Содержание глутаминовой кислоты в камерной влаге

Содержание глутаминовой кислоты в камернойвлаге у больных первичной открытоугольной глаукомойGlutamic acid concentration in aqueous humor ofopen angle glaucoma patients By many authors glutamate renders neurotoxiceffect on retinal ganglion cells.It is possible that glutamic acidconcentration increase in eye tissues with primary open angle glaucoma POAG plays an important role in optic nerve glaucoma atrophy pathogenesis. Aqueous humor of 10 patients with POAG were takenduring cataract extraction and examined.

The quantities of glutamic acid weredetermined by chromatographic method. Glutamic acid concentration in aqueous humor ofcontrol group was 28.6 1.6 mkg ml and in group with POAG 84.9 28.7 mkg ml.The difference wasn t statistically reliable.Thus there is a tendency toglutamic acid concentration increase in eyes with POAG. Результаты исследований последних лет существенно повлияли напредставления о патогенезе глаукоматозной атрофии зрительного нерва глаукоматозной оптической нейропатии.

Было установлено, что характерным проявлениемглаукоматозной оптической нейропатии является апоптоз гибель ганглиозныхклеток сетчатки.Quigley 6 считает, что поврежденный, возможно, вследствиевысокого ВГД, аксон ганглиозной клетки сетчатки не несет достаточнойинформации, что приводит к активации механизмов естественной гибели клетки.Возможно, эти процессы активизируются недостаточностью кровотока в сосудах глазапри повышенном ВГД. Было показано, что одновременно с этим имеется значительноеувеличение содержания глутаминовой кислоты глутамата в стекловидном телебольных первичной открытоугольной глаукомой ПОУГ . Глутамат является основнымнейромедиатором ЦНС и сетчатки.

В то же время повышение концентрации глутаматавыше физиологического уровня вызывает в сетчатке блокаду межнейрональнойпередачи нервных импульсов и сочетается с селективным апоптозом ганглиозныхклеток сетчатки из за нейротоксического действия глутамата 5 . Brooks D.E. etal. 7 обнаружили в собачьих глазах с экспериментально вызванной глаукомойповышенное содержание витреального глутамата, триптофана и низкое содержаниеглицина по сравнению с контролем.

По мнению авторов, высокая концентрацияглутамата токсична для ганглиев сетчатки и доказывает ишемический механизмнарушений, происходящих в клетках сетчатки. Сама по себе идея о нейротоксическом действииглутамата на нервную ткань, в частности, на ганглиозные клетки сетчатки,заимствована из неврологической практики.Неврологи около 20 лет придаютзначение большим концентрациям данного трансмиттера в развитии такой патологии,как болезнь Альцгеймера, рассеянный склероз, деменция, амиотрофический боковойсклероз и другие 4 . Повышенное содержание глутамата в стекловидном телебольных глаукомой, гибель ганглиозных клеток сетчатки под его воздействием вопытах на крысах позволили E.B. Dreyer и соавт. 6 предположить, что данныймеханизм их гибели имеет место и при ПОУГ. Однако причина внутриклеточноговыпуска глутамата не полностью ясна. E.B. Dreyer и соавт. 6 считают, что,возможно, высокое внутриглазное давление приводит к выходу глутамата вовнутриклеточные пространства, вызывая гибель клеток, который токсичен дляганглиозных клеток.

Второй вероятной причиной гибели клеток, по мнению авторов,является сбой в ферментных системах, ответственных за разрушение данногонейромедиатора после выхода его из синапсов.

Трудность подтверждения этихвоззрений заключается в том, что очень трудно проверить данные факты на живом глазу, однако несомненно, что большие концентрации гутамата токсичны длянервной ткани. Учитывая вышесказанное, целью нашего исследованияявилось обнаружение глутамата у больных ПОУГ. Материалы и методы исследования Опытную группу составили 10 больных ПОУГ 6мужчин, 4 женщины, средний возраст 74 года , у которых забиралась камернаявлага во время экстракапсулярной экстракции катаракты с антиглаукоматознымкомпонентом. 8 больных были с развитой стадией ПОУГ, 2 с далекозашедшей.

Контрольную группу составили больные со старческой катарактой 14 пациентов 11 мужчин, 3 женщины, средний возраст 68 лет . Основная и контрольная группыбыли сопоставимы по возрасту и сопутствующим соматическим заболеваниям.

В основу метода положены описанные Боде и Гириметоды количественного определения аминокислот в виде медных производных снингидридином после хроматографического их разделения на бумаге в нашеймодификации 1 . 1. Подготовка пробы для анализа. Пробы камерной жидкости объемом 0,1 0,2 мл взвешивают нааналитических весах, упаривают досуха на водяной бане при 40 С в стеклянныхмикрочашках, используя плавающий штатив.

Сухой остаток растворяют в 0,05 млдистиллированной воды. 2. Получение одномерных хроматограммкамерной жидкости глаза. 20 мклполученных растворов порциями по 5 мкл с помощью автоматической пипетки наносятна хроматографическую бумагу марки быстрая размером 2 x 27 см.Хроматографирование проводят нисходящим методом два раза в одном направлениисначала в смеси растворителей I, затем два раза в смеси II. Смесь I н бутиловый спирт, ледяная уксусная кислота, дистиллированная вода 4 1 5 .Смесь II н бутиловый спирт, ледяная уксусная кислота, дистиллированная вода 40 15 5 . После каждого пропускания растворителя бумагу высушивают навоздухе и снова помещают в хроматографическую камеру.

Время прохождениярастворителя в одном направлении 7 часов.Высушенную хроматограмму погружают нанесколько секунд в 0,5 раствор нингидрина в ацетоне, просушивают в течениенескольких минут на воздухе и подогревают 10 минут в сушильном шкафу при 50 Сдля развития окраски.

Пятна аминокислот становятся более четкими через сутки,поэтому определение количественного содержания аминокислот следует проводить наследующий день. 3. Количественное определение глутаминовойкислоты в камерной жидкости глаза.Фиолетовые пятна, соответствующие глутаминовой кислоте, вырезают, разрезают намелкие кусочки и помещают в микропробирки, содержащие 0,25 мл спиртовогораствора сульфата меди. Фиолетовая окраска переходит в оранжево красную врезультате образования медного производного аминокислот с нингидрином.Экстракцию продолжают в течение одного часа при комнатной температуре.

Интенсивность окраски измеряют на фотоэлектроколориметре Humalyzer 2000 при длиневолны 505 нм в микрокюветах против контрольной пробы на бумагу.Расчеты посодержанию аминокислоты проводят по калибровочному графику, полученному состандартными растворами глутаминовой кислоты. 4. Построение калибровочного графика.

Готовят растворы глутаминовой кислоты 0,001 М, 0,00075 М,0,0005 М, 0,000375 М, 0,00025 М. На бумагу наносят по 20 мкл растворов.Расчетпроизводят по формуле А С x 5x 10 2 V А концентрация глутаминовой кислоты в камернойвлаге мкг мл C содержание глутаминовой кислоты, найденной покалибровочному графику мкг мл V объем проб мл . Результаты исследования и обсуждение Содержание глутамата камерной влаги в контрольнойгруппе составило 28,6 1,6 мкг мл, при ПОУГ 84,9 28,7 мкг мл разницастатистически недостоверна, p gt 0,05 . Хотя нами и не получено статистически достоверныхразличий в содержании глутамата у больных ПОУГ и возрастной катарактой, однакоимеется явная тенденция к более высокой концентрации данного нейромедиатора вкамерной влаге больных ПОУГ. У 5 из 10 больных ПОУГ содержание глутамата вкамерной влаге было значительно выше, чем в контрольной группе и колебалось впределах от 37,6 мкг мл до 260,3 мкг мл. У больных старческой катарактой наивысшаяконцентрация глутаминовой кислоты составила всего 33 мкг мл. Участие некоторых нейромедиаторов в регуляцииофтальмотонуса показано в работах А.В. Мягкова 2,3 , который доказал влияниеопиоидных пептидов на повышение ВГД, воздействуя электрическими колебаниями ихимическими раздражителями на миндалевидный комплекс.

В результате полученныхданных нельзя не согласиться с гипотезой усиления апоптоза ганглиозных клетоксетчатки при ПОУГ вследствие накопления в них глутаминовой кислоты.

Однакоданная гипотеза требует дальнейшего изучения.

Проведенные исследования впервые позволилиобнаружить глутаминовую кислоту в камерной влаге у больных ПОУГ. Содержаниеглутамата у больных ПОУГ выше, чем в контрольной группе. Литература 1. Медицинские лабораторные технологии идиагностика Медицинские лабораторные технологии. Справочник в 2 томах Подред.А.М. Карпищенко Микрометод определения свободных аминокислот в сывороткекрови при помощи хроматографии на бумаге.

Т.2. С Петербург, Интермедика ,1999. С. 106 109 2. Мягков А. В. Влияние пунктурных воздействий наофтальмогипертензию, вызванную электрической и химической стимуляциейминдалевидного комплекса Авореф. дисс. на соиск. учен. степ. канд. мед. наук. Казань, 1997 21 с. 3. Мягков А.В. Участие опиоидных пептидов вцентральной регуляции внутриглазного давления и гидродинамики глаза Тез.Докладов 7съезда офтальмологов России.М 2000. С.175 176. 4. Пляхин И.В. Биохимические основы пролонгируемойклеточной смерти.

Межрегиональный сборник научн. Трудов Биохимия на рубежеXXI века. 2000. Рязань. С.173 177.