Виділення факультативно анаеробних мікроорганізмів

Бактерії родини Enterobacteriaceae виділяли, використовуючи МакКонкі агар. Солі жовчних кислот і кристалвіолет, що входять до складу даного середовища, пригнічують ріст грампозитивної мікрофлори. Лактоза та індикатор рН нейтральний червоний служать для виявлення розщеплення лактози. Колонії лактозонегативних представників – безбарвні, лактозопозитивних – червоні, оточені мутною зоною преципітації жовчних солей внаслідок зниження рН.

З метою виявлення бактерій родів Salmonella та Shigella досліджуваний вихідний матеріал висівали на Salmonella Shigella агар (SS). Це середовище також використовували для виділення бактерій роду Proteus, оскільки на ньому бактерії цього роду не дають “роїння” і утворюють так, як і Salmonella та Shigella, чорні колонії у присутності цитрату заліза і тіосульфату натрію, які містяться у середовищі.

Також проводили пересів штамів на середовище для виділення бактерій родини Enterobacteriaceae по Онозу. Ріст грампозитивних бактерій на даному середовищі повністю пригнічується. Колонії можуть бути диференційовані за різними відтінками кольору в присутності індикаторів нейтрального червоного і анілінового голубого (водного голубого). Колонії бактерій роду Proteus диференціюються завдяки тому, що вони дезамінують фенілаланін, який з іонами заліза утворює комплекс темно-коричневого кольору (табл. 2.1).

Для диференціації бактерій родини Enterobacteriaceae від інших родин грамнегативних бактерій проводили основні тести на цитохромоксидазу, відновлення нітратів у нітрити, тест на каталазну активність. Для початкової диференціації ізолятів проводили їх пересів на трицукровий агар із залізом, після цього визначали які тести необхідно застосувати для проведення ідентифікації родів [29, 37]. Подальшу диференціацію проводили за допомогою тест систем API 20E, Франція та СІБ, Росія.

Таблиця 2.1

Зовнішній вигляд колоній деяких мікроорганізмів

при рості на середовищі по Онозу та його забарвлення

Бактерії роду Staphylococcus виділяли на агарі Байрд-Паркера. Це середовище містить хлористий літій і телурит для пригнічення росту супутньої мікрофлори, у той час як піруват і гліцин селективно стимулюють ріст стафілококів. Колонії стафілококів проявляють дві характерні особливості на цьому непрозорому середовищі (через наявність жовчно-телуритної емульсії):

· характерні зони і кільця, що утворюються в результаті ліполізу і протеолізу;

· відновлення телуриту до телуру, супроводжується почорнінням середовища.

Реакція з яєчним жовтком і відновлення телуриту до телуру зазвичай протікають одночасно із дією коагулази, тому може слугувати її показником.

Бактерії роду Staphylococcus є факультативними анаеробами, тому здатні рости і зброджувати глюкозу в анаеробних умовах. У окремих випадках проводили тести на фосфатазу, перетворення маніту в анаеробних умовах, визначали стійкість до новобіоцину, а також плазмокоагулазу. Утворення коагулази золотистим стафілококом і синтез ентеротоксину дуже тісно пов’язані. Вид S. aureus утворює два види коагулази. Вільна коагулаза являється позаклітинним ферментом, що вступає в реакцію з протромбіном і його похідними. Зв’язана коагулаза, відома як фактор згортання, локалізується на поверхні клітинної стінки і взаємодіє з α- і β-ланцюгами фібриногенів з утворенням коагуляту. Ідентифікували виділені мікроорганізми за допомогою тест-систем API Staph, Франція.

Бактерії роду Lactobacillus виділяли на середовищі МРС. З метою уникнення росту дріжджеподібних грибів роду Candida у середовище додавали сорбінову кислоту. Підтвердженням приналежності бактерій до роду Lactobacillus є морфологія клітин, відсутність спор, каталази та оксидази [29, 38].

Бактерії роду Enterococcus виділяли на хромогенному середовищі для визначення ентерококів, наприклад, Chromocalt^® агар. Ріст даних мікрооорганізмів стимулюється пептонами, фосфатами і додаванням твіну-80. Бактерії розщеплюють специфічний хромогенний субстрат (трифенілтетразоліум хлорид) у поживному середовищі, внаслідок чого їх колонії зафарбовуються в червоний колір. Азид натрію і бичача жовч пригнічує супутню мікрофлору. Підтвердження приналежності виділених мікроорганізмів до роду Enterococcus проводили шляхом пересіву матеріалу із колоній на жовчно-ескуліновий агар. До складу агару входять солі жовчі, до яких стійкі ентерококи. Крім того, до середовища входять ескулін і цитрат заліза. Ентерококи здатні гідролізувати ескулін з утворенням ескулетину і глюкози. Ескулетин, зв’язуючись з цитратом заліза, утворює комплекс чорного кольору, який надає характерне чорне забарвлення досліджуваним колоніям і середовищу навколо них. Крім бактерій роду Enterococcus, у серологічну групу D входять й інші бактерії роду Streptococcus. Від бактерій роду Enterococcus вони відрізняються нездатністю рости в рідких середовищах з концентрацією NaCl 6,5%, у присутності 10% і 40% розчину жовчі, та не відновлюють метиленовий синій в молоці [9, 38].

Ізоляцію виду P. aeruginosa проводили на цетримідному агарі, на якому даний вид утворює пігмент піоціанін. Виділені штами бактерій перевіряли на наявність цитохромоксидази, каталази, та відсутність індолу, реакцію з метиловим червоним [29, 37].

Стан мікробоценозу порожнини товстої кишки та мукозної мікрофлори тонкої та товстої кишок оцінювали за індексом сталості (С%) та показниками частоти виявлення (Р_і) кожного виду. Після посіву розведень досліджуваного матеріалу на селективні поживні середовища та інкубації у відповідних умовах, підраховували кількість колоній, а результат виражали числом колонієутворюючих одиниць (КУО/г) за формулою:

X = M×N, де

X – число КУО/г,

М – кількість колоній що виросли,

N – розведення (в 10, 100 разів тощо).

Враховуючи, що число мікроорганізмів на одиницю маси може сягати мільйонів, для зручності використовували десятковий логарифм цього показника – lg КУО/г.

З метою оцінки частоти виявлення родів різних мікроорганізмів у досліджуваному матеріалі використовували показник Р_і:

Р_і = А/В, де

А – число штамів даного виду,

В – загальна кількість штамів.

Про ступінь домінування того чи іншого збудника в угрупуванні свідчить частота його виявлення. Для цього використовували індекс сталості (С%):

С% = р/Р×100, де

С% - індекс сталості,

р – кількість зразків, які містять досліджуваний штам бактерій;

Р – загальна кількість зразків, які містять всі виділені штами бактерій.