Популяційна структура вірусів

Центральним об'єктом генетичного дослідження вірусів є вірусна популяція. Це вірус певного виду, який розмножується в природній або експериментальній чутливій системі і проходить в ній значну кількість генерацій, протягом яких між окремими віріонами відбуваються генетичні і негенетичні взаємодії. Вірусні популяції є важливою ланкою в структурі виду і виконують роль основних одиниць еволюції. В природних умовах вони утворюються в організмі заражених господарів. Властивостями популяції, хоч і в меншій мірі, володіє вірус, який розмножується в культурі клітин. Це створює можливість експериментального дослідження внутрішньо популяційних явищ.

Популяційна структура вірусів і специфіка генетичних процесів, що відбуваються у вірусних популяціях, визначаються рядом факторів.

З них найважливішими є такі:

1) висока чисельність вірусних популяцій: В організмі господаря нагромаджуються колосальні за чисельністю вірусні популяції. Потомство одного віріону за індивідуальний цикл розвитку нараховує в середньому 10², а через три генерації - 10⁶ вірусних часток. Вже чисто кількісний бік явища підвищує ймовірність появи в популяції рідкої мутації, яка може бути підхоплена відбором при зміні умов існування.

2) швидка зміна поколінь: Величезна різниця в тривалості життєвого циклу вірусів та їх хребетних господарів дозволяє вивчати мінливість вірусів у лабораторії і спостерігати еволюцію в природі. Можливі наслідки мінливості вірусів у природних умовах - поява нових штамів збудника і виникнення епідемії та епізоотій, а в експерименті - селекція варіантів із заданими властивостями.

3) гаплоїдність і нестатевий спосіб розмноження: а) визначають генетичну структуру вірусних популяцій; б) виключають можливість збереження запасів мінливості за рахунок диплоїдності; в) ставлять мутації, котрі виникають, під негайний контроль відбору, що визначає їх наступну долю; г) знижують ефективність впливу відбору на нейтральні мутації; д) визначають спосіб генетичної перебудови вірусної популяції, що полягає в заміні одних клонів іншими.

4) мала ємність генома і відсутність генів, які повторюються: Для здійснення інфекційного циклу вірусів необхідна функціональна цілісність усіх генів. Незначна зміна функції будь - якого унікального гена, яка настає в результаті мутації, може дати летальний або умовно - летальний ефект. Ця обставина поряд з високою вірогідністю мутації генетичного матеріалу впливає на розмір генетичних змін, які можливі у вірусних популяціях.

5) безперервність у часі епідемічного та епізоотичного процесів: Обов'язковою умовою збереження вірусів як біологічних видів є їх передача новим чутливим господарям. Тому генетична історія вірусної популяції, що утворилася і закінчила своє існування в організмі певного індивідуума, продовжується при переході до нового господаря і при наступній передачі збудника по ланках епідемічного або епізоотичного ланцюга. Сама можливість передачі вірусу, а також її кількісна та якісна характеристика визначається чисто випадковими причинами. Випадковість слугує передумовою дії в стадії передачі збудника могутнього еволюційного фактора - генетичного дрейфу. При передачі вірусу посилюється також діяльність відбору. Таким чином, еволюційні сили впливають на віруси не тільки під час їх репродукції в клітинах сприйнятливого організму, але й при переході від одного господаря до іншого.

Вірусні популяції характеризуються високою генетичною неоднорідністю. Треба розрізняти такі поняття, як штам, тип (серотип), варіант, мутант, клон. Всі ці терміни в загальному означають вірус, який генотипічно відрізняється від батьківського дикого ( природного ізоляту), який представляє природну вірусну популяцію.

Штам - це вірус, виділений з природної вірусної популяції від заражених господарів або об'єктів навколишнього середовища. Фактично штами називають різні дикі типи одного вірусу, які адаптовані до лабораторних умов. Наприклад, штам Fixe вірусу сказу.

Тип (серотип) визначають за нейтралізацією інфекційної активності. Наприклад, вірус інфекційної катаральної гарячки овець має 24 серотипи, а вірус африканської чуми коней - 10 серотипів.

Варіант - це вірус, який фенотипічно відрізняється від дикого типу, але разом з тим генотипічна основа цієї відмінності невідома.

Мутант - відрізняється від дикого типу за відомими генетичними ознаками.

Клон - це вірус, популяція якого походить від одного віріону і представляє собою сукупність генетично однорідних вірусних часток.

Природні вірусні популяції можуть добре адаптуватися до зовнішніх умов і при постійності середовища залишатися стабільними протягом тривалого часу. Проте при зміні факторів довкілля передумовою існування популяції є не збереження її в незмінному вигляді, а перебудова спадкової структури, що забезпечує пристосування до нового середовища. Ця перебудова може здійснюватися тільки при наявності в популяції запасу генетичної мінливості генотипічно різних варіантів.

Генетичний склад вірусної популяції називається генофондом. Іншими словами, генофонд вірусної популяції - це сукупність всіх генів, які є у вірусів, що складає дану популяцію. Генофонд, так само як і вірусний геном, пристосований для виконання певних життєвих функцій. Спадкова інформація, що міститься в геномі, забезпечує відтворення вірусу, а генотипічна різноманітність, представлена в генофонді, дозволяє вірусам пристосовуватися і виживати в мінливих умовах навколишнього середовища.

Структурна організація генома клітини. У складі генома є структурні гени, що кодують визначені біополімери (білки чи РНК), і регуляторні гени, що контролюють функцію структурних генів. Регуляція відбувається за допомогою білкових продуктів регуляторних генів — репресорів, що придушують активність структурних генів. Регуляторними ділянками генів, що контролюють транскрипцію, є підсилювач транскрипції (enhancer) і промотор — область ДНК, яка знаходиться безпосередньо перед структурними генами з боку З’- кінця ланцюга.

Характерною рисою генів еукаріотичної клітини є їх мозаїчна структура, тобто переривчастість гена. У складі гена кодуючий один білок, що кодують ділянки перериваються вставними послідовностями, що не несуть ніякої інформації, що кодує, і не транслюються. Ділянки гена, що кодують, називаються екзонами, а вставки - інтронами.

При транскрипції зчитується весь ген, включаючи екзони і інтрони. Згодом відбувається дозрівання (процессинг) іРНК: з утвореного довгого первинного транскрипту віддаляються ділянки, що відповідають інтронам, а ділянки, що відповідають екзонам, «зшиваються». У результаті подібної модифікації з первинного транскрипту утвориться зріла іРНК. Цей процес вирізання інтронів і зшивання екзонів називається сплайсингом(від англ. слова splice — з’єднувати, зрощувати кінці каната).

У вірусів роль хромосом виконує нитка нуклеїнової кислоти (ДНК чи РНК), в одних вона цільна, в інших (рео- аренавіруси, віруси грипу) — фрагментована. Окремі ділянки нуклеїнової кислоти, відповідальні (детермінуючі) за синтез визначеного поліпептиду, одержали назву генів.

Фенотип — це сукупність усіх зовнішніх і внутрішніх ознак і функції даного вірусу. Фенотипічні властивості вірусу можуть бути встановлені морфологічними і серологічними методами. Генотип же визначається тільки структурою спадкоємного матеріалу - ДНК чи РНК, тобто послідовністю нуклеотидів у їх молекулах. Фенотип вірусу не є його постійною властивістю, вона може змінюватися як у результаті його мутацій, так і під впливом зовнішніх умов репродукції. Генотип же — це постійна властивість вірусу, і міняється він у результаті мутацій, які відбуваються в геномі. Мутаційні зміни в геномі вірусу можуть виражатися в зміні його фенотипу.

Структурна організація генома вірусу. Віруси є одним з улюблених об'єктів молекулярної генетики завдяки простій будові і малій молекулярній масі їх геномів. Організація генетичного апарата в ряду вірусів, наприклад у SV40, настільки подібна з генами еукаріотичної клітини, що одержала назву мініхромосоми. Число генів у вірусів значно варіює: найпростіші з відомих вірусів містять від 3 до 5 генів (вірус поліоми); у пікорнавірусів 6—8 генів. Однак у більш складних вірусів число генів буде значно більшим.

Геном вірусів тварин є гаплоїдним, за винятком ретровірусів, які мають диплоїдній геном, представлений двома ідентичними молекулами РНК. У вірусів із фрагментарним геномом (віруси грипу, реовіруси) кожен фрагмент звичайно являє собою один ген.

Так само, як і геном еукаріотичної клітини, ДНК-геном ряду вірусів тварин має мозаїчну структуру, при якій значимі послідовності (екзони) чергуються з неінформативними послідовностями (інтронами). Механізм сплайсингу при формуванні іРНК широко розповсюджений і серед ДНК-вмістимих так РНК-вмістимих вірусів. У складі генів ДНК-вмістимих вірусів є регуляторні ділянки, у тому числі промотор, що контролюють функцію структурних генів. Сильними промоторами є кінці багатьох вірусних ДНК, що представляють собою довгі кінцеві повтори. Сильний промотор має гени тимидінкінази, вірусів віспи і герпесу. Ці промотори використовуються в генній інженерії для посилення транскрипції досліджуваного гена.

СПАДКОВІСТЬ ТА МІНЛИВІСТЬУ ВІРУСІВ

Спадковість - це властивість організмів забезпечувати матеріальну і функціональну наступність між поколіннями, а також обумовлювати специфічний характер індивідуального розвитку. Мінливість — властивість, протилежна спадковості. Мінливість вірусів може бути обумовлена мутацією генів, сполученням їх при рекомбінації і різному прояві ознак, що залежать від зовнішніх умов (модифікаційна мінливість).

МУТАЦІЯ У ВІРУСІВ

Віруси змінюють свої властивості як у природних умовах розмноження, так і в експерименті. В основі спадкоємної зміни властивостей вірусів можуть лежати два процеси: 1) мутація, тобто зміна послідовності нуклеотидів у визначеній ділянці генома вірусу, що веде до фенотипічної вираженої зміни окремої властивості, і 2) рекомбінація, тобто обмін генетичним матеріалом між двома близькими вірусами, але вірусами що відрізняються між собою по спадкоємних властивостях.

Мутація — мінливість, зв'язана зі зміною самих генів. Вона може мати переривчастий, стрибкоподібний характер і призводить до стійких змін спадкоємних властивостей вірусів. Усі мутації вірусів поділяються на дві групи: спонтанні й індуковані; по протяжності їх поділяють на крапкові й абераційні (зміни, що торкаються значної ділянки генома). Крапкові мутації обумовлені заміною одного нуклеотиду (для РНК-вмістимих вірусів) чи однієї пари комплементарних нуклеотидів (для ДНК-вмістимих вірусів). Такі мутації можуть іноді піддаватися реверсії з відновленням вихідної структури генома. Однак мутаційні зміни здатні захоплювати і більш великі ділянки молекул нуклеїнових кислот, тобто декілька нуклеотидів. У цьому випадку теж можуть відбуватися випадання, вставки і переміщення (транслокації) цілих ділянок і навіть повороти ділянок на 180⁰ (інверсії), зсув рамки зчитування - більш великі перебудови в структурі нуклеїнових кислот, а отже, і порушення генетичної інформації.

Слід зазначити, що не завжди крапкові мутації реалізуються, тобто приводять до зміни фенотипу. Мається ряд причин, у силу яких такі мутації можуть не виявлятися. Одна з них — виродження генетичного коду.

Природа користається своєрідною мовою синонімів і, заміняючи один кодон іншим, вкладає в них те саме поняття (амінокислоту), зберігаючи, таким чином, у синтезованому білку його природну структуру і функцію.

Мутації можуть мати різні наслідки. В одних випадках вони ведуть до зміни фенотипічних проявів у нормальних умовах. В інших випадках мутація є летальною, тому що внаслідок її порушується синтез чи функція життєво важливого вірусоспецифічного білка, наприклад вірусної полімерази. У деяких випадках мутації є умовно летальними, тому що вірусоспецифічний білок зберігає свої функції у визначених, оптимальних для нього умовах і втрачає цю здатність у непермісивних умовах. Типовим прикладом таких мутацій є температурно-чуттєві (temperature-sensitive) — ts-мутації, при яких вірус утрачає здатність розмножуватися при підвищених температурах (39—42 °С), зберігаючи цю здатність при звичайних температурах вирощування (36—37 °С).

Морфологічні чи структурні мутації можуть стосуватися розміру віріону, первинної структури вірусних білків, зміни генів, які детермінують ранні і пізні вірусоспецифічні ферменти, що забезпечують репродукцію вірусу.

По своєму механізму мутації можуть бути теж різними. В одних випадках відбувається делеція, тобто випадання одного чи декількох нуклеотидів, в інших — відбувається вбудовування одного чи декількох нуклеотидів, а в деяких випадках — заміна одного нуклеотиду іншим.

Мутації можуть бути прямими і зворотними. Прямі мутації змінюють фенотип, а зворотні (реверсії) — його відновлюють. Реверсія не є рідкою подією, тому що ревертанти здебільшого більш пристосовані до даної клітинної системи. Тому при одержанні мутантів із заданими властивостями, наприклад вакцинних штамів, приходиться вважатися з можливою їхньою реверсією до дикого типу.

Спонтанні мутації. У живій природі мутації виникають надзвичайно рідко і спонтанно, тобто під впливом причин, важко встановлюваних у кожнім окремому випадку. Спонтанні мутації у вірусів виникають у популяції без втручання з боку експериментатора. Не може бути абсолютно однорідних популяцій. Однорідність відносна, тому у вірусній популяції в процесі її розвитку спонтанні мутанти виникають з визначеною імовірністю.

Частота мутацій того самого ознаки може бути різної в залежності від штаму. Частота прямих мутацій у вірусів коливається в широких межах. Мутанти, що виникають у популяції, не залишаються генетично чистими лініями, а іноді можуть швидко розмножуватися і практично цілком витиснути інші складові популяції. Частота мутацій у вірусів залежить і від клітинної системи, у якій відбувається розвиток вірусної популяції. Одночасно клітинна система може бути і фактором селекції (добору варіантів).

Спонтанні мутації можуть виникати внаслідок таутомерного перетворення основ, що входять до складу ДНК. Так, наприклад, таутомерні зрушення в положенні атома водню в аденіну призводить до того, що аденін при реплікації спаровується не з тиміном, а з гуаніном. Така помилка при спарюванні основ приводить при наступних реплікаціях до заміни пари AT і ГЦ.

Спонтанні мутації, що виникли в тому самому гені, розподіляються по його довжині нерівномірно. Одні ділянки гена піддаються мутації часто, і їх називають «гарячими» крапками, інші— рідко. Тому імовірність помилок при спарюванні основ у різних ділянках гена різна. Це може бути зв'язане з визначеною конформацією нуклеїнової кислоти, і окремі нуклеотиди можуть з більшим ступенем імовірності піддаватися таутомерному перетворенню, чим інші. Крім того, спонтанні мутації при реплікації можуть бути обумовлені помилками в роботі ферментів – ДНК- чи РНК-полімераз.

У вірусів мутантні популяції можуть виникати й у результаті адаптації їх до незвичайних біологічних систем in vitro (культури клітин) і in vivo (тварини, курячі ембріони).

Мутації при пасажах на тварин. Прикладів одержання стабільних високоімуногенних штамів вірусів методом тривалої адаптації до лабораторних, природно сприйнятливих чи несприйнятливих тварин багато. Так, Л.Пастером був отриманий вакцинний штам (virus fixe) сказу. Шляхом серійних пасажів цього вірусу (штаму Флюрі) через мозок одноденних курчат і далі в курячих ембріонах (при зараженні їх у жовточний мішок) удалося одержати штам, апатогенний для кроликів, мишей і собак (варіанти Нер і Lep). Тривале пасажування вірусу чуми великої рогатої худоби через організм кіз привело до ослаблення його вірулентності для сприйнятливих тварин. Так був отриманий у 1948 р. аттенуйований варіант вірусу, що знайшов застосування для вакцинації великої рогатої худоби (штам Едвардс). Аналогічним чином Накамура і Міямато адаптували до кролика вірус чуми великої рогатої худоби (штам L), який і нині застосовують у якості високоефективної живої вакцини. Тривалими внутрішньовенними пасажами на кроликах удалося одержати кілька вакцинних штамів вірусу чуми свиней.

Віруси грипу найбільш мінливі як в експериментальних, так і в природних умовах. У результаті серійного пасажування їх на мишах (при інтраназальному зараженні) вірус здобуває високу патогенність для цих тварин і разом з тим утрачає патогенність для людини. В адаптованих до мишей штамів змінюється не тільки вірулентність, але і ряд інших властивостей: чутливість до інгібіторів, терморезистентність, імуногенні й інші властивості, що свідчить про глибокі зміни спадковості вірусу. Пасажами на мишах і морських свинках удалося перетворити вісцеротропну природу вірусу чуми коней у нейротропну й одержати нешкідливі для коней вакцинні штампи. При тривалому пасажуванні вірусу ящуру в організмі новонароджених кроленят чи мишенят він згодом аттенуювався у відношенні великої рогатої худоби, не змінюючи при цьому типовій приналежності.

При адаптації вірусів до природно сприйнятливих видів тварин чи до гетерогенних тканин експериментально-сприйнятливих тварин вирішальне значення в успіху роботи мають вид і вік тварини, спосіб уведення вірусу і його властивості.

Змінилося представлення і про спектр патогенності багатьох вірусів при експериментальному зараженні, і зокрема вірусу ящуру, що, як з'ясувалося, можна безупинно пасажувати на новонароджених мишенятах, кроленятах і кошенятах, хоча дорослі тварини цих видів до даного вірусу несприйнятливі.

Для успіху адаптації вірусів до організму лабораторних тварин істотне значення має ослаблення резистентності їхніх хазяїнів шляхом впливу кортизоном, температурою, γ-опроміненням і т.п.

Мутації при пасажах на курячих ембріонах. Спадкоємна мінливість вірусів спостерігалася і при пасажуванні їх на курячих ембріонах. Так були отримані вакцинні штами для профілактики інфекційного бронхіту, інфекційного ларинготрахеїту птахів, чуми собак, катаральної лихоманки овець, чуми великої рогатої худоби, ньюкаслської хвороби й ін.

Мутації при пасажах у культурах клітин. У культурах клітин і тканин успішно вирощуються й піддаються аттенуації багато вірусів. Так, після тривалого пасажування в культурі тканини курячих ембріонів, вірус жовтої лихоманки втратив нейротропні і вісцеротропні властивості, зберігши імуногенність. Отриманий у такий спосіб штам 17Д і дотепер успішно використовують як живу вакцину. Удалося одержати ряд аттенуйованих штамів вірусу поліомієліту (трьох типів) шляхом пасажування в культурі клітин нирки мавп. Вакцина, виготовлена з цих штамів, нешкідлива для людей, викликає напружений і тривалий імунітет, що забезпечує несприйнятливість до циркулюючого в природі дикого штаму вірусу поліомієліту. За останні роки з'явилося багато повідомлень про одержання спадково ослаблених імуногенних штамів ящуру, інфекційного ринотрахеїту, вірусної діареї, міксоматозу кроликів і парагрипу-3 великої рогатої худоби при адаптації до різних видів культур клітин.

Причини виникнення мутацій у процесі адаптації. Зміна властивостей вірусу в процесі пасажів відбувається поступово. У перших пасажах виявляють головним чином віріони, що змінили яку-небудь одну генетична ознака; із збільшенням пасажів у популяції виявляють віріони, які змінили дві і більш генетичних ознак; у подальших пасажах кількість таких часток постійно зростає, і надалі в переважної більшості вірусних часток спостерігається зміна багатьох генетичних ознак. Це свідчить про те, що в основі механізму спадкоємної мінливості вірусної популяції при пасажах лежать два процеси — мутація і селекція, причому й у тім і іншому процесі важливу роль грає зовнішнє середовище, що є одночасно індуктором мутації і селективним фактором .

Якщо гетерогенну вірусну популяцію, що має в складі змінені і вихідні вірусні частки, культивувати в звичайних умовах, то це призводить до її реверсії. Причому, як показали дослідження з аттенуйованими штамами вірусів реверсія змінених ознак може бути зв'язана не тільки з гетерогенністю вірусної популяції, але і з наявністю в генетично однорідній популяції часток вірусу, що володіють низькою стабільністю спадкоємних властивостей.

Факти, що нагромадилися, в області мінливості вірусів не відповідають сталому в літературі визначенню «спрямована мінливість», тому що фактично експериментатор передбачуваної спрямованості біологічних властивостей вірусу не має. Навпаки, нагромадилося велике число фактів про мінливість вірусу, спричиненої хазяїном (host-controlled variation). Ці зміни полягають у тім, що клітина впливає на характер синтезованих у ній компонентів вірусу. Такі модифікації не торкаються нуклеотидної послідовність вірусного генома. Склад білків, закодованих у вірусному геномі, може модифікуватися клітиною-хазяїном. Це обумовлено наявністю в клітині особливих мутагенних форм тРНК (sPHK), у яких порушена нормальна відповідність між антикодоном і здатністю захоплювати визначеному, відповідному цьому антикодону амінокислоту.

Таким чином, клітина-хазяїн може істотно впливати на фенотип вірусу чи блокувати ( частково або цілком) його репродукцію.

Мінливість вірусу в природі. Прикладом такого роду мінливості може служити природна мінливість антигенної структури (гемаглютиніну і нейрамінідази) вірусів грипу людини і тварин (у тому числі птахів), а також вірусів ящуру. Вихідні штами вірусу грипу А2 (1968—1970 р.) і варіанти цих штамів спочатку не розрізнялися між собою за антигенною структурою, біологічною і гемаглютинуючої активності, термостабільності, здатності розмножуватися при 40 °С. Однак пізніше штами, що відносяться до антигенних підгруп А2/1, А2/2 і А2/3, виявили зміну не тільки антигенної структури, але й інших біологічних властивостей цього збудника. Всім добре відома природна мінливість вірусу грипу, яку в останні роки зв'язують з утворенням рекомбінантів вірусів грипу людини і тварин.

В даний час відомо 11 варіантів вірусу ящуру типу О, 32 варіант типу А, 5 — у типу С, 7 — у типу CAT 1 і по 3—у типів CAT 2 і CAT 3. Штами вірусу ящуру типу Азія 1 також неоднорідні за антигенною структурою. У ході епізоотії відбувається як зміна варіантів у межах одного типу, так і зміна самих типів вірусу. В інших вірусів також спостерігається природна мінливість, хоча і менш помітна, чим у вірусів грипу і ящуру і це свідчить про постійну еволюцію вірусів у природі.

Крім антигенної мінливості вірусів у природі, еволюція захоплює і патогенні властивості їх. Життєвий цикл вірусів незрівнянно коротший, ніж життєвий цикл їхніх хазяїнів, тому еволюційні зміни у вірусних популяціях можуть відбуватися в короткі проміжки часу і мати найважливіші наслідки: чи підвищення, чи послаблення вірулентності збудника. Це можна проілюструвати на прикладі варіабельності патогенності епізоотичних штамів вірусу ньюкаслської хвороби. З першою появою ця хвороба в Європі протікала гостро, з високим відсотком загибелі птахів. В даний час усе частіше реєструються вогнища з низькою летальністю і легким перебігом хвороби. Відбувається не тільки зниження кількості вогнищ, але й аттенуація епізоотичних штамів, що дозволило дослідникам виділити природно-ослаблені вакцинні штами B₁, La Sota, F, Бор-74 ВДНКІ. Є багато повідомлень про виділення природно-ослаблених штамів вірусів чуми свиней, хвороби Ауескі (штам Русс), міксоматозу кроликів і кліщового енцефаліту.

Індуковані мутації. Виникають вони при дії на вірус різними хімічними і фізичними мутагенами, а також у процесі адаптації його до незвичайних біологічних систем (при адаптаційній мінливості). Методи адаптації вірусу до незвичайних біологічних систем часто вимагають тривалих зусиль, результати яких важко передбачати, а контроль і керування процесом мінливості не завжди піддаються волі експериментатора.

З тих пір, як установлено, що спадкоємні властивості вірусів визначаються числом і послідовністю розташування нуклеотидів у молекулі нуклеїнових кислот, виникла перспектива одержання живих вакцинних штамів не опосередкованим впливом через змінений обмін речовин макроорганізму, курячий ембріон, культуру кліток, а безпосереднім впливом на них фізичними чи хімічними мутагенами, що викликають структурні і функціональні зміни в молекулі вірусної нуклеїнової кислоти. Застосування штучних мутагенів має свої переваги. По-перше, вони викликають мутації в десятки і сотні разів ефективніше, ніж природні фактори, і, по-друге, дія деяких штучних мутагенів має відому спрямованість, що дозволяє заздалегідь передбачати, на які елементи структури нуклеїнових кислот і яким чином діє той чи інший мутаген і які зміни в них викликає.

Хімічні мутагени. Запропоновано три класифікації хімічних мутагенів: Рехборна (1960), Фріза (1960) і А. Раппопорта (1961). Фріз запропонував розділити мутагени на дві основні групи: 1) мутагени, що реагують з нуклеїновою кислотою тільки під час її реплікації (аналоги пуринових і піримідінових основ); 2) мутагени, що вступають у реакцію зі спочиваючою молекулою нуклеїнової кислоти, але потребуючі для формування мутацій наступних її реплікацій (азотиста кислота, гідроксиламін, алкіліруючі з'єднання) .

В останні роки синтезований і вивчений ряд хімічних сполук — супермутагенів (нітрозопохідних сечовини — нітрозогуанідин і його похідні).

Молекулярні механізми, мутагенної, дії хімічних сполук. В основі молекулярних змін вірусної нуклеїнової кислоти, що призводять до мутації, лежать два основних процеси: заміна основи і випадання чи вставка основи. Фріз розрізняє два типи заміни основ, що входять до складу вірусної нуклеїнової кислоти: просту (транзиція) і складну (трансверсія). При простій заміні на місце однієї пуринової основи встає інша (наприклад, замість аденіну — гуанін) чи одна піримідинова основа заміняється іншою (цитозін - урацилом). Такі заміни відбуваються при індукції мутацій азотистою кислотою. При складній заміні (трансверсії) замість пуринової основи з'являється піримідинова чи піримідинова основа заміняється пуриновою.

Іншої, процес — випадання (розподілу)чи вставка основ — веде до більш глибоких змін генетичного коду, чим проста заміна основ. Мутаційні ушкодження в одній ділянці генома нерідко приводять до зміни декількох генетичних ознак, що мають різне фенотипічний прояв (плейотропія). У той же час основою зміни генетичної ознаки, що має те саме фенотипічне вираження (наприклад, здатність розмножуватися при підвищеній температурі), можуть бути мутаційні ушкодження різних генів.

Для вірусів людини і тварин мутагеном єіформальдегід, за допомогою якого були індуковані мутанти у вірусу поліомієліту і вірусу західного енцефаломієліту коней при впливі відповідно на очищену РНК і внутрішньоклітинний вірус. Механізм мутагенної дії формальдегіду недостатньо вивчений.

Мутагенна дія азотистої кислоти. Серед речовин, що хімічно змінюють основи в молекулі нуклеїнової кислоти, найбільше добре вивчені азотиста кислота і гідроксиламін. Механізм дії азотистої кислоти (HNO₂) як мутагену на нуклеїнові кислоти полягає в дезамінуванні органічних основ, тобто відщіпленні відїх молекул аміногрупи (NH₂). У результаті дії азотистої кислоти аденін (А) перетворюється в гіпоксантін (Гк), гуанін (Г) - в ксантін (К), а цитозін (Ц) - в урацил (У). Внаслідок цієї реакції в дезамінованих органічних основ виникають нові властивості.

Фізичні мутагени. Мутагенна дія підвищеної температури. Температура (40—50 °С) сприяє видаленню пуринів (переважно гуаніну) із ДНК. При реплікації такої ДНК навпроти пролому, викликаним утратою пурину, у ланцюг, що синтезується, можуть бути включені будь-які нуклеотиди. Якщо включиться основа, якої на цьому місці раніше не було, то це означає появу мутації (транзиції чи трансверсії).

Мутагенна дія ультрафіолетового випромінювання. Дія ультрафіолетових променів (УФП) як мутагенів полягає в тому, що вони взаємодіють з молекулами нуклеїнових кислот і поглинаються ними, особливо промені з довжиною хвилі 260—280 нм. Потрапляючи в молекулу нуклеїнової кислоти, вони поглинаються органічними основами. Виявилося, що тимін (Т), урацил (У) і цитозин (Ц) більш чуттєві до ультрафіолетових променів, чим аденін (А) і гуанін (Г).

У результаті опромінення структура зазначених піримідинів змінюється. При опроміненні УФП дві сусідні молекули тимінів з'єднуються один з одним у пари, утворюючи тимінові димери.

Фактори, що впливають на ефективність і спрямованість мутагенезу. Таких факторів, принаймні, вісім: 1) природа мутагену; 2) специфічні особливості вірусу; 3) період взаємодії вірусу з клітиною; 4) число наступних реплікацій вірусу після впливу на нього мутагеном; 5) вибірковість взаємодії мутагену з генами вірусу; 6) умови обробки (рН середовища, її склад, температура); 7) тип клітинної системи; 8) умови культивування.

В однакових умовах експерименту той самий мутаген може неоднаково індукувати мутації в різних вірусів і навіть штамів того самого вірусу. Мутабельність різних ознак під дією того самого мутагену навіть у межах одного штаму різко розрізняється.

Ефективність і специфічність дії мутагенів залежать від концентрації мутагену, рН, сольового складу середовища і ряду інших факторів. Для багатьох мутагенів виявлена пряма залежність між інтенсивністю мутагенезу і дозою мутагену. Однак зі збільшенням дози і посиленням мутагенного ефекту знижується і виживання вірусу. Існує математична залежність між величиною, що визначає частоту мутацій, і виживанням останнього.

Індукований мутагенез залежить також і від складу живильного середовища, у якій знаходиться система вірус-клітина.

Вплив зазначених мутагенних факторів на нативний вірус виявилася менш ефективним, що обумовлено меншою доступністю вірусної нуклеїнової кислоти впливу хімічних мутагенів, нездатних проникати через білкову оболонку вірусу.

Про стабільність мутантів. Не всі мутації, що утворюються під впливом мутагенів, однаково стабільні. Мутанти, отримані при дії підвищеної температури, кислого середовища, ультрафіолетових променів і ультразвукових хвиль, давали близько 20% реверсій, при впливі профлавіну всі мутанти виявилися цілком стабільними. Ці розходження в стабільності зв'язані з неоднаковим молекулярним механізмом дії використаних мутагенів. Підвищена температура, кисле середовище, ультрафіолетові промені викликають головним чином локальні зміни вірусної нуклеїнової кислоти, що ведуть до заміни окремих основ. При одержанні вакцинних вірусних штамів шляхом впливу на вірус мутагенами доцільно використовувати мутагени, що викликають більш глибокі зміни генетичного коду - типу випадення чи вставок, тому що такі мутанти володіють стабільністю спадкоємних властивостей.

Добір мутантів для генетичного аналізу. При роботі з мутагенами важливою ланкою є не тільки індукція, але і виділення мутантів. Добір мутантів роблять на основі аналізу ознак даного вірусу. Однак не всяка нова ознака, що виникає при мутації, придатна для генетичного аналізу. Придатні лише ті ознаки, що легко виявляються, досить стабільні і контролюються одиничною мутацією. У вірусів тварин такі складні ознаки, як патогенність, вірулентність, антигенна структура, контролюються не одним, а багатьма генами.

В даний час добір мутантів вірусів тварин проводиться на основі аналізу умовно летальних мутацій. Всі умовно летальні мутанти даного класу (наприклад, усі ts - мутанти) володіють однією загальною ознакою і фенотипічно в більшості випадків нерозрізнені. Однією з причин виникнення ts-чутливості в результаті мутації є те, що змінюється первинна структура якого-небудь білка, наприклад ферменту. Причому ця зміна така, що при пермісивній температурі фермент працює, а підвищення (зниження) температури змінює його конформацію сильніше, ніж конформацію білка дикого типу, і призводить до відсутності ферментативної активності в мутантного білка.

 

ГЕНЕТИЧНІ І НЕГЕНЕТИЧНІ ВЗАЄМОДІЇ ВІРУСІВ

Як у природних, так і в експериментальних умовах одна клітина може бути заражена не одним, а декількома вірусами. У процесі такої змішаної інфекції можуть бути різні форми взаємодії як між вірусними геномами, так і між продуктами генів. При взаємодії геномів можуть спостерігатися такі форми генетичних впливів, як множинна реактивація, рекомбінація, пересортовування генів, крос - реактивація, гетерозиготність.

При взаємодії на рівні продуктів генів можуть мати місце негенетичні взаємодії: комплементація, інтерференція, фенотипічне змішування й ін.

Рекомбінація. Можливий обмін як повними генами (міжгенна рекомбінація), так і ділянками того самого гена (внутрішньогенна рекомбінація). Утворений вірус-рекомбінант має властивості, які успадковуються від різних батьків.

Штами мікроорганізмів, у тому числі вірусів, які піддаються в експерименті рекомбінації мають характерні, ознаки, що мають назву генетичних маркерів. Для одержання рекомбінантів використовують штами вірусів, що містять два чи більше маркери. Тест рекомбінації застосовують для генетичних досліджень вірусів. З його допомогою можлива побудова генетичних карт вірусів, у яких визначається, у яких ділянках генома відбулися мутації, а також в умовних одиницях виміряється відстань між різними мутаціями.

Рекомбінанти вірусів хребетних вдається одержати тільки при схрещуванні близьких по властивостях вірусів, що належать до одного роду. Частота виникнення їх широко варіює й істотно залежить від використовуваної біологічної системи (клітини, вірусу), а також від того, яку спадкоємну властивість прагнуть рекомбінувати. Рекомбінація з високою частотою спостерігається у РНК-вмістимих вірусів (ортоміксо-, рео-, ретровірусів) і у всіх ДНК-вмістимих вірусів, геном яких представлений двоспіральною ДНК.В експериментальних умовах гібридні (рекомбінантні) форми можна одержати одним з чотирьох способів: 1) при спільному культивуванні двох життєздатних вірусів при введенні їх у організм чи культуру клітин одночасно чи в різний час; 2) якщо в чуттєву систему вводять живий і інактивований (нагріванням чи УФП) вірус; 3) при спільному культивуванні вірусу і вірусної нуклеїнової кислоти, виділеної з іншого штаму; 4) у випадках одночасного введення в культуру клітин різних нуклеїнових кислот, що відповідають двом різновидам вірусів.

Шляхом рекомбінації можна передавати ряд ознак: гемаглютинуючу активність, інгібіторорезистентність, терморезистентність, патогенність для лабораторних тварин, активність розмноження в курячих ембріонах, ферментативну, імуногенну і цитопатогенну активність. Однак одні ознаки (такі, як інгібіторорезистентність гемаглютинуюча активність, інфекційність і імунологічна активність) передаються регулярно, інші — нерегулярно.

При спільному культивуванні інактивованого і живого вірусу передача деяких ознак носить корелятивний характер, а саме придбання однієї властивості спричиняє одночасну появу іншої.

Гібридизація ДНК-вмістимих вірусів була вперше проведена з вірусами віспи кролика й вісповакцини, а також з генетично різними штамами вірусу звичайного герпесу. Гібридизація краще вдається між близькими видами і різновидами, чим між далекими видами, і зовсім не вдавалося одержати гібриди при схрещуванні віспяних вірусів з вірусами інших родин: герпесу, грипу, поліомієліту, ящуру й ін. Гібридизація (рекомбінація) властива усім вірусам, однак у її виявленні є відповідні труднощі. Вона може бути виявлена лише в тому випадку, якщо два батьківських віруси мають різні генетичні маркери, що легко виявляються. Для цієї мети використовують маркери генетичні (мутації), фізичні (батьки мають різну щільність чи радіоактивність) і маркірування за допомогою модифікації, індукованої хазяїном. Друга умова, необхідна для проведення рекомбінації і її виявлення,— обов'язкове проникнення в клітину обох вірусів, що беруть участь у рекомбінації. Для цього використовують високі множині зараження двома батьківськими типами, що беруть звичайно в рівних кількостях. Конкретна методика проведення рекомбінації вірусів залежить у кожнім випадку від їх типу. Тривалість рекомбінації визначається тривалістю циклу розвитку вірусу, температурою (оптимальною температурою розвитку двох вірусних компонентів), вибором клітинної системи - можливістю одночасного розвитку в ній обох вірусів без придушення механізмами клітини-хазяїна і без впливу на потомство, що може спотворити результати рекомбінації.

Множинна реактивація. Вірусна інфекція може виникнути при зараженні клітини декількома віріонами з ушкодженими геномами внаслідок того, що функцію ушкодженого гена може виконувати вірус, у якого цей ген не ушкоджений. Цей феномен був спочатку виявлений на бактеріофагах і одержав назву множинної реактивації. В основі її лежить кооперативний процес, при якому віріони з ураженням певних генів доповнюють один одного шляхом генетичної рекомбінації, і у результаті чого репродукується вихідний неушкоджений вірус.

Ефективність множинної реактивації залежить від багатьох причин: ступеня ушкодження генома віріонів, числа прониклих у клітину віріонів, концентрації їх у визначених ділянках клітини, аутоінтерференції ушкоджених віріонів. При множинній реактивації крім кількості інактивованих вірусних геномів у клітині велике значення має характер культур клітин.

Пересортовування генів. Варіантом рекомбінації є феномен, що одержав назву пересортовування генів. Він спостерігається при генетичних взаємодіях між вірусами, що мають сегментований геном. Найчастіше це відбувається з вірусами грипу А (качка, людина). Утворені при цьому гібридні форми вірусів називають реасортантами.

Гетерозиготність. Це феномен, що полягає в тім, що при одночасній репродукції в клітині декількох часток вірусів, що розрізняються по спадкоємних властивостях, можуть утворюватися віріони, які містять повний геном одного батьківського штаму і, крім того, частина генома (чи повний геном) іншого вірусу. Хоча такого роду об'єднання генетичного матеріалу в одній вірусній частці не успадковується, воно дозволяєтакому віріону дати потомство, у якому буде міститися частина вірусних часток із властивостями одного, а інша частина - іншого батька. Вірусні частки, що дають описаний феномен, одержали назва гетерозигот на відміну від звичайних гомозиготних часток, усе потомство яких має однакові властивості.

Транскапсидація. Транскапсидація - феномен, при якому частина чужорідного генетичного матеріалу, укладеного усередині капсида іншого неспорідненого вірусу, здатна переноситися в стабільній формі в чуттєві до основного вірусу клітини. Цей феномен спостерігається при одночасному вирощуванні в клітинах аденовірусу і мавпячого вірусу SV40.

Крос-реактивація (порятунок маркера). Одним терміном позначалися два різних явища: реактивація інактивованого генома неінактивованим і взаємна реактивація двох інактивованих геномів. Друге явище лише умовно відрізняється від множинної реактивації. Ця відмінність зводиться лише до того, що при множинної реактивації використовують той самий вірус з немаркованим геномом, а при крос-реактивації — здебільшого два штами вірусу з геномами, маркірованими по-різному. Крос-реактивація—феномен, подібний із множинною реактивацією, однак один із вірусів, що бере участь використовується у нативном виді, а інший - інактивують шляхом часткового руйнування генетичного матеріалу (УФ-опроміненням або слабким нагріванням). У цьому випадку зберігаються нативні незруйновані ділянки нуклеїнової кислоти інактивованого вірусу, і у результаті чого можуть виникати рекомбінанти, що володіють властивістю обох використаних у досліді штамів.

Развернуть

Открыть в широком формате