₂^-, NO₃^-, F^-, HPO₄²^-)

Для определения анионов в приборе «Капель» необходимо установить источник высокого напряжения отрицательной полярности. Тогда электрод на входном конце капилляра будет катодом, а электрод выходного конца - анодом, и анионы будут мигрировать в сторону выходного конца, т. е. к детектору.

На рис. 10 а)показано направление движения ЭОП в противоположную от анионов сторону. Скорость движения анионов заметно превосходит скорость течения жидкости в капилляре, тем не менее, разнонаправленные потоки могут существенно увеличивать времена анализа анионов. Для использования транспортной функции ЭОП, который только переносит зоны разделенных компонентов, не принимая участия в самом процессе разделения, принято обращать направление движения ЭОП (рис. 10б), вводя в состав катионные ПАВ.

Рис. 10. Схемы анализа неорганических анионов.

Ведущий электролит для анализа анионов должен удовлетворять ряду условий.

Во-первых, он должен быть щелочным, так как большинство определяемых анионов существуют только в щелочных средах.

Во-вторых, основой электролита должен быть анион, имеющий сильную полосу поглощения в области 254 нм, так как большинство анионов не обладают собственными полосами поглощения в указанной области, и их определяют только косвенным методом.

В-третьих, ведущий электролит должен содержать добавку для обращения направления электроосмотического потока, так как в противном случае ЭОП, направленный к катоду, резко замедлит или сделает невозможной электромиграцию анионов к детектору.

В-четвертых, катионный компонент ведущего буферного раствора должен быть катионом достаточно сильного основания с малой подвижностью, чтобы обеспечить малую электропроводность раствора.

На практике рабочий буферный раствор состоит из смеси диэтаноламина (основание) и хромовой кислоты с добавкой катионного ПАВ - бромида (лучше гидроксида) цетилтриметиламмония (ЦТАБ или ЦТАОН). Избыток диэтаноламина (ДЭА) создает слабо щелочную среду (рН ~9), анион CrO₄²^- обеспечивает необходимое светопоглощение, а катион ЦТА⁺, сорбируясь на поверхности кварцевого капилляра, перезаряжает поверхность на положительную, чем достигается изменение направления ЭОП.

Бромид цетилтриметиламмония [C₁₆H₃₃(CH₃)₃N]⁺Br^- легко растворим в воде. Как катионное ПАВ, ЦТАБ в малых концентрациях образует истинные растворы, а при более высоких - коллоидные. Частицы коллоидного раствора – мицеллы – представляют собой сферические образования, состоящие из 60–100 катионов, обращенных азотным концом наружу, которые несут соответствующий положительный заряд, нейтрализуемый эквивалентным количеством анионов. ККМ для ЦТАБ равна 7 ммоль/л.

Порядок миграции анионов: Cl^-, NO₂^-, SO₄²^-, NO₃^-, F^-, HPO₄²^-. Все пики разрешаются полностью. Выход пика гидрокарбоната, который всегда присутствует в буферном растворе и в растворе пробы, может служить сигналом для окончания анализа.

На электрофореграммах стандартных растворов и растворов проб часто наблюдаются отрицательные пики. Их появление связано с тем, что в растворах проб (стандартов) отсутствуют анионы, которые находятся в растворе ведущего электролита. Первый такой пик может наблюдаться между пиками Cl^- и NO₂^- и связан с присутствием в составе ведущего электролита анионов Br^- (для ЦТАБ в качестве модификатора ЭОП, рис. 11а). Величина этого «бромидного провала» пропорциональна общей концентрации анионов в пробе, и затрудняет автоматическую разметку пика нитрита (исправляется вручную).

Второй отрицательный пик часто наблюдается после пика HPO₄²^-. Его появление объясняется тем, что при хранении буферные растворы поглощают все большие и большие количества СО₂. В ряде случаев концентрация НСО₃^- в пробе может оказаться меньше, чем в ведущем электролите, и тогда на электрофореграмме на месте пика НСО₃^- появляется отрицательный пик. В особых случаях он может быть настолько большим, что будет мешать автоматической разметке пика HPO₄²^-.

Рис. 11. Электрофоретическое разделение неорганических анионов

В присутствии (а) и в отсутствие (б) Br- в составе ведущего электролита.

Это является сигналом к тому, чтобы заново приготовить свежий раствор ДЭА (быстрее всех поглощает СО₂) или полностью заменить компоненты ведущего электролита на свежеприготовленные. Количественное определение НСО₃^- невозможно из-за его неконтролируемого содержания в используемых растворах.

1.9. Качественный хроматографический анализ

Задача качественного хроматографического анализа состоит в том, чтобы установить принадлежность полученных на хроматограмме пиков конкретным химическим соединениям. Функция хроматографической колонки в хроматографии сводится лишь к разделению анализируемого вещества на индивидуальные компоненты. Определение их качественного состава проводится за пределами колонки и может быть осуществлено или по характеристикам удерживания каждого из компонентов в данной колонке при конкретных условиях разделения, или с использованием других аналитических приемов. В первом случае на выходе из хроматографической колонки компоненты анализируемой пробы проходят через детектор и фиксируются в виде хроматограммы. Во втором случае компоненты анализируемой пробы на выходе из колонки направляются в какой-либо анализатор, где и анализируются одним из химических или физических методов, их сочетанием, или сочетанием хроматографических, химических и физических методов.

Для детальной идентификации компонентов сложной пробы часто недостаточно провести ее разделение на одной хроматографической колонке, а приходится прибегать к сложной схеме анализа, включающей целый комплекс методов. Часто применяют многоступенчатые схемы анализа, которые позволяют не только идентифицировать компоненты пробы, но и ускорить и удешевить анализ.

В зависимости от состава анализируемой смеси, а также имеющейся аппаратуры и эталонных веществ можно использовать различные методы идентификации.

I. Методы идентификации на одной колонке.

I.1. Применение индивидуальных эталонных веществ или их смесей

Один из вариантов этого метода состоит в последовательном разделении в одинаковых условиях анализируемой смеси и эталонной смеси. Метод можно использовать, если имеются веские основания для предположения о составе эталонной смеси, которые могут быть получены, как правило, кропотливыми предварительными исследованиями. Причиной для идентификации компонентов смеси в этом случае служит равенство времени удерживания пиков соответствующих компонентов анализируемой и эталонной смесей. Если расход газа-носителя при проведении анализов этих смесей неодинаков, то вместо времени удерживания для идентификации пиков используют значения исправленного времени удерживания или исправленных удерживаемых объемов.

Второй вариант этого метода заключается в том, что в анализируемую пробу вводят эталонный компонент, наличие которого в этой смеси предполагается. Увеличение высоты соответствующего пика без его существенного расширения (размытия) по сравнению с высотой этого пика на хроматограмме, полученной до введения эталона, может служить указанием на присутствие искомого соединения в анализируемой смеси.

Данный метод прост методически, но имеет следующие недостатки:

- необходимо иметь эталонные вещества;

- все пики, полученные при разделении на используемой колонке, должны гарантированно соответствовать индивидуальным веществам.

И даже при соблюдении этих условий нет абсолютных гарантий однозначного проведения идентификации, так как практически всегда имеются по меньшей мере два вещества, удерживаемые объемы которых на применяемой колонке близки, и такими веществами вполне могут оказаться любой компонент смеси и вещество, использованное в качестве эталона, которые между собой не тождественны. Для окончательной идентификации компонентов пробы необходимо подтверждение их химической индивидуальности химическими или физическими методами.

I.2. Использование табличных данных о характеристиках удерживания

В настоящее время опубликовано большое количество таблиц относительных удерживаемых объемов для самых разных веществ. Эти таблицы, а также компьютерные базы данных можно использовать для идентификации компонентов анализируемых проб при отсутствии необходимых эталонных веществ. Анализируемую пробу разделяют на колонке при условиях, указанных в соответствующей таблице, предварительно введя в нее небольшое количество вещества, служащего стандартом. Международной комиссией по номенклатуре на I симпозиуме по хроматографии в Лондоне в 1956 г. рекомендован ряд веществ, которые следует использовать в качестве стандартов: пентан - для углеводородов, масляная кислота -для жирных кислот, метиловый эфир миристиновой кислоты - для эфиров высших жирных кислот. По полученной хроматограмме рассчитывают относительные удерживаемые объемы:

(1.55)

где V_R , V_o,V_R_с. - удерживаемые объемы соответственно компонентов пробы, несорбирующейся подвижной фазы и стандарта; t_R, t_o, t_R_с_. - время удерживания компонентов пробы, несорбирующейся подвижной фазы и стандарта соответственно; l_R, l_o, l_R_с - соответствующие отрезки на хроматограмме.

Для идентификации выделенных компонентов анализируемой пробы сравнивают полученные значения относительных удерживаемых объемов V_отн. с табличными данными. Так как внутри одного класса соединений графическая зависимость V_отн. от числа атомов n обычно прямолинейная, то построив калибровочный график зависимости lg V_отн. от n и определив V_отн. выделенных веществ можно достаточно полно их идентифицировать. Для построения калибровочного графика нужно знать V_отн. для 3-4 членов данного гомологического ряда.

Если в анализируемой пробе содержатся соединения различных классов, то для их идентификации нужно построить несколько аналогичных калибровочных графиков как для полярной, так и для неполярной неподвижной жидкой фазы. Дальнейшая идентификация осуществляется путем повторного выделения идентифицируемого вещества и исследования его различными физико-химическими методами.

Недостатки этого метода идентификации следующие:

- необходимость при анализе пробы точно соблюдать условия разделения, использованные при получении опубликованных данных;

- наличие дефицитных стандартов для веществ различных гомологических рядов.

Некоторыми преимуществами по сравнению с описанным выше методом при идентификации компонентов анализируемой пробы обладает метод Ковача.

Суть этого метода заключается в использовании линейной зависимости между логарифмами объемов удерживания и числом углеродных атомов нормальных парафинов, выраженным индексами удерживания I.

При проведении качественного хроматографического анализа с использованием метода Ковача в одинаковых условиях измеряют удерживаемые объемы трех веществ - идентифицируемого и двух нормальных алканов, различающихся по числу углеродных атомов на единицу. При этом н-алканы выбирают таким образом, чтобы удерживаемый объем идентифицируемого компонента имел промежуточное значение между соответствующими характеристиками н-алканов. Затем из графика (рис. 1.27) или по интерполяционной формуле

(1.56)

находят индекс удерживания идентифицируемого вещества и по справочным таблицам по величине индекса удерживания определяют, какому веществу принадлежит это значение.

Идентификация по индексам удерживания по сравнению с другими методами идентификации имеет следующие преимущества:

– в качестве стандарта используется не случайное вещество, а гомологический ряд нормальных углеводородов, благодаря чему точность и воспроизводимость определения индексов очень высокие. Кроме того, нормальные углеводороды наиболее доступны в качестве стандартных веществ;

lg V_{R n+}₁

lg V_{R n}

I_nI_xI_n+1

I = 100 n

Рис. 1.27 Графическое определение индекса Ковача идентифицируемого компонента пробы (n – число углеродных атомов в н-алканах)

– значения индексов удерживания намного меньше зависят от температуры колонки, чем относительные удерживаемые объемы, что расширяет диапазон температур колонки, позволяющий проводить идентификацию;

– при наличии литературных данных по индексам удерживания Ковача можно проводить качественный анализ без применения индивидуальных веществ.

Однако результаты идентификации, полученные и методом Ковача, должны быть проверены другими независимыми методами.

I.3. Использование графических или аналитических зависимостей между относительными удерживаемыми объемами и другими физико-химическими свойствами веществ.

Если между логарифмами относительных удерживаемых объемов веществ одного гомологического ряда и другими физико-химическими характеристиками этих веществ, например температурами кипения, молекулярной рефракцией, молярным коэффициентом экстинкции и др., существует линейная зависимость, то для идентификации компонентов анализируемых веществ могут быть использованы соответствующие графические зависимости.

Например, на колонках с неполярным адсорбентом в последовательности, соответствующей их температуре кипения, выделяются вещества, относящиеся даже к разным классам. На колонках с полярной фазой линейность зависимости логарифма удерживаемых объемов от температуры кипения наблюдается для веществ одного гомологического ряда.

Так как относительный удерживаемый объем является функцией температуры хроматографической колонки, анализ следует проводить именно при тех условиях, для которых построен соответствующий график, иначе идентификация может оказаться неверной, потому что при изменении температуры может измениться даже порядок элюирования. Если рабочая температура отличается от требуемой величины, необходимо привести удерживаемый объем к соответствующей температуре при помощи зависимости lg V_отн_. от 1/Т.

Для идентификации хроматографических пиков можно воспользоваться уже опубликованными графиками или построить необходимые кривые на основании результатов разделения калибровочных смесей.

II. Методы идентификации компонентов анализируемых веществ на нескольких колонках

II.1. анализ на параллельных колонках с сорбентами различной полярности

V_R_{неполяр}

V_R_поляр

Рис. 1.28. Графическая зависимость удерживаемых объемов веществ различных гомологических рядов на неподвижных фазах различной полярности

Для однозначной идентификации компонентов сложных смесей разработан метод, основанный на установлении удерживаемых объемов определяемых веществ на двух сорбентах различной полярности. Модификаций этого метода много. Например, чтобы определить принадлежность идентифицируе-мого вещества к тому или иному гомологическому ряду, можно воспользоваться графиком зависимости удерживаемых объемов веществ на колонке с полярной неподвижной фазой от удерживаемых объемов этих веществ на такой же колонке с неполярной фазой. Такой график предварительно строится для веществ различных классов. При одинаковом масштабе удерживаемых объемов на обеих координатных осях для различных гомологических рядов соединений получают ряд прямых, проходящих через начало координат.

Наклон прямых является характеристикой различных гомологических рядов (функциональных групп) (рис.1.28). Идентификация этим методом проводится следующим образом. Сначала устанавливают принадлежность компонента анализируемой смеси к тому или иному гомологическому ряду. Для этого сопоставляют логарифмы или сами удерживаемые объемы идентифицируемого компонента, измеренные на колонках с полярной и неполярной неподвижными фазами. Совпадение характеристик удерживания, которые измеренны по хроматограммам, полученным на обеих колонках, с точкой на той или иной прямой графика указывает на принадлежность компонента гомологическому ряду, соответствующему этой прямой. Положение же точки на этой прямой дает ответ на вопрос, какое это вещество.

Применяется метод идентификации компонентов пробы, в котором использована прямолинейная зависимость между логарифмами объемов удерживания веществ и безразмерным параметром Z, представляющим собой отношение температуры кипения идентифицируемого вещества к температуре хроматографической колонки, при которой проводится разделение., т. е.Сущность метода сводится к тому, что по индивидуальным веществам определенного класса соединений строят калибровочные графики lg V_R от Z на различных неподвижных фазах, отличающихся полярностью. По хроматограммам анализируемого вещества на этих колонках определяют удерживаемые объемы идентифицируемых компонентов. По калибровочным графикам находят фактор Z. Зная температуру колонки Т_кол., определяют температуру кипения вещества. Сопоставив полученное значение температуры кипения со справочными данными по физико-химическим свойствам химических соединений, идентифицируют компонент.

II.2. Анализ на последовательно соединенных колонках с сорбентами различной полярности.

При рассмотрении двух или трех хроматограмм одной смеси, полученных на колонках с сорбентами различной полярности, часто очень трудно или даже невозможно установить, какой пик одной хроматограммы соответствует определенному пику другой. Поэтому иногда смесь разделяют на последовательно соединенных колонках с полярными и неполярными сорбентами, а также на составных колонках, состоящих из секций различной длины с указанными сорбентами. При такой схеме анализа можно точно определить характеристики удерживания каждого компонента на неподвижных фазах различной полярности и идентифицировать соответствующие соединения.

III. Сочетание хроматографии с другими методами исследования.

III.1. Определение функциональных групп

При проведении идентификации по удерживаемым объемам на одном сорбенте часто необходимо знать, к какому классу соединений относится идентифицируемый компонент. Это может быть установлено, если выделенный компонент после выхода из хроматографической колонки анализируется с использованием качественных реакций на соответствующие классы соединений или подходящих физико-химических методов. Примеры таких качественных реакций приведены в табл. 1.5.

По наблюдаемому изменению окраски или выпадению осадка судят о функциональной природе идентифицируемого компонента анализируемой пробы. Для окончательной идентификации определяемого вещества часто используют, например, зависимость lg V_отн_. от количества углеродных атомов для веществ данного гомологического ряда.

Таблица 1.5

Качественные реакции на некоторые классы соединений, используемые при групповой идентификации

Класс соединений	Реактивы	Окраска в случае положительной реакции
Спирты	Дихромат калия + азотная кислота	Синяя окраска
Альдегиды и кетоны	2,4-динитрофенил-гидразин	Желтый осадок
Альдегиды	Флороглюцин	Оранжево-красный осадок
Кетоны	Нитропруссид натрия	Бордово-красный осадок
Амины	Нитропруссид натрия	Синяя окраска
Ароматические углеводороды, олефины	Формальдегид + серная кислота	Темно-красная окраска
Галогенпроизводные	Спиртовой раствор нитрата серебра	Белый осадок

III.2. Методики удаления (вычитания).

Идентификацию соединений определенного класса можно осуществить путем использования реагентов, взаимодействующих с этими соединениями с образованием осадка (например, см. табл. 1.2 ), и хроматографического анализа смеси до и после такой обработки. На первой хроматограмме при использовании оптимальнных условий разделения будут содержаться пики всех компонентов, на второй - только пики непрореагировавших веществ.

III.3. Использование спектральных методов анализа

Для идентификации компонентов смесей применяется довольно часто их анализ спектральными методами. Наиболее целесообразно для этой цели использовать методы, характеризующиеся высокой специфичностью получаемых спектров, такие как ИК-, ЯМР- и масс-спектроскопия. Эти методы могут применятся для идентификации компонентов анализируемых проб как после их выделения на хроматографической колонке, так и, что представляет наибольший интерес, при непосредственном соединении хроматографа с быстродействующим Фурье-ИК-спектрометром или масс-спектрометром. В некоторых случаях используют и более сложные комбинации, например сочетание газовой или жидкостной хроматографии с детектированием выделенных компонентов ЯМР- и ИК-спектрометром.

Из всех спектральных методов, применяемых для идентификации компонентов в хроматографии, наименее чувствительным является метод ЯМР-спектроскопии. Однако этот метод позволяет получать специфическую информацию для установления структуры анализируемых соединений, например их стереоизомерии.

Наиболее высокая чувствительность анализа может быть достигнута при использовании масс-спектрометрического детектирования компонентов анализируемой пробы, разделенных на хроматографической колонке. Такое сочетание хроматографии с масс-спектрометрией уже нашло широкое применение как в научных исследованиях, так и при контроле качества продукции, получив название хромато-масс-спектрометрия.

III.4. Использование повышенной чувствительности детекторов к некоторым классам соединений

При одновременной работе нескольких детекторов и равенстве количеств вещества, попадающего в каждый детектор, на хроматограммах регистрируются пики различной высоты (и площади) в зависимости от природы анализируемого вещества и принципа действия детектора. Например, пламенно-ионизационный детектор даст для ароматических углеводородов более интенсивный пик, чем катарометр. Детектор электронного захвата очень чувствителен к соединениям, содержащим электроноакцепторные атомы галогенов, свинца и др.

Чувствительность различных детекторов к анализируемым веществам является важным показателем при групповой идентификации компонентов сложных смесей неизвестного состава. При этом используемые детекторы могут быть размещены по отношению к колонке по параллельной или последовательной схеме.

Использование последовательной схемы возможно только при условии, что детектор, соединенный непосредственно с колонкой, является недеструктивным (например, катарометр). Качественная идентификация веществ этим методом основана на определении непосредственно из хроматограмм относительного отклика R_D как отношения площадей или высот пиков, зарегистрированных разными детекторами для определяемого компонента, и использовании имеющихся экспериментальных данных по значениям R_D для различных анализируемых объектов и детекторов.

Количественный анализ

Задачами количественной интерпретации хроматограмм в зависимости от целей и задач конкретного применения этого метода могут выступать: 1) количественное определение одного компонента или небольшого числа… 2) определение содержания одного или нескольких компонентов анализируемого многокомпонентного продукта и общего…

Параметр h

· флуктуация температуры колонки изменяет распределение концентраций в газе-носителе, выходящем из колонки (концентрационный профиль), который… · флуктуации скорости потока газа-носителя, очевидно, не скажутся на… · параметр h весьма чувствителен к перегрузке колонки.

Параметр hl

· флуктуации температуры при работе с обоими видами детекторов приводят к изменениям абсолютных и относительных значений параметра hl по тем же… · флуктуации скорости потока газа-носителя влияют на абсолютные и… туации скорости потока газа-носителя влияет на абсолютное значение величины l, поскольку эта величина зависит от…

Параметр А

· флуктуации температуры не искажают площадь пика при работе с детекторами обоих типов; · флуктуации скорости потока газа-носителя при использовании концентрационных… · перегрузка колонки пробой, если она не ухудшает разделения до недопустимых пределов, практически не влияет на…

Величины допустимых погрешностей задания параметров разделения

давление на входе в колонку	0.10 %
давление на выходе из колонки	0.22 %
ввод пробы	0.41 %
температура	0.23 %
ток моста детектора	0.14 %
погрешность измерения площади пика	0.41 %

Эти данные получены с учетом влияния каждого фактора на конечный результат анализа. При этом вклад в погрешность результата всех шести источников частных погрешностей предполагался одинаковым.

Если, например, измерять не площадь пика, а высоту пика, то допустимая погрешность изменения температуры оказывается в 2 раза меньшей.

Большой вклад в погрешность вносит давление на выходе из колонки. Поскольку эта величина определяется изменением атмосферного давления, ее колебания могут быть достаточно велики (до 3 %). Между тем, в практической хроматографии это часто не учитывается. В результате возникают существенные погрешности при использовании для расчетов абсолютных значений параметров. По этой причине детектор ионизации в пламени считается более пригодным для количественных измерений, чем детектор по теплопроводности.

Для получения погрешности менее 1 % при определении времени удерживания требуются не столь жесткие условия по стабильности аппаратуры: давление на входе в колонку можно поддерживать с точностью 0.4 %, температуру с точностью 0.5 К и выполнять измерения величины площади с точностью 0.5 %.

5.2 ИЗМЕРЕНИЕ КОЛИЧЕСТВЕННЫХ ПАРАМЕТРОВ ХОРОШО РАЗДЕЛЕННЫХ ПИКОВ

Количественный газохроматографический анализ основан на зависимости между площадью S (или высотой h) пика и количеством определяемого компонента в пробе. Под площадью пика понимается площадь, ограниченная контуром пика и его основанием — СD отрезком, соединяющем начало и конец пика (рис. 24). Площадь пика измеряется в мм², А⋅с или В⋅с. Высота пика (h) — расстояние от вершины пика до его основания, измеренное в направлении параллельной оси сигналов детектора (рис. 25), h – измеряется в мм: а – нулевая параллельная оси времени, т.е. дрейф отсутствует (рис.25, а); б – измерение высоты при дрейфе нулевой (рис. 25, б).

Площадь и высота пика могут измеряться как вручную, так и автоматически. При ручных способах измерения площади пика используют вспомогательный параметр - ширина пика (рис. 26).

Ширина пика - проекция отрезка прямой, параллельной основанию пика, ограниченного точками пересечения с ветвями пика, на ось времени. Ширина пика может измеряться на разных уровнях (сечениях) высоты пика. Ширина пика измеряется в мм; сек. Наиболее просто вручную измеряются и рассчитываются параметры так называемых гауссовых пиков (рис. 27). Контур этих пиков описывается уравнением: где х, у – координаты точки контура пика; h и S – высота и площадь пика, отвечающая максимальной концентрации компонента в зоне; σ – стандартное отклонение, которое отвечает ширине пика на высоте 0,882 h.

Стандартное отклонение может быть определено также из соотношений, справедливых для гауссовских пиков:

2σ = b_0,607 2,36σ = b_0,500 3σ = b_0,324 4σ = b_0,134

Расчет площади пика как площади, ограниченной гауссовой кривой (для симметричных пиков), проводят по формуле, полученной интегрированием гауссовой функции распределения ошибок:

(62)

где S – площадь пика; h – его высота; σ – стандартное отклонение, равное ширине пика на высоте b_0,882.

Точность измерения площади пика этим методом определяется точностью измерения отрезков на хроматограмме (h и b_0,882), а, поскольку, высота пика обычно много больше ширины пика, то точность измерения площади пика в значительной степени определяется точностью измерения ширины пика. Поэтому при измерении ширины узких пиков (меньше 10 мм) желательно пользоваться измерительной
лупой и учитывать толщину линии.

Обработка хроматограмм с асимметрическими пиками, как правило, проводится с меньшей точностью. Асимметричность пика анализируемого соединения может быть вызвана двумя причинами:

1. Перегрузкой колонки анализируемым веществом.

2. Наличием остаточной адсорбционной активности твердого носителя, используемого для приготовления сорбента.

Форма пиков при этом различна. Перегрузка колонки приводит к образованию размытого фронта (рис. 28, а). Остаточная адсорбционная активность приводит к образованию хвоста (рис. 28, б).

Устранение асимметричности первого рода достигается при уменьшении дозы. В то время как устранение асимметричности второго рода более трудная задача. Для численного выражения асимметричности предложено использовать коэффициент асимметричности (рис. 29):

K_as=S_A/S_B=c/d=a/b (63)

где SA и SB – площади между осевой линией пика и задним его фронтом, и передним его фронтом соответственно; а и b – расстояния между осевой линией пика и задним его фронтом и передним его фронтом на полувысоте соответственно; c и d – то же самое на 0,1 высоты пика.

Для симметричного пика К_аs = 1. В случае остаточной адсорбции К_аs > 1, при «перегрузочных» пиках К_аs < 1. Считается допустимым работать на колонке, имеющей К_as для всех компонентов анализируемой смеси в пределах 0,7 – 1,5. Искажение формы пика при адсорбции («хвостование») зависит и от природы анализируемых соединений. Менее всего адсорбируются насыщенные углеводороды, наиболее сильно - высокополярные соединения. Аналитическая колонка может оказаться пригодной для анализа соединений одного класса и совершенно не пригодной для соединений другого класса. Ее следует охарактеризовать и по этому признаку.

Методы триангуляции

а). В первом методе триангуляции за площадь пика принимается площадь описанного треугольника, образованного касательными, проведенными к сторонам… Площадь описанного треугольника рассчитывается обычно по формуле: S = ½ ⋅ h' ⋅ b0 (65)