Насколько может увеличиться частота возникновения спонтанных мутаций9

Как рассчитать возможность увеличения частоты спонтанных мутаций? Это третий вопрос, на который надо ответить, если мы хотим получить оценку возможного генетического повреждения, вызванного радиацией. Для этого нужна информация по трем вопросам.

1. Какую дозу облучения получит средний индивид?

2. Сколько будет индуцировано дополнительных мутаций на единицу дозы?

Ответив на эти два вопроса, мы узнаем, насколько увеличится частота мутаций по отношению к частоте их спонтанного возникновения. Для перевода этой относительной оценки в абсолютную надо ответить на другой вопрос.

3. Сколько мутаций должно возникать «спонтанно», т. е. без дополнительного облучения, обусловленного факторами современной цивилизации?

Ответ на первые два вопроса может быть получен из разд. 5.2.1.3 и 5.2.1.4, а также материалов некоторых дополнительных, прямых обследований людей. Третий вопрос оказывается самым трудным и потребует специального обсуждения. Данные, приведенные в табл. 5.26, показывают, что среднее облучение индивида за время одного поколения, равное 30 годам, увеличится от 0,03-0,04 Гр («естественное» облучение) до 0,07 Гр, т. е. факторы современной цивилизации приблизительно вдвое повысят фоновую радиацию. Такое удвоение ни в коем случае не надо путать с дозой облучения, удваивающей частоту мутаций. Эта доза гораздо выше 0,03 Гр. Таков ответ на первый вопрос. Ответ на второй вопрос несколько сложнее и требует более развернутого обсуждения.

Сколько будет индуцировано дополнительных мутаций в расчете на дозу? Мутации разных классов следует рассматривать по отдельности, принимая во внимание мощность дозы и пол индивида (разд. 5.2.1.3). Большинство людей испытывают воздей-

244 5 Мутации

ствие очень низких доз хронического облучения при весьма низких дозовых мощностях; только очень немногие подвергаются воздействию высоких доз при очень высоких дозовых мощностях.

Сначала мы обсудим имеющиеся в нашем распоряжении прямые данные об облученных популяциях человека, а потом сравним эти данные с материалами, полученными в обсуждавшихся выше экспериментах на мышах и других млекопитающих. Такой подход позволит нам количественно оценить частоту возникновения различных типов мутаций, выраженную в долях от частоты спонтанного мутирования.

Фенотипические характеристики облученных популяций человека. Кроме сомнительных с этической точки зрения экспериментов на добровольцах, прямая оценка генетических эффектов радиации может быть получена только при облучении людей либо с терапевтическими целями, либо в результате аварии. В случае лечебных процедур оценки доз, как правило, довольно точны, однако число облучаемых индивидов невелико и отбираются они в результате обнаружения у них различных заболеваний. При терапевтическом воздействии радиация обычно применяется в виде нескольких очень высоких доз, а профессиональное облучение характеризуется низкими дозовыми мощностями. В случае аварий оценка дозы может быть очень неточной, однако дозы и дозовые мощности, как правило, высоки.

Оставшиеся в живых жертвы атомной бомбардировки Хиросимы и Нагасаки [1639; 1640; 1573; 1576]. После взрывов атомных, бомб в Хиросиме и Нагасаки американские и японские ученые под эгидой Комиссии по изучению последствий атомной бомбардировки (КПАБ; англ. АВСС-Atomic Bomb Casualty Commission) еще в 1946 г. организовали продолжающееся с тех пор генетическое обследование уцелевших жителей, которое с 1975 г. проводится под покровительством Фонда по исследованию радиационных эффектов (ФИРЭ; англ. RERF-Radiation Effects Research Foundation). Это единственная попытка организации в рамках «большой науки» долговременного проекта по генетике человека.

1. Есть ли какие-нибудь различия между детьми, зачатыми после облучения родителей в результате взрыва атомной бомбы, и детьми необлученных родителей?

2. Если такие различия существуют, то чем они объясняются?

Сбор данных облегчался существованием в послевоенной Японии системы нормирования пищевых продуктов, при которой беременных женщин обеспечивали дополнительным питанием. Когда женщины обращались с просьбами о добавочном пайке, им давали заполнить анкету с вопросами об их прошлых беременностях, точном местонахождении в момент взрыва бомбы и любых симптомах, которые могли бы свидетельствовать о радиационной болезни. Когда рождался ребенок, в анкету вписывали соответствующие данные о родах и состоянии здоровья новорожденного; каждый ребенок обследовался врачом из комиссии КПАБ. Около одной трети этих детей через 9 месяцев проходили повторный осмотр. В последующие годы методы обследования и регистрации изменились. Стали фиксироваться следующие параметры:

а) соотношение полов при рождении;

б) врожденные пороки развития;

в) мертворождения;

г) вес тела при рождении;

д) смертность в первые 9 месяцев жизни и смертность в детские и юношеские годы;

е) антропометрические характеристики;

ж) результаты аутопсии.

Критически настроенный читатель может спросить, почему не учитывались самые важные показатели генетического повреждения-хромосомные аберрации в соматических и половых клетках и доминантные или сцепленные с Х-хромосомой рецессивные мутации de novo. Ответ прост: методы анализа хромосом человека появились только через 10-15 лет, а доминантные или сцепленные с Х-хромосомой генные мутации так редки, что нельзя ожи-

5. Мутации 245

дать наличия их достаточного числа в изучаемой популяции.

Каждый родитель был отнесен к одной из пяти групп в соответствие с полученной дозой облучения: группа, получившая самую низкую дозу, состояла из людей, отсутствовавших в городе во время бомбардировки; группа, подвергшаяся наибольшему облучению, включала лиц, страдавших в последующие месяцы от симптомов лучевой болезни (потери волос; петехии; гингивита). Учитывалось кровное родство родителей и возраст матерей для того, чтобы избежать смещений, обусловленных этими факторами.

Сдвиг соотношения полов обусловлен Xсцепленными леталями? Результаты этих исследований можно суммировать очень кратко. Независимо от степени воздействия излучения не было найдено никаких различий по числу пороков развития, частоте мертворождений или по какому-либо другому из изучавшихся параметров, за исключением одного лишь соотношения полов. Если материнская половая клетка содержит Х-сцепленный рецессивный летальный ген, он перейдет незамеченным к ее гетерозиготной дочери. Однако мужская зигота будет гемизиготной и элиминируется. Следовательно, индуцированные облучением Х-сцепленные рецессивные летали сдвинут соотношение полов в пользу дочерей. С другой стороны, Х-сцепленные доминантные летали при их индукции в женских половых клетках приведут к одинаковой гибели мужских и женских зигот и не окажут влияния на соотношение полов. При индукции у отцов Х-сцепленные доминантные мутации вызовут гибель только женского потомства, так как Х-хромосома отцов передается только дочерям. Х-сцепленные рецессивные летали, индуцированные у отцов, совсем не повлияют на соотношение полов у их детей. Поэтому в противоположность радиационному эффекту при облучении матерей облучение отцов сдвинуло бы соотношение полов в пользу мальчиков.

Проведенный анализ основывался на данных о 46 752 детях, родившихся в течение 10 лет после облучения матери (27 057), отца (7525) или обоих родителей (12170). Для всех категорий соотношение полов сдвигалось в ожидаемом направлении [1639]. После облучения матерей больше рождалось девочек, а после облучения отцов - мальчиков. При облучении обоих родителей материнский эффект, по-видимому, превышал отцовский. Как показало применение соответствующих тестов, эти результаты не являются статистически достоверными. Однако в 11 из 12 сравнений прослеживался эффект, имевший ожидаемое направление.

Подтверждение вывода о сдвиге соотношения полов, полученное при обследовании людей, облученных рентгеновскими лучами. Сходный сдвиг соотношения полов наблюдался у детей родителей, подвергавшихся рентгеновской терапии при лечении анкилозирующего спондилита, анального и вульвального зуда, а также других заболеваний. Два исследования, одно из которых было выполнено во Франции [1530], а другое--в Нидерландах [1632], вместе охватили несколько сот пациентов, облученных высокими дозами, иногда составлявшими несколько сотен рентген. Соотношение полов у детей, зачатых после облучения, отклонялось в ожидаемом направлении, и эти отклонения были статистически значимыми.

Облучение в терапевтических целях и облучение в результате взрыва атомных бомб характеризуются высокими дозами и высокими дозовыми мощностями. С другой стороны, лица, подвергающиеся профессиональному облучению, обычно получают сравнительно низкие дозы и при низких дозовых мощностях. Вызывают ли и эти дозы сдвиг в соотношении полов? Исследование, проведенное в Японии, дало положительный ответ: обнаружено не только изменение соотношения полов у их детей, но и, по-видимому, более частое, чем в общей популяции, проявление бесплодия [1653].

Второе исследование, проведенное в Хиросиме и Нагасаки: отсутствие сдвига в соотношении полов [1640]. Через несколько лет после первого сообщения были

246 5. Мутации

опубликованы дополнительные данные о беременностях, протекавших в интервале между 1956 и 1962 гг. Анализ производился таким же образом, хотя методика сбора данных в некоторых деталях отличалась от той, что применялась в случае первой выборки. Эта выборка включала несколько меньшее число детей облученных родителей. В данном исследовании не удалось выявить каких-либо различий в соотношении полов.

Всю совокупность полученных в Хиросиме и Нагасаки сведений о соотношении полов можно интерпретировать одним из трех способов: 1) можно предположить, что отклонения в соотношении полов, обнаруженные в выполненном ранее исследовании, случайны, а дозы радиации, полученные оставшимися в живых жертвами атомной бомбардировки, не индуцировали Х-сцепленных леталей в количестве, достаточном для того, чтобы произвести сдвиг в соотношении полов; 2) можно допустить, что соотношение полов в действительности не свидетельствует о возникновении Х-сцепленных мутаций, иными словами приведенная выше аргументация носит слишком упрощенный характер; 3) наконец, третья возможность заключается в том, что эффект, наблюдавшийся на изучавшейся ранее выборке, был вполне реальным, но за 10-15 лет, прошедших со времени облучения до зачатия детей, вошедших во вторую выборку, половые клетки, содержащие летальные мутации, были элиминированы. Результаты исследований, проведенных в Европе [1530; 1632], в которых были обнаружены сдвиги в соотношении полов у детей лиц, облученных с медицинскими целями, свидетельствуют в пользу последнего объяснения.

Однако факт остается фактом: соотношение полов является неудовлетворительной мерой генетических эффектов радиации, поскольку испытывает влияние множества других переменных, таких как возраст родителей и общие условия жизни. Данные исследований по изучению последствий облучения, несмотря на громадные затраты времени и человеческих сил, дали хотя и наводящие на размышления, но не вполне убедительные свидетельства радиационной индукции Х-сцепленных леталей.

Пересмотр прежних представлений с учетом новых данных и методов [1572; 1615; 1641] (табл. 5.27). Цитогенетическое изучение детей уцелевших жертв атомной бомбардировки началось в 1968 г. Следовательно, уже не было возможности зафиксировать аберрации, приводящие к тяжелым порокам развития и ранней смерти, так как за прошедшее время эти дети умерли. В середине 1970-х гг. началось качественное и количественное изучение изменчивости белков крови (поиски редких электрофоретических вариантов). Кроме того, на основе информации о 70 082 родах была произведена переоценка данных о «неблагоприятных исходах беременности», под которыми подразумеваются и мертворождение, и(или) грубый врожденный дефект, и(или) смерть в течение первой недели после рождения. Дополнительно

Таблица 5.27. Генетические эффекты у детей оставшихся в живых жертв атомной бомбардировки в Хиросиме и Нагасаки [1572; 1641; 1615]
а) Белковые мутанты (30 генных локусов)
	Облучение	Контроль
Число изученных локусов	543 664	386 706
Число подтвержденных мутаций de novo
Частота мутаций 5,4 х 10–6
б) Гоносомные хромосомные аберрации
Число изучавшихся детей
Число гоносомных аберраций (XXX, XXY, XYY)
в) Неблагоприятные исходы беременности
Число изучавшихся родов
Число неблагоприятных
исходов	(4,80%)	(4,64%)
г) Смертность до 17 лет
Число детей	27 925	22 764
Число смертей в возрасте до
17 лет	(6,56%)	(6,14%)

5. Мутации 247

была включена в рассмотрение смертность в возрасте до 17 лет. Ни один из параметров не обнаружил статистически достоверных отличий от соответствующих величин для необлученной популяции. Однако при обработке этих данных была изменена стратегия получения оценок. В старых работах облученных индивидов делили на подгруппы в зависимости от того, на каком расстоянии от эпицентра взрыва они находились и наличия или отсутствия у них лучевой болезни. После этого проводилось тестирование на отклонение от нулевой гипотезы (генетический эффект полностью отсутствует). В новых исследованиях для каждого облученного индивида определялась на основе более полного знания о типах радиации, излучавшейся при взрывах этих бомб, величина дозы облучения и учитывалась вся имеющаяся информация, например данные о расстояниях от эпицентра, о местонахождении в укрытиях и т. д. Средняя доза на организм, полученная всеми, кто действительно подвергся облучению (т.е. находился менее чем в 1600 м от эпицентра), немного превышала 10 рад, а доза, полученная гонадами, составляла около половины этой величины. Однако колебания доз, полученных облученными индивидами, чрезвычайно велики; некоторые люди получили дозы, превышающие 100 рад. После вычисления индивидуальных доз авторы уже не проводили проверки нулевой гипотезы. Свое решение они обосновали так: поскольку известно и общепризнано, что ионизирующая радиация индуцирует мутации, любое увеличение эффектов, которые можно с достаточными основаниями связать с мутациями, является ли оно статистически достоверным или нет, вероятно, вызывается дополнительными индуцированными мутациями. Поэтому они рассчитывали регрессии величины роста вредных эффектов по величине облучения. Эти регрессии вместе с определенными предположениями об участии мутаций de novo, объясняющем «спонтанное» появление изучаемых событий, использовались для оценки удваивающих доз. Например, предполагалось, что 1 из 400 новорожденных, страдающих из-за неблагоприятного исхода беременности, появляется в результате возникновения новой мутации. Полученные удваивающие дозы составляли 535 рэм для числовых аномалий половых хромосом, 69 рэм для неблагоприятных исходов беременности и 147 рэм для смертности в детском возрасте. Кроме того, было обнаружено небольшое статистически недостоверное увеличение частоты редких электрофоретических вариантов; в данном случае получение оценки удваивающей дозы невозможно, так как в контроле мутантов de novo нет. При сравнении с оценками удваивающих доз, основанными на данных о мышах - 40 рэм для острого и 100 рэм для хронического облучения (разд. 5.2.1.3), - с учетом того, что облучение людей было острым, эти оценки, казалось, свидетельствовали, что люди более радиорезистентны, чем мыши. Однако вряд ли эти данные сопоставимы. Даже такой четко определяемый генетический параметр, как частота хромосомных аберраций, не пригоден, поскольку в то время исследователи еще не располагали цитогенетическими методами. Это исключает использование не только большинства хромосомных аберраций, но и большей части трисомий по аутосомам. Приведенная оценка целиком основана на материалах о числовых аберрациях Х-хромосом, а для этой категории экспериментальные данные об увеличении соответствующих частот скудны даже в случае мышей, если исключить данные о потерях отцовских Х-хромосом после облучения оплодотворенных ооцитов на стадии пронуклеуса. Неблагоприятный исход беременности и смерть в возрасте до 17 лет зависят от столь многих различных факторов окружающей среды, что любая оценка генетических эффектов будет крайне грубой. Это остается верным даже при доскональном учете таких важных факторов, как кровное родство и социоэкономический статус. Метод, применяемый для поиска мутантных электрофоретических вариантов белков, не выявляет делеций, которые индуцируются радиацией с большей вероятностью, чем точковые мутации, по которым (почти) никаких различий не обнаружено.

Суммируя результаты изучения детей

248 5. Мутации

 

уцелевших жертв атомной бомбардировки Хиросимы и Нагасаки, можно сказать, что атомный взрыв не привел к генетической катастрофе среди потомства довольно сильно облученных лиц, переживших эту трагедию. Напротив, у потомков первого поколения вообще трудно обнаружить какие-либо генетические эффекты радиации. Мы покажем, что это, вероятно, справедливо также и в отношении будущих поколений. Ужас атомной катастрофы связан с сильнейшим кратковременным воздействием облучения на индивидов и в меньшей степени с мутациями в соматических тканях, проявляющимися в последующей жизни в виде, например, злокачественных новообразований, в случае которых латентный период составляет 10-40 лет.

Облучение родителей по медицинским показаниям и трисомия по 21-й хромосоме у их детей. Сообщения о частотах трисомии по 21-й хромосоме (синдром Дауна) у детей матерей, проходивших рентгеновскую диагностику или терапию, противоречивы. Зиглер и др. (1965) [1620] провели сравнение доз радиации, полученных 216 матерями детей с синдромом Дауна с дозами, которые получили 216 других матерей того же возраста и социального происхождения. Дозы были явно выше в случае матерей детей-трисомиков. Ушида и др. (1968) [1663] сравнили частоту анеуплоидии среди детей облученных и необлученных женщин. Несмотря на то, что другие изучавшиеся параметры не проявили никаких различий, среди потомков облученных женщин оказались десять детей с анеуплоидиями, у восьми из которых был синдром Дауна, а у двух - трисомия по 18-й хромосоме. В контроле обнаружен только один ребенок с синдромом Дауна; различие оказалось статистически недостоверным. Однако дозы радиации, полученные гонадами этих матерей, были очень низкими, составляя от 0,007 до 0,126 Гр. Имеются другие работы, свидетельствующие в пользу предположения о повышенной частоте анеуплоидий у детей, появившихся после радиационного облучения их матерей. За прошедшее время исследователи часто возвращались к этой проблеме (см. обзор [1377]); в большинстве работ не обнаружено никакого радиационного эффекта. Некоторые старые работы носили ретроспективный характер, то есть факт облучения устанавливался в них уже после рождения детей.

Такая методика исследований может приводить к смещению оценок, если изучение радиационных доз проводится (что вполне понятно) более основательно в случае матерей, имевших ребенка с синдромом Дауна, чем в контрольной группе. С другой стороны, в работе Ушиды реализован проспективный подход. В ней сравнивали исходы беременностей у матерей, подвергавшихся и не подвергавшихся воздействию радиации. Среди работ, давших отрицательные результаты, были как ретроспективные, так и проспективные исследования.

Из обсуждавшихся в разд. 5.2.1.3 данных, полученных на мышах, можно было бы сделать вывод, что облучение женщин низкими дозами радиации задолго до оплодотворения не должно вызывать повышения частоты нерасхождений в ооцитах. Кроме того, можно предположить, что женщины, нуждающиеся в рентгеновском обследовании, отличаются от прочих женщин по состоянию здоровья, что и влияет на риск нерасхождения. Следовательно, весьма вероятно, что в данном случае мы имеем дело с ложной корреляцией. Недавно были представлены доказательства того, что облучение человеческих лимфоцитов in vitro малыми дозами может увеличивать частоту нерасхождений в соматических клетках [1664].

Повышается ли частота структурных хромосомных аномалий и больных с синдромом Дауна в человеческих популяциях, обитающих в регионах с высоким естественным уровнем радиации? В некоторых районах Бразилии и Южной Индии (штат Керала) имеется высокий фон радиации (в 10100 раз превышающий нормальный уровень), обусловленный присутствием в монацитовых песках почвы таких радиоактивных элементов, как торий и радий. В Бразилии было проведено исследование хромосом 12 000 жителей, подвергающихся

5 Мутации 249

 

хроническому облучению. Оно выявило значимое, хотя и на грани статической достоверности, увеличение в культурах лимфоцитов таких хромосомных аберраций, как делеции, дицентрики и кольцевые хромосомы [1381]. Среди 12 918 жителей штата Керала (Южная Индия) было обнаружено 12 субъектов с синдромом Дауна, еще 12 с тяжелой умственной отсталостью и пороками развития и 11 с тяжелой умственной отсталостью без дополнительных пороков развития, тогда как среди 5939 контрольных индивидов не оказалось ни одного больного с синдромом Дауна и были лишь один пациент с тяжелой умственной отсталостью и пороками развития и два с сильной умственной отсталостью без каких-либо иных клинических симптомов. Кроме того, проверка хромосом в культурах клеток крови облученных индивидов выявила небольшое увеличение числа хроматидных и хромосомных аберраций [1523]. В то время как увеличение частоты хромосомных аберраций в соматических клетках, о котором сообщалось в обоих исследованиях, вероятно, действительно имело место, повышение частоты случаев синдрома Дауна, зафиксированное во втором исследовании, легко могло быть вызвано смещением при определении частот или другими различиями между тестируемой и контрольной популяциями, поскольку в контроле синдром Дауна встречался крайне редко. Необходимы дальнейшие исследования.

В Китае было предпринято изучение популяции численностью 80 000 человек, проживающей в двух высокорадиоактивных районах Янцюаньского округа. Оказалось, что в этих районах фон радиации примерно в три раза выше, чем в контрольной местности. Как правило, изучавшиеся семьи проживали в этих районах в течение шести и большего числа поколений; никаких существенных различий по общим условиям жизни между высокорадиоактивными и контрольным районами не было. Эти исследования не выявили в указанной популяции какого-либо увеличения смертности от рака или доли детей, страдающих от определенных генетических дефектов и болезней, по сравнению с контролем. Небольшое увеличение числа пациентов с синдромом Дауна можно объяснить большим средним возрастом матерей в группе, подвергающейся воздействию повышенного фона радиации. Частота хромосомных аномалий в лимфоцитах индивидов, живущих в условиях высокого радиационного фона, была немного, но достоверно повышена [1416; 1427; 1436; 1487; 1535].