Мукополисахаридозы

Недостаточность ферментов лизосом. Ферменты или ферментные системы обычно локализуются в одном определенном районе клетки. Например, ферменты системы транспорта электронов и окислительного фосфорилирования ADP, как и другие ферменты, окисляющие пируват, жирные кислоты и некоторые аминокислоты, локализуются в митохондриях. Многие гидролитические ферменты сконцентрированы в лизосомах [1128]. Если в результате разрушения мембраны лизосомы эти ферменты выходят в цитоплазму, вся клетка подвергается самоперевариванию и гибнет. В норме процесс переваривания осуществляется внутри лизосом, в которых расщепляются не только дефектные компоненты клетки и материал межклеточной соединительной ткани, но и внешний материал, поглощаемый клеткой. К клеточным элементам, которые подвергаются деградации в лизосомах, относятся мукополисахариды, муколипиды и сфинголипиды (рис. 4.8). В настоящее время описаны дефекты многих ферментов, участвующих в деградации [1029, 1240, 1241].

Метаболические пути, нарушения которых вызывают дефект эритроцитов и, следовательно, гемолитическую анемию, уже известны биохимикам, и анализ недостаточности ферментов заключался в изучении отдельных этапов этих реакций. В случае мукополисахаридозов ситуация была совершенно иной. Вначале были изучены наследственные заболевания, и только потом анализ дефектов позволил установить последовательность ферментативных реакций. Вот почему мы начнем с описания этих заболеваний, а затем перейдем к биохимическим нарушениям, дефектам фермент ов и реконструкции нормального метаболического пути. Этот пример показывает, каким образом наследственные заболевания (фактически эксперименты, поставленные самой природой) помогают понять нормальную физиологию и биохимию.

Мукополисахаридозы: клиническая картина. Мукополисахаридозы - группа редких

заболеваний, для которых характерно сочетание многих, зачастую тяжелых симптомов, от нарушений скелета или системы кровообращения до расстройств умственной деятельности. Клинические симптомы являются результатом накопления в разных тканях избыточных сульфатированных полисахаридов.

В табл. 4.5 приведена классификация, а также главные результаты клинических исследований. За исключением мукополисахаридоза II типа (синдром Хантера), все эти дефекты наследуются как аутосомнорецессивные признаки. Клинические симптомы варьируют от сравнительно легких до крайне тяжелых. Описаны две формы

30 4 Действие генов

 

Рис. 4.8. Схематическое изображение функционального цикла нормальной лизосомы. 1А Аппарат Гольджи, 1Б Первичная лизосома, 2 Фаголизосома, 3 Вторичная лизосома, 4 Остаточное тело (Courtesy of Dr Buselmaier)

 

синдрома Хантера (30990), которые удается различить у детей старше четырех лет тяжелая «ювенильная» форма, при которой смерть наступает до половой зрелости, и легкая «поздняя» форма, при которой умственная отсталость почти или полностью отсутствует, а прогноз является гораздо более благоприятным Заболевание VI типа (синдром Марото—Лами) (25320) отличается от заболевания I типа (синдром Хурлера) тем, что умственные способности пациентов нормальные и менее выражены аномалии лица В этом случае также наблюдаются два различных подтипа – один с характерным достаточно быстрым течением и тяжелой клинической картиной и другой, прогрессирующий относительно медленно При обоих типах заболевания возможна смерть в возрасте 10-30 лет от нарушений в работе сердца Обнаружены два подтипа IV типа заболевания (синдром Моркио) IVA с тяжелой клинической картиной и IVB, который протекает легче

Отложение запасных веществ в лизосомах и выделение с мочой Гистохимические исследования показали, что эти патологические состояния вызваны нарушениями отложения запасных веществ Во многих клетках, в том числе в фибробластах, клетках печени, клетках Купфера, ретикулярных клетках селезенки и лимфатических узлов, лейкоцитах, эпителиальных клетках почечных клубочков и нервных клетках наблюдаются вакуолизация и увеличение размеров в результате отложения больших количеств запасного материала Установлено, что главными запасными веществами являются сульфатированные гликозаминогликаны

Электронно-микроскопические исследования позволили прояснить ситуацию Было установлено, что запасные соединения откладываются в вакуолях округлой формы, напоминающих лизосомы, которые можно визуализировать у экспериментальных животных после введения им неметаболизируемых соединений Поэтому был сделан вывод, что эти вакуоли представляют собой лизосомы, наполненные непереваренными или лишь частично расщепленными гликозаминогликанами [1129] Это подтвердилось и для других тканей Хотя дефекты метаболизма оставались неисследованными, нарушения отнесли к лизосомным болезням, так как они сопровождались явной перегрузкой системы лизосом Важнейшая функция лизосом заключается в гидролитическом расщеплении макромолекул, поэтому представлялось вероятным, что отложение избыточных запасных веществ связано с недостаточностью гидролитических ферментов лизосом Другим доказательством нарушения метаболизма гликозаминогликанов было избыточное выделение этих соединений с мочой Табл 4 6 дает некоторое

 

Таблица 4.5.Основные клинические признаки мукополисахаридозов [1029; 1312]

Мукополисахаридоз	Умственная или двигательная отсталость	Задержка роста	Грубые складки на лице	Дисплазия костей	Общие контрактуры	Гепатоспленомегалия	Помутнение хрусталика	Характер наследования
Тип 1)	Название
IH	Синдром Хурлера (1)	+ + +	+ +	+ + +	+ + +	+ +	+ +	+	Аутосомнорецессивный
IS	Синдром Шайе (1)	–	–	±	+	+	+	+
IH/S	Компаунд по синдромам Хурлера и Шайе О)	+	+	+ +	+ +	+ +	+	+
IIA	Тяжелый синдром Хантера (2)	+	+	+	+ +	+	+	+	Х-сцепленный, рецессивный
IIВ	Легкий синдром Хантера (2)	+	+	+	+ +	+	+
IIIА	Синдром Санфилиппо А (ЗА)	+ + +		+	+	±	+ +	–	Аутосомнорецессивный
IIIВ	Синдром Санфилиппо В(ЗВ)	+ + +	–	+	+	+	+ +	–
IIIС	Синдром Санфилиппо С (ЗС)	+ + +	–	+	+	+	+ +	–
HID	Синдром Санфилиппо D (3D)	+ + +	–	+	+	±	+ +	–
IVA	Синдром Моркио А (4)	–	++ +	+	+ + +	+	+	+	Аутосомнорецессивный
IVB	Синдром Моркио В (4)	–	+ +	+	+ +	+	+	+
V		резервный номер
IVA	Классическая форма синдрома Марото— —Лами (6)	–	+ +	+ +	+ +	+	+	+	Аутосомнорецессивный
VIB	Легкая форма синдрома Марото— —Лами (6)	–	+	+	+	+	+	+
VII	Скрытый мукополисахаридоз (7)	+	±	±	+	–	+ +	+	Аутосомнорецессивный
" Классификация Мак-Кьюсика (1972) с дополнениями. - отсутствует; + иногда наблюдается; + в легкой форме; + + средней тяжести; + + + в тяжелой форме. В скобках приведены обозначения генетических блоков, соответствующие рис. 4.11 и 4.12.

32 4. Действие генов

Таблица 4.6.Выделение сульфатированных гликозаминогликанов с мочой при мукополисахаридозах [1029]
Мукополисахаридоз	Выделяющийся гликозаминогликан
IHи IS	Дерматансульфат и гепарансульфат в соотношении 3:1
II	Дерматансульфат и гепарансульфат в соотношении 1:1
IIIА, IIIВ,	Гепарансульфат
IIIС, IIID
IVA, IVB	Кератансульфат и хондроитин6-сульфат
VI	Дерматансульфат, иногда также некоторое количество гепарансульфата (?)
VII	Дерматансульфат и, возможно, гепарансульфат

 

представление о выделении разнообразных гликозаминогликанов при различных синдромах. Природа выделяющихся веществ отражает характер метаболических нарушений (табл. 4.7).

Биохимия сульфатированных гликозаминогликанов. Сульфатированные гликозаминогликаны представляют собой сложные гетеросахариды, состоящие из длинных полисахаридных цепей, ковалентно связанных с белковым кором. Полисахаридные цепи дерматансульфата, гепарансульфата, хондроитин-4- и хондроитин-6-сульфата построены из чередующихся остатков глюкуроновой кислоты и сульфатированного гексозамина. Кератансульфат отличается от других гликозаминогликанов тем, что вместо глюкуроновой кислоты содержит остатки галактозы. Полимерные цепи насчитывают до 100 остатков. Они связаны с особым участком в молекуле специфического белка. К одной молекуле полипептида могут быть присоединены несколько полисахаридных цепей. Такие протеогликаны

Таблица 4.7.Дефекты метаболизма при мукополисахаридозах [1029]
Мукополисахаридоз 1)	Главное накапливающееся вещество	Дефектный фермент
IH	Синдром Хурлера	Дерматансульфат и гепарансульфат	α-L-идуронидаза
IS	Синдром Шайе		— »—
IH/S	Компаунд по синдромам Хурлера и Шайе		-»-
ПА	Тяжелая форма синдрома Хантера	Дерматансульфат и гепарансульфат	Идуронатсульфатаза
IIВ	Легкая форма синдрома Хантера	-»-	—» —
IIIА	Синдром Санфилиппо А	Гепарансульфат	Гепаран-N-сульфатаза
IIIВ	Синдром Санфилиппо В		a-N-ацетилглюкозаминидаза
IIIС	Синдром Санфилиппо С		а-глюкозаминидаза (?)
IIID	Синдром Санфилиппо D		N-ацетилглюкозамин-6-сульфатаза
	Синдром Моркио А	Кератансульфат	N-ацетилгалактозамин-6-сульфатаза
IVB	Синдром Моркио В		Р-галактозидаза
VIA	Классическая форма синдрома Марото—Лами	Дерматансульфат	М-ацетилгалактозамин-4-сульфатаза (арилсульфатаза В)
VIB	Легкая форма синдрома Марото—Лами		— » —
VII	Скрытый мукополисахаридоз	Дерматансульфат и гепарансульфат	β-глюкуронидаза
1) Классификация Мак-Кьюсика (1972) с дополнениями.

 

4. Действие генов 33

 

Рис. 4.9. Димер L-идуроновой кислоты и N-ацетилгалактозамин-4-сульфата в дерматансульфате.

способны образовывать и более крупные комплексы благодаря нековалентным связям. Содержание различных Сахаров в полисахаридных цепях и степень их сульфатирования могут значительно варьировать.

Например, большая часть полисахаридной цепи дерматансульфата построена из повторяющихся димеров Lидуроновой кислоты и N-ацетил-галактозамин-4-сульфата (рис. 4.9). Другие гликозаминогликаны имеют сходное строение. Они являются компонентами соединительной ткани и основного вещества, заполняющего пространство между клетками.

У больных мукополисахаридозами основу структуры гликозаминогликанов соединительной ткани составляют те же крупные протеогликановые образования, которые обнаруживаются и в норме. Отсюда следует, что их синтез не нарушается в результате дефекта фермента. В тканях, где наблюдается аномальное отложение гликозаминогликанов, а также в моче эти молекулы варьируют по длине и имеют меньшие размеры. Это позволяет предполагать, что в клетках происходит расщепление максимально возможного числа связей перед тем, как процесс блокируется из-за дефекта специфического фермента, необходимого для отщепления очередного остатка.

Ферментативные дефекты. Наиболее прямым подходом к исследованию нарушений метаболизма служит поиск соединений, метаболизм которых осуществляется неправильно, и измерение активности ферментов, участвующих в его превращении. Именно таким способом были изучены уже рассмотренные дефекты эритроцитов. Исследования же мукополисахаридозов были затруднены, поскольку не были известны ни детали химической структуры соответствующих гликозаминогликанов, ни ферменты, осуществляющие в норме их катаболизм. Систематическое изучение стало возможным лишь тогда, когда выяснилось, что в культурах фибробластов из кожи больных с синдромами Хантера или Хурлера накапливаются гликозаминогликаны. Важнейшим этапом следует считать доказательство того, что in vitro (в культуре) накопление может быть уменьшено до нормы под действием корректирующего фактора из тканевой жидкости. Впервые это было показано в 1968 г. Неуфельдом и др. [1240]. На основании различий в типе наследования – синдром Хурлера передается потомкам как аутосомнорецессивный признак, а синдром Хантера сцеплен с Х-хромосомой - можно было предположить, что эти заболевания генетически различны, т. е. мутации затрагивают разные реакции расщепления мукополисахаридов. Если бы можно было осуществить слияние ядер клеток, взятых у больного с синдромом Хурлера и у больного с синдромом Хантера (как это было сделано для многих различных типов клеток в работах по генетике соматических клеток), это должно было бы привести к взаимной комплементации дефектов. В ходе решения этой задачи выяснилось, что проблема значительно проще и в слиянии клеток нет необходимости. Для компенсации дефектов, присущих синдромам Хурлера и Хантера, достаточно смешать соответствующие клетки в культуре или даже к клеткам одного генотипа добавить культуральную жидкость, в которой росли клетки другого генотипа. Накопление мукополисахаридов измеряли по включению ³⁵SO₄. На рис. 4.10 показаны результаты этих опытов. Компенсация одного из дефектов (синдрома Хурлера) достигалась с использованием как нормальных клеток, так и клеток с другим дефектом (синдромом Хантера) [1086].

В последующие годы подобные эксперименты были выполнены и для других клинических типов, а обнаруженные кор-

34 4, Действие генов

Рис. 4.50. Аномальное включение 35SO4 в клетки больных с синдромами Хурлера и Хантера. При смешивании нормальных клеток с клетками больных одним из синдромов включение 35SO4 уменьшается. Такой же результат можно наблюдать при смешивании клеток пациентов, страдающих разными синдромами. Уровень включения при этом близок к норме [1086].

 

ректирующие факторы охарактеризованы биохимически. Оказалось, что фибробласты больных с синдромом Санфилиппо образуют по меньшей мере две группы, А и В, в которых дефектными являются различные факторы, поэтому клетки групп А и В способны к взаимной коррекции. Таким образом, синдром Санфилиппо генетически неоднороден. С другой стороны, несмотря на глубокие различия в клинической картине синдромов Хурлера и Шайе, фибробласты, взятые у соответствующих больных, дефектны по одному и тому же фактору.

Вскоре было показано, что все корректирующие факторы представляют собой специфические белки. Более подробный анализ показал, что это лизосомные ферменты, участвующие в расщеплении сульфатированных гликозаминогликанов. Важную роль в выяснении механизмов подобных дефектов сыграли и современные представления о структуре этих соединений, и анализ функций корректирующих факторов, и прямые эксперименты по идентификации поврежденных ферментов.

Предполагалось, что при этих нарушениях дефектными являются ферменты, специфически расщепляющие различные типы связей в молекулах гликозаминогликанов. Предсказания на основе этой гипотезы подтверждались экспериментально. Например, при инкубации корректирующего фактора Санфилиппо А (25290) in vitro с гепарансульфатом, выделенным из фибробластов больного с синдромом Санфилиппо и меченным ³⁵SO₄, наблюдалось освобождение неорганического сульфата. Дальнейшие исследования показали, что фактор действует на N-сульфатную связь гепарансульфата [1175]. При инкубации in vitro с гепарансульфатом или дерматансульфатом, полученными из фибробластов больного с синдромом Хантера и меченными ³⁵SO₄, корректирующий фактор Хантера также катализирует выделение неорганического сульфата. Ген, детерминирующий мукополисахаридоз формы Хантера, сцеплен с Х-хромосомой, поэтому соответствующий дефект фермента должен отличаться от дефекта при синдроме Санфилиппо А. Поскольку общим свойством обоих гликозаминогликанов является случайное распределение сульфатированных остатков идуроновой кислоты, было выдвинуто предположение, что корректирующий фактор Хантера может быть сульфатазой. Это предположение подтвердилось в опытах с искусственным субстратом.

Другой подход к изучению природы ферментативного блока заключается в определении концевых остатков полисахаридных цепей, которые накапливаются при заболевании. Например, было показано, что при синдроме Хантера концевой остаток накапливающегося дерматансульфата представляет собой сульфатированный остаток идуроновой кислоты. Это хорошо согласовывалось с предположением о дефекте сульфатазы, на что указывали опыты с искусственным субстратом. Был сделан вывод, что в норме гликозаминогликаны расщепляются поэтапно и этот процесс

4. Действие генов 35

 

останавливается, если отсутствует фермент, ответственный за очередной этап. Последовательность моносахаридных остатков в цепи варьирует; такой характер расщепления делает объяснимым тот факт, что накапливающиеся при этих заболеваниях полисахаридные цепи имеют разную длину.

Эти же методы использовали для изучения дефектов других ферментов. Во всех случаях концевые остатки содержали связь, для которой не было соответствующего фермента. Природа ферментативных дефектов позволила объяснить и другое свойство накапливающегося материала: единичное нарушение приводит к накоплению химически неидентичных молекул. Например, у больных с синдромом Хурлера накапливается как дерматансульфат, так и гепарансульфат. Оба соединения содержат остатки a-L-идуроновой кислоты. Поэтому дефект фермента, который строго специфичен в отношении этого остатка, вызывает накопление обоих типов содержащих его полисахаридов.

Обобщенные результаты ряда исследований представлены для хондроитина и дерматансульфата на рис. 4.11, а для гепарансульфата и кератансульфата на рис. 4.12. Указаны ферменты, для которых установлены генетические дефекты, перечисленные в табл. 4.7.

Нарушения ферментов и генетическая гетерогенность. В разд. 3.3.5 на примере мышечной дистрофии продемонстрирован анализ генетической гетерогенности с использованием генетических данных (различных типов наследования), а также клинических данных (возраст начала заболевания, характер проявления, тяжесть симптомов и др.). При изучении мукополисахаридозов такой анализ продемонстрировал выраженную межсемейную вариабельность всех этих показателей, между тем внутри каждой семьи проявления были обычно сходными. Поэтому казалось логичным выделить различные генетические типы, что и было сделано еще до исследования ферментативных нарушений. Интересно, как эта классификация, основанная на косвенных данных по изучению фенотипа, согласуется с прямыми данными, полученными при анализе ферментативных нарушений?

В целом соответствие оказалось вполне удовлетворительным (табл. 4.5 и 4.7). Однако имеются два исключения.

1. Согласно клиническим данным, синдром Санфилиппо следует рассматривать как единое заболевание. Было показано, однако, что он может быть обусловлен четырьмя различными ферментативными дефектами. Такая ситуация характерна для многих дефектов метаболизма. Нарушения различных реакций одного и того же пути часто приводят к одинаковой клинической картине. Например, различные дефекты гликолиза вызывают несфероцитарную гемолитическую анемию (разд. 4.2.2.2).

2. С другой стороны, синдромы Хурлера и Шайе сильно различаются: последний протекает значительно легче. Тем не менее оказалось, что в основе обоих заболеваний нарушение одного и того же фермента. Как объяснить этот факт? Весьма возможно, что данный фермент состоит из нескольких полипептидных цепей. Мутации, вызывающие синдромы Хурлера и Шайе, могут затрагивать различные цепи и детерминировать разный уровень остаточной активности фермента. До сих пор, однако, не найдено никаких различий в остаточной активности a-L-идуронидазы в фибробластах больных с синдромами Хурлера и Шайе. Можно предположить и другие механизмы, исходя, например, из результатов генетического анализа гемоглобинов (разд. 4.3).

Изучение генетической гетерогенности мукополисахаридозов еще не проводилось. Однако нет оснований предполагать, что в этом случае различия между мутациями окажутся менее явными, чем те, которые обнаружены для G6PD. Мутантные аллели, которые несет данный, конкретный больной, страдающий аутосомно-рецессивным заболеванием, могут оказаться идентичными. Так бывает, если родители являются родственниками, например двоюродными, или в генетически изолированных популяциях (разд. 6.4.1). Однако в большинстве других случаев мутации, обнаруживаемые у больного,

36 4. Действие генов

Рис. 4.11, 4.12. Помимо мукополисахаридозов, рассмотренных в тексте, известны и другие дефекты, приводящие к муколипидозам (болезнь Зандхоффа; ганглиозидоз М II). (По Kresse et al., Klin Wochenschr, p. 870/71, 1981). Рис. 4.11. А. Схематическое изображение структуры и катаболизма хондроитинсульфата. Последовательное расщепление начинается с невосстанавливающего конца (слева). Названия болезней, обусловленных потерей активности ферментов, приведены в скобках. GlcUA, глюкуроновая кислота; GalNAc, N-ацетилгалактозамин; S, SO3H. Б. Схематическое изображение структуры и катаболизма дерматансульфата. Детали см. на рис. 4.11. A. IdUA, идуроновая кислота. Рис. 4.12. А. Схематическое изображение структуры и катаболизма гепарансульфата. Детали см. на рис. 4.11. A. GlcN, глюкозамин; GlcNAc, N-ацетилглюкозамин, ldUA, идуроновая кислота. Б. Схематическое изображение структуры и катаболизма кератансульфата. Детали см. на рис. 4.11. A. Gal, галактоза; GlcNAc, N-ацетилглюкозамин.

 

4. Действие генов 37

 

имеют различное происхождение, и поэтому маловероятно, что они идентичны. Если термин «гомозигота» использовать строго для обозначения индивидов с абсолютно идентичными мутациями, многих или даже большинство больных рецессивными заболеваниями следует признать негомозиготными. Их можно назвать «составными гетерозиготами» (рис. 3.12). Описан ряд случаев, по клиническим проявлениям промежуточных между синдромами Хурлера и Шайе [1312]. Было показано, что в фибробластах отсутствует корректирующий фактор Хурлера. Некоторые из таких больных действительно могли быть составными гетерозиготами с аллелями Хурлера и Шайе. Однако по меньшей мере в четырех случаях родители больных были родственниками. Возможно существование и третьего аллеля с промежуточным фенотипическим проявлением, поскольку в семьях, где происходит сегрегация двух различных аллелей, заболевание нельзя объяснить последствиями близкородственных браков.

Дифференциальная диагностика и лечение мукополисахаридозов. Если на основании клинических данных подозревается мукополисахаридоз, предполагаемый диагноз должен быть подтвержден обнаружением в моче избыточных сульфатированных гликозаминогликанов. Для этого в настоящее время разработаны соответствующие методы [1312]. Окончательный диагноз, однако, требует выявления дефектного фермента в культуре фибробластов, в лейкоцитах или, в случае некоторых ферментов, в сыворотке [1029]. Если ген экспрессируется в клетках амниотической жидкости, возможна и пренатальная диагностика (разд. 9.1.1). В этом случае либо измеряют накопление радиоактивных гликозаминогликанов, либо определяют природу дефекта фермента. Однако, поскольку количество амниотических клеток, которые удается культивировать, ограниченно, оказывается возможным определить активность лишь нескольких ферментов. Вот почему пренатальной диагностике должно предшествовать скрупулезное энзимологическое исследование больного сибса. Такой предварительный анализ позволяет измерять в клетках амниотической жидкости активность только того фермента, который оказывается дефектным у этого сибса.

Известно, что при определенных обстоятельствах ферменты могут поглощаться дефектными клетками, что приводит к коррекции дефекта. Этот факт свидетельствует о возможности ферментной терапии. Однако до сих пор не удавалось получить достаточно очищенных ферментов, а переливания больших количеств лейкоцитов или сыворотки приводили лишь к незначительному улучшению, в большинстве же случаев результаты были сомнительными. Поглощение клеткой лизосомного фермента является высокоспецифичным процессом, в котором участвует определенный маркерный участок, распознаваемый в полипептидной молекуле фермента; он может быть разным для разных тканей [1240]. Тем не менее этот подход представляется многообещающим.

Дефект маркера для распознавания лизосомных гидролаз [1242]. В 1967 г. Де Марс и Лерой обнаружили «странные» клетки в культуре фибробластов кожи, взятых у

38 4 Действие генов

больного с предполагаемым синдромом Хурлера. Эти клетки имели плотные включения, выявляемые с помощью фазовоконтрастной микроскопии и содержащие кислую фосфатазу. Заболевание назвали I-клеточной болезнью (от английского inclusion-включение). По клиническому проявлению она напоминает синдром Хурлера, но протекает тяжелее и наследуется как аутосомно-рецессивный признак Оказалось, что фибробласты таких больных дефектны по Р-гексозаминидазе, арилсульфатазе А, β-глюкуронидазе, в то же время в культуральной жидкости перечисленные ферменты присутствуют в повышенной концентрации. Чтобы объяснить этот факт, было высказано предположение, что фибробласты больных имеют дефектную клеточную мембрану, однако впоследствии оказалось, что in vitro лизосомы клеток больных поглощают и накапливают нормальные ферменты с нормальной скоростью. В то же время гидролазы из I-клеток не поглощаются нормальными клетками. Следовательно, изменены сами молекулы этих ферментов. Было установлено, что они лишены маркера, необходимого для распознавания при эндоцитозе, т. е. маннозо-6-фосфата. В норме остатки маннозо-6-фосфата присоединяются к ферменту после завершения его синтеза. Они служат сигналом, позволяющим ферменту связываться с рецептором маннозо-6-фосфата, который обеспечивает транспорт лизосомных ферментов в лизосомы, где происходит их активация. В результате нарушения какого-то фермента, участвующего в процессинге лизосомных ферментов, большинство их при I-клеточной болезни лишены маннозо-6-фосфата. Это приводит к тому, что ферменты из клеток секретируются в плазму, а не транспортируются по рецептор-зависимому пути в лизосомы (рис 4 13). Множественные клинические симптомы I-клеточной болезни можно объяснить одним дефектом процессинга, при котором нарушается присоединение к ферментам маркера - маннозо-6-фосфата.

Поскольку участок узнавания является общим для ряда ферментов, I-клеточная болезнь служит примером патологического состояния, при котором дефект одного гена приводит к недостаточности нескольких ферментов. Подобные множественные эффекты могут иметь и другие причины.

 

Рис. 4.13. Схематическое изображение цикла секреции и обратного поглощения гидролитических ферментов лизосом нормальными и мутантными клетками, растущими в культуре. Специфические рспепторные белки, расположенные на поверхности плазматической мембраны всех трех клеток, позволяют им поглощать и транспортировать в лизосомы гидролитические ферменты. Клетки при синдроме Хурлера не способны синтезировать α-L-идуронидазу однако этот дефект можно скомпенсировать добавлением фермента к среде. В случае I-клеточной болезни присут ствуют все ферменты, однако они лишены маркера, необходимого для их распознавания при поглощении и транспорте в лизосомы.

4 Действие генов 39

4.2.2.4 Одновременные нарушения нескольких ферментов

До сих пор во всех случаях - будь то механизм выработки энергии в эритроцитах или катаболизм гликозаминогликанов - рассматривались примеры, при которых одна мутация приводила к изменению или недостаточности единственного фермента. Все это согласуется с гипотезой «один ген - один фермент». Однако известны случаи, когда одна мутация приводит к изменению двух ферментов. Например, активность одного фермента может нарушаться в результате дефекта другого. Так, активность глюкозо-6-фосфатазы при болезни накопления гликогена III типа (23240) уменьшается в результате нарушения амино-1,6-глюкозидазы - фермента, который расщепляет гликоген в точках ветвления молекулы. Изменение структуры фермента представляется маловероятным, поскольку стероиды, обладающие кортизоно-подобным эффектом, вызывают в таких случаях нормализацию активности глюкозо-6-фосфатазы [1199].

Другие случаи, при которых два фермента изменены структурными мутациями, а у гетерозигот их активность примерно в два раза ниже нормы, не удается объяснить таким способом. Вполне возможно, что указанные ферменты имеют общую субъединицу.

Рис. 4.14. Аминокислоты с разветвленной боковой цепью.

Кетоацидурия, обусловленная дефектом метаболизма аминокислот с разветвленной боковой цепью (болезнь «кленового сиропа») [196]. Известно рецессивное нарушение, которое затрагивает не менее трех функционально родственных ферментов,- болезнь «кленового сиропа». Она вызвана дефектом расщепления аминокислот с разветвленной боковой цепью: лейцина, изолейцина и валина (рис. 4.14). Генетический блок показан на рис. 4.15. При наиболее частой классической форме болезни в течение первой недели после рождения наблю-

Рис. 4.15. Предполагаемая ферментативная система метаболизма аминокислот с разветвленной боковой цепью содержит общий компонент (А). Эта полипептидная цепь может объединяться с тремя различными полипептидами (В, С, D), образуя три фермента (АВ, АС и AD). Мутационное изменение общей субъединицы приводит к генетическому блоку метаболизма сразу трех аминокислот и вызывает кетоацидурию. Известны редкие случаи дефектов полипептидов В и D.

40 4 Действие генов

 

даются затруднение с сосанием, рвота, гипертонус мышц и пронзительные крики. Иногда имеют место потеря тонуса и задержка дыхания (возможно, вследствие гипогликемии). Позже утрачиваются рефлексы, появляются частые припадки, возможна смерть в раннем возрасте. Дети, которые не получали лечения и тем не менее выжили, страдают тяжелой умственной отсталостью [182]. Помимо этого классического типа, описаны «промежуточная», «легкая» и тиамин-зависимая формы болезни.

Анализ генетического блока показал, что активность трансаминаз, которые превращают эти аминокислоты в соответствующие кетокислоты, не изменена (рис. 4.15). Оказалось, что нарушена следующая стадия - окислительное декарбоксилирование. По-видимому, она обеспечивается тремя различными мультиферментными комплексами. Установлено, что эти комплексы имеют один идентичный компонент, который и затрагивает мутация, вызывающая заболевание. При промежуточной форме заболевания наблюдаются периоды атаксии и повышения концентрации аминокислот с разветвленной боковой цепью и соответствующих кетокислот, в особенности при инфекционных заболеваниях. В остальное время показатели крови находятся в пределах нормы, но у больных наблюдаются неврологические отклонения. У одного ребенка при этом заболевании описана остаточная активность фермента, составляющая около 210% нормы. Сходные дефекты описаны в работе [1287].

Другие дефекты метаболизма, при которых нарушена активность нескольких ферментов [196]. Другим примером дефекта метаболизма, при котором один генетический блок затрагивает два фермента в одной и той же цепи реакций, служит оротоацидурия (25890), при которой нарушено образование одного из предшественников РНК, уридина, из оротовой кислоты. На рис. 4.16 показаны два генетических блока. У гетерозигот активность обоих ферментов снижена приблизительно вдвое. Это исключает зависимость активности одного фермента от другого и свидетельствует в пользу участия продукта одного и того же гена в обеих реакциях. По меньшей мере в одном случае было установлено, что у гомозиготы второй фермент - декарбоксилаза - имеет измененную электрофоретическую подвижность, а значит, и структуру. Оказалось, что каждая реакция осуществляется одним из двух независимых доменов макромолекулы, которая представляет собой единую полипептидную цепь [1145]. С другой стороны, показано, что при ганглиозидозе Зандхоффа одновременное нарушение активности гексозаминидаз А и В обусловлено мутацией, изменяющей общую для этих ферментов (3-субъединицу [1286].

Описан ряд случаев одновременной недостаточности факторов свертывания крови II, VII, IX и X, зависимых от витамина К. Они вызваны дефектом посттрансляционной модификации [1111b].

Новый взгляд на гипотезу «один ген - один фермент» (или «один ген - одна полипептидная цепь») [1088]. Как уже отмечалось, дефекты единичных генов человека могут нарушать активность сразу нескольких ферментов, что объясняется наличием у этих ферментов общих субъединиц. Это структурные мутации.

Рис. 4.16. Два генетических блока двух последовательных этапов биосинтеза пиримидинового основания урацила. Оба блока проявляются как оротоацидурия.

4. Действие генов 41

 

Другой важный аспект синтеза ферментов связан с посттрансляционным процессингом. Например, сахарозоизомальтаза построена из двух полипептидных цепей, каждая из которых обладает ферментативной активностью. Эти полипептиды образуются из единого предшественника в результате протеолитического расщепления [1297]. Для образования активного инсулина также необходим процессинг проинсулина.

Весьма убедительные доказательства процессинга пептидов получены для ряда мелких пептидов, синтезирующихся в мозге, - энкефалинов и эндорфинов. В этом случае одна и та же молекула предшественника в результате процессинга может расщепляться на различные пептиды в зависимости от типа клеток или стадии их развития, что может служить одним из механизмов дифференцировки при эмбриональном развитии. На рис. 4.17 показана молекула препродинорфина и ее процессинг с образованием различных типов энкефалинов, эндорфинов и динорфинов. Функции этих белков будут кратко рассмотрены в гл. 8. Подобный посттрансляционный процессинг описан для других гормонов и нейропептидов, синтезирующихся главным образом в гипофизе и гипоталамусе.

Модификации, важные для функционирования молекул, происходят не только на посттрансляционном уровне, но и на уровне экспрессии гена; они могут изменить даже сам ген. Подобная модификация установлена для генов иммуноглобулинов (разд. 4.4). Однако эти факты не умаляют эвристической ценности гипотезы «один ген - один фермент», которая в большинстве случаев верна.

Нарушение работы сразу нескольких ферментов в результате одной мутации может наблюдаться в особых случаях, например если нарушено поглощение, транспорт или связывание кофакторов.

4.2.2.5. Влияние кофакторов на активность ферментов [182]

Кофакторы ферментов. Активность многих ферментов зависит от присутствия молекул небелковой природы - кофакторов. В их роли могут выступать простые ионы, например Mg²⁺, или органические соединения. Если кофактор представляет собой сложное соединение, его называют коферментом. Предшественники коферментов (витамины) потребляются с пищей. Как правило, витамины участвуют во многих ферментативных реакциях, и их недостаток в пище вызывает в организме состояние, называемое авитаминозом.

Ослабление функции кофермента может быть связано и с генетическими дефектами

 

Рис. 4.17.Препродинорфин (белок). Leu-энкефалин: L = Туг, Gly, Gly, Phe, Leu; нео-эндорфин: L + Arg, Lys, Tyr, Pro; нео-эндорфин; L + Arg, Lys, Tyr, Pro + Lys; динорфин 1 -8: L + Arg, Arg, He; динорфин 1–17:L + Arg, Arg, Ile + Arg, Pro, Lys, Leu, Lys, Trp, Asp, Asn, Gln. За сигнальной последовательностью, расположенной на N-конце, следует последовательность, обогащенная остатками цистина. Последовательности нейрогормонов расположены вблизи С-конца; они вырезаются из молекулы препродинорфина. Поскольку молекулы эндорфинов и динорфинов крупнее, чем Leu-энкефалинов, логично предположить, что сплайсинг осуществляется в две (по крайней мере) стадии. На первой стадии образуются более длинные молекулы. Затем они подвергаются процессингу с образованием Leuэнкефалинов. (По Frezal et al., 1983.)

42 4. Действие генов

	Рис. 4.18.Мутации могут нарушать витамин-зависимые реакции на разных этапах, от транспорта витамина в клетку до образования активного фермента [182].
	Рис. 4.19.Фолиевая кислота. Ее молекула состоит (слева направо) из птеринового кольца, β-аминобензойной кислоты и глутаминовой кислоты.

 

поглощения и утилизации витаминов (рис. 4.18). Известно, что витамины всасываются в кишечнике, транспортируются в клетки, где попадают в специфические органеллы. Именно там происходит превращение в кофермент, который в свою очередь должен соединиться с апоферментом с образованием холофермента. Любой из этих этапов может быть нарушен в результате мутации. Механизм поглощения детально изучен для витамина В₁₂ (кобаламина) и фолиевой кислоты; для обоих описаны нарушения транспорта и синтеза кофермента.

Зависимость от фолиевой кислоты (22903, 24930, 22905): нарушение транспорта и синтеза кофермента. Молекула фолиевой кислоты построена из трех компонентов - птеринового кольца, парааминобензойной кислоты и глутаминовой кислоты (рис. 4.19). Фолиевая кислота обычно присутствует в различных продуктах питания в достаточных количествах. Известно пять коферментных форм фолата. Все они участвуют в переносе группировок с одним атомом углерода при синтезе нуклеотидов, метионина, глутаминовой кислоты и серина. Основные этапы поглощения и синтеза витамина следующие

Этап	Фермент
1. Превращение полиглутаминовой кислоты в глутаминовую кислоту	Конъюгирующий фермент (слизистая кишечника, желудок, поджелудочная железа)
2. Поглощение посредством активного транспорта	Двенадцатиперстная кишка и тощая кишка (механизм в точности не известен)
3. Транспорт в ткани
4. Превращение фолата в коферменты: а) восстановление птеринового кольца - образование тетрагидрофолата;
б) образование пяти различных коферментов	Пять различных ферментативных реакций

Тетрагидрофолат (ТГФ) выполняет две различные функции:

1. Он служит акцептором β-углеродного атома серина при его расщеплении до глицина. Этот атом углерода формирует

4. Действие генов 43

 

Таблица 4.8.Врожденные нарушения метаболизма фолиевой кислоты [182]
Локализация нарушения	Природа дефекта	Проявление дефекта	Потребность в фолате in vivo
	концентрация фолата в сыворотке	мегалобластная анемия	нарушение функций ЦНС 1)
Всасывание в кишечнике	Не установлена	Низкая	Наблюдается	Наблюдается	Нормальная
Утилизация в тканях	Недостаточность формиминотрансферазы	Высокая	Не наблюдается	»	Повышена
	Недостаточность циклогидролазы	»	»	»	– 2)
	Недостаточность дигидрофолатредуктазы	Нормальная	Наблюдается	Не наблюдается	Повышена
	Недостаточность N 5, N10-метилтетрагидрофолатредуктазы	От низкой до нормальной	Не наблюдается	Наблюдается	Повышена
1) Включает умственную отсталость, психозы, припадки, отклонения в ЭЭГ, атрофию коры головного мозга. 2) Не определялась

 

метиленовый мостик между 5-м и 10-м атомами азота ТГФ с образованием N⁵,N¹⁰-метил-ТГФ, который восстанавливается до N⁵-метил-ТГФ. 2. ТГФ может превращаться также в N⁵,N¹⁰-метил-ТГФ – предшественник формильной формы кофермента. Формильная и метильная формы кофермента необходимы для ряда реакций переноса группировок с одним атомом углерода при синтезе пуринов, пиримидинов и метионина, а также для циклических превращений производных самой фолиевой кислоты.

Описано по меньшей мере пять наследственных патологических состояний, связанных с недостаточностью транспортных механизмов или механизмов образования коферментов (табл. 4.8). Часть из них характеризуются грубым нарушением функций центральной нервной системы, в том числе умственной отсталостью, в двух случаях наблюдается мегал областная анемия. Общее их свойство заключается в возможности успешного лечения при своевременной постановке диагноза. Например, при нарушении всасывания в кишечнике потребность в фолиевой кислоте не повышена, этот дефект корректируется внутримышечными инъекциями витамина. В трех из четырех известных случаев дефектов ферментов при увеличении количества потребляемой фолиевой кислоты болезнь протекала легче. Однако диагноз был поставлен слишком поздно, поэтому неясно, можно ли предотвратить нарушения центральной нервной системы, если начать лечение достаточно рано.

Вероятно, аномально низкое поглощение или снижение синтеза кофермента оказывают влияние одновременно на многие ферменты, именно на те, для работы которых необходим этот кофермент. С другой стороны, недостаточность на последнем этапе, когда нарушена способность апофермента, связываясь с коферментом, образовывать холофермент, должна приводить к дефекту только одного фермента. Такие нарушения подобны обычным случаям ферментативной недостаточности, рассмотренным ранее.

Зависимость от пиридоксина (витамина В₆) (26610). Молекула витамина В₆ представляет собой замещенное пиридиновое кольцо. Известно несколько природных

44 4. Действие генов

Рис. 4.20.Витамин В6 (пиридоксин).

форм витамина В₆, которые содержатся в самых различных пищевых продуктах (рис. 4.20). Попадая в клетки, предшественники фосфорилируются специфической киназой до пиридоксаль-5'-фосфата или пиридоксамин-5'-фосфата. Эти фосфорилированные производные играют роль коферментов в многочисленных реакциях биосинтеза аминокислот, гликогена, а также жирных кислот с малой длиной цепи. В табл. 4.9 перечислено шесть наследственных патологий, связанных с генетически обусловленной недостаточностью витамина В₆. Во всех этих случаях для биохимического и (или) клинического эффекта требуются дозы витамина В₆, которые превышают физиологические в 5-50 раз.

В первой строке табл. 4.9 описывается патология, впервые обнаруженная у двух сибсов. Они страдали от припадков, которые не удавалось снять противоэпилептическими препаратами. Судороги, однако, проходили при парентеральном введении высоких доз пиридоксина, которые необходимо было поддерживать у таких больных для предупреждения припадков [182].

 

В настоящее время обнаружено большое число подобных случаев. Установлено, что заболевание обусловлено нарушением глутаматдекарбоксилазы.

Аналогичные результаты получены при цистатионинурии и ксантуроацидурии. С другой стороны, в многочисленных случаях гомоцистинурии (23620), вследствие недостаточности цистатионин-синтазы чувствительность к витамину В₆ не удается объяснить мутацией, изменяющей сродство к коферменту. Точный механизм взаимодействия при этом заболевании остается неизвестным [182].

Помимо упомянутых выше, описан ряд случаев, при которых высокие дозы витамина вызывали улучшение клинического и биохимического состояния больных. Дальнейший анализ этой группы заболеваний должен прояснить механизмы связывания коферментов и их действия и представляет поэтому теоретический интерес. Важен он и для медицинской практики, поскольку подобные патологические состояния поддаются лечению высокими дозами витаминов.

Существует мнение, что эта концепция, обоснованная на примере немногочисленных редких врожденных нарушений метаболизма, применима и к ряду широко распространенных заболеваний, в частности к шизофрении. Так, согласно новому направлению в психиатрии, известному под названием «ортомолекулярная психиатрия», шизофрения обусловлена витаминной недостаточностью и положитель-

Таблица 4.9.Врожденные аминоацидопатии с выраженной недостаточностью витамина В6 [182]
Нарушение	Главные клинические симптомы	Поврежденный апофермент
Младенческие судороги	Припадки	Глутаматдекарбоксилаза
Анемия, зависимая от пиридоксина	Мелкоклеточная гипохромная анемия	Не установлен
Цистатионинурия	Вероятно, нет	Цистатионаза
Ксантуроацидурия	Умственная отсталость (?)	Кинурениназа
Гомоцистинурия	Эктопия хрусталика, тромбоз кровеносных сосудов; нарушение функций ЦНС	Цистатионин-синтаза
Гипероксалурия	Отложение в почках кристаллов оксалата кальция; почечная недостаточность	Глиоксилат: а-кетоглутараткарбоксилаза

4. Действие генов 45

 

ного эффекта при лечении можно достичь, вводя высокие дозы никотиновой кислоты. Научное обоснование этого утверждения, в настоящее время практически отсутствует.

4.2.2.6. Сцепленная с Х-хромосомой недостаточность гипоксантин-гуанин—фосфорибозилтрансферазы (30800) [7055]

Дефекты ферментов и их роль в изучении механизмов действия генов. Некоторые дефекты ферментов сыграли заметную роль в изучении самых общих вопросов, касающихся действия генов и возникновения мутаций. Особенно важные результаты были получены при исследовании нарушений метаболизма пуринов, обусловленных недостаточностью гипоксантин-гуанин—фосфорибозилтрансферазы (HPRT) (рис. 4.21) [1294].

Синдром Леша-Найхана [1293]. В 1964 г. Леш и Найхан описали специфический синдром [1198], характеризующийся

 

Рис. 4.21.Известные дефекты метаболизма пуринов у человека. (1) Повышенная активность фосфорибозилпирофосфат —синтетазы у больных с избыточным синтезом мочевой кислоты и подагрой. (2) Почти полная недостаточность гипоксантин-гуанин — фосфорибозилтрансферазы (HPRT) у детей с синдромом Леша—Найхана и частичная недостаточность этого фермента у больных с избыточным синтезом мочевой кислоты при подагре. (3) Недостаточность аденинфосфорибозилтрансферазы (APRT)у больных с камнями в почках. В этом случае камни состоят из 2,8-диоксиаденина (не путать с мочекислыми камнями). (4) Недостаточность ксантиноксидазы у больных ксантонурией, для которых повышен риск образования камней в мочевыводящих путях и, в некоторых случаях, риск миалгии, обусловленной присутствием кристаллов ксантина в мышцах. (5) Недостаточность аденозиндезаминазы, связанная с общей тяжелой иммунной недостаточностью. (6) Недостаточность пуриннуклеозидфосфорилазы, связанная с дефектом Т-лимфоцитов. (7) Активность пурин-5-нуклеозидазы снижена в лимфоцитах больных агаммаглобулинемией, которая может быть вторичной при утрате В-клеток. (8) Недостаточность аденозинкиназы до сих пор наблюдалась только в культурах лимфобластов человека. Соответствующее заболевание еще предстоит идентифицировать. (9) Недостаточность миоаденилатдезаминазы у некоторых больных связана с явлениями слабости и судорогами в мышцах после сильных нагрузок, а также с отсутствием повышения концентрации ионов аммония в венозной крови в ответ на мышечные нагрузки [1294]. Эти дефекты ферментов служат замечательными примерами более, а часто менее характерных фенотипических последствий различных генетических блоков в единой цепи реакций.

46 4. Действие генов

 

атетозом, гиперрефлексией и непременным самодеструктивным поведением, которое может выражаться даже в откусывании губ и пальцев [1164]. У всех пациентов (болеют только мальчики) наблюдается гиперурикемия и повышенная концентрация мочевой кислоты в моче, что приводит к образованию камней в почках и закупорке мочевых путей. Признак сцеплен с полом (разд. 3.1.4). Гетерозиготы клинически здоровы, однако поддаются выявлению.

В 1967 г. Сигмиллер и др. [1295] при обследовании больных с синдромом Леша - Найхана обнаружили практически полную недостаточность одного из ферментов метаболизма пуринов - гипоксантин-гуанин—фосфорибозилтрансферазы (HPRT) (у трех больных - в лизатах эритроцитов, у одного больного - в культуре фибробластов). Впоследствии дефект фермента был выявлен во многих тканях: печени, лейкоцитах и в мозге. Инозин-5'монофосфат образуется в нескольких реакциях, принадлежащих к разным метаболическим путям. Однако клетки могут использовать также готовые пуриновые основания и нуклеозиды, образующиеся при расщеплении нуклеиновых кислот. В этом пути «использования вторичного сырья» свободные пуриновые основания превращаются в соответствующие 5'-мононуклеотиды. Имеются два фермента, один специфичен для гипоксантина, второй для аденина (рис. 4.21). Если первый фермент дефектен, то вторичного использования гипоксантина и гуанина не происходит, вместо этого они превращаются в мочевую кислоту. В результате развивается гиперурикемия с образованием камней в почках; однако остается неясным, чем обусловлены симптомы со стороны ЦНС. Дефекты HPRT удобно изучать в культуре фибробластов, вот почему этот фермент использовали в качестве модели при решении ряда проблем.

Гетерогенность на молекулярном уровне. В разных семьях обычно встречаются различные мутации. Об этом свидетельствуют результаты изучения таких характеристик фермента, как остаточная активность, константа Михаэлиса—Ментен, термолабильность, ингибирование конечными продуктами - GMP и IMP и других. Иногда выраженная недостаточность HPRT имела место и в отсутствие признаков синдрома Леша-Найхана. Дефектная гипоксантингуанин—фосфорибозилтрансфераза была выявлена у некоторых взрослых больных подагрой [1162; 1294]. Однако подавляющее большинство людей, страдающих этим заболеванием, обладают нормальной HPRT. У тех немногих больных подагрой, которые имеют дефектный фермент, этот признак наследуется сцепленно с Х-хромосомой. Это еще раз указывает, что мутации действительно затрагивают один и тот же локус.

Доказательства инактивации Х-хромосомы. Одно из наиболее убедительных доказательств гипотезы Лайон (разд. 2.2.3.3) было получено при изучении активности фермента на уровне отдельных клеток у гетерозигот с мутациями по HPRT [1164]. Более того, эти исследования позволили по-новому взглянуть на метаболические взаимоотношения между клетками.

Метаболическая кооперация. Изучение культуры фибробластов кожи дает возможность идентифицировать гетерозиготных носителей мутации Если получить клоны из отдельных фибробластов и определить активность фермента, измерив с помощью радиоавтографии количество поглощаемого клетками гипоксантина, меченного тритием, то оказывается, что примерно у половины клонов активность HPRT нормальная, а у половины фермент дефектен. Однако в культурах фибробластов, которые получены без клонирования, подавляющее большинство гетерозиготных клеток обладали активностью. Очевидно, при контакте клеток, дефектных по HPRT, с нормальными клетками их метаболический дефект подвергается коррекции [1090]. Этот вывод подтверждается опытами, в которых нормальные и дефектные клетки смешивали в одной культуре. Феномен назвали «метаболической кооперацией».

Рассмотрим три возможных механизма такой кооперации (рис. 4.22).

4 Действие генов 47

Рис. 4.22.Возможные механизмы метаболической кооперации между клетками с активной HPRT и с неактивным ферментом в культуре гетерозиготных клеток

1 Нормальные клетки снабжают дефектные клетки ДНК или мРНК, в результате последние приобретают способность синтезировать функционально активный фермент

2 Дефектные клетки получают от нормальных готовый фермент. В основе этого предположения аналогия с коррекцией дефектов при мукополисахаридозах (разд. 4 2 2 3). Инкубация культуры фибробластов, дефектных по HPRT, с нормальными клетками, разрушенными ультразвуком, приводила к частичному восстановлению функции фермента.

3. Нормальные клетки синтезируют нуклеотид (конечный продукт), который переносится в дефектные клетки Большинство экспериментальных данных свидетельствует в пользу этого механизма. Если дефектные фибробласты отделить от нормальных клеток, их мутантный фенотип быстро восстанавливается, несмотря на то что нормальная гипоксантин-гуанин—фосфорибозилтрансфераза стабильна в этих условиях в течение многих часов. В другом эксперименте лимфоциты нормальной женщины инкубировали в среде, содержащей меченный тритием гипоксантин. Затем такие клетки смешивали в обычной среде с лимфоцитами мужчины, страдающего синдромом Леша—Найхана. Спустя некоторое время Y-хромосомы мужских клеток с дефектным ферментом, окрашивали акрихинипритом, после чего проводили радиоавтографию. В мужских клетках обнаруживалась метка, что указывало на перенос нуклеотидов из нормальных клеток в дефектные В подобных опытах метаболическая кооперация была продемонстрирована также между преинкубированными нормальными эритроцитами и мутантными лимфоцитами или фибробластами. Оказалось, что в дефектные клетки переносится инозимонофосфат или одно из его производных; по-видимому, активную роль в этом процессе играет мембрана клетки [1053].

Другие проблемы, связанные с недостаточностью HPRT. Дефектная HPRTстала важной модельной системой для изучения мутационного процесса. 1. Эта система дает возможность идентифицировать гемизигот и гетерозигот, измеряя активность фермента в фибробластах, и таким образом сравнивать частоты спонтанных мутаций у мужчин и женщин (разд. 5.15). 2 Ген HPRT экспрессируется в клетках амниотической жидкости, поэтому недостаточность гипоксантин-гуанин—фосфорибозилтрансферазы удается диагностировать с помощью амниоцентеза. Этим дефект HPRTв корне отличается от других патологических состояний, наследуемых сцепленно с Х-хромосомой, например гемофилии или мышечной дистрофии Дюшенна, при которых биохимический дефект не проявляется в клетках амниотической жидкости. 3. Разработана система отбора точковых мутаций в культурах фибробластов, основанная на использовании необычного субстрата, 8-азагуанина. Она позволяет изучать на клеточном уровне возникновение спонтанных и индуцированных мутаций. В нормальных клетках 8-азагуанин утилизируется HPRT, что приводит к гибели клеток. Клетки, дефектные по HPRT, не способны метаболизировать это соединение и выживают.

Иммунная недостаточность, связанная с дефектами аденозиндезаминазы и нуклеозидфосфорилазы (рис 4 21) Дефект другого фермента, участ-

48 4. Действие генов

 

вующего в метаболизме нуклеозидов, приводит к иному фенотипу. Этот случай тем более интересен, что дефектной является редкая форма полиморфного фермента. Дефекты одного или нескольких компонентов иммунной системы могут обусловливать повышенную восприимчивость к бактериальным инфекциям. Классическим примером такой патологии является гипогаммаглобулинемия, которая наследуется сцепленно с полом и обусловлена дефектом созревания В-лимфоцитов [1092; 1261]. В-лимфоциты служат местом образования гуморальных антител, и их отсутствие приводит к нарушению синтеза γ-глобулинов. Т-лимфоциты обеспечивают клеточный иммунитет и при этом заболевании остаются интактными.

Различают несколько форм иммунной недостаточности. Одна из них, называемая острой комбинированной обусловливает повышенную восприимчивость к заражению самыми разнообразными бактериями, вирусами и грибами. При этой форме нарушены функции как В-, так и Т-лимфоцитов. Иногда оказываются дефектными только Т-лимфоциты. Оказалось, что в основе таких дефектов лежит нарушение дифференцировки стволовых клеток в зрелые лимфоидные клетки [1274; 1267]. Эта группа заболеваний гетерогенна по этиологии, поскольку известны как случаи с аутосомно-рецессивным наследованием, так и варианты, которые наследуются сцепленно с Х-хромосомой. Среди вариантов с аутосомно-рецессивным наследованием обнаружена дополнительная гетерогенность. Так, комбинированная иммунная недостаточность может быть вызвана дефектом аденозиндезаминазы (24275) или нуклеозидфосфорилазы (16405) [1294].

Аденозиндезаминаза (ADA) катализирует необратимое дезаминирование и гидролиз аденозина до инозина и иона аммония. Нуклеозидфосфорилаза катализирует превращение инозина в гипоксантин и гуанозина в гуанин. Она обладает также небольшой активностью, обеспечивающей превращение аденозина в аденин. Эти ферменты играют ключевую роль в метаболизме РНК и ДНК.

Аденозиндезаминаза кодируется геном, локализованным в 20-й хромосоме (разд. 3.4). Электрофорез в крахмальном геле продемонстрировал полиморфизм этого фермента. Наиболее распространенный аллель обозначается ADA¹ часто встречающийся полиморфный вариант ADA². В западных популяциях аллель ADA² встречается с частотой около 0,05 [1309]. Описаны и другие варианты ADA [1294]. Недостаточность ADA является аутосомно-рецессивным признаком. У больных детей в эритроцитах и других тканях активность аденозиндезаминазы полностью отсутствует [1098]. У их родителей, как правило, обнаруживаются промежуточные количества фермента, при этом клинически они вполне нормальны. У больных родителей выявляется остаточная активность ADA [1294]. Оказалось, что дефекты обусловлены структурными мутациями в гене ADA, которые приводят к почти полной потере функциональной активности фермента у больных гомозигот. Разработана пренатальная диагностика недостаточности аденозиндезаминазы [1126].

Нуклеозидфосфорилаза кодируется локусом в 14-й хромосоме [1096]. Обнаружено несколько редких вариантов фермента [1064]. У больных активность нуклеозидфосфорилазы полностью отсутствует, у родителей активность фермента промежуточная [1294]; заболевание наследуется по аутосомно-рецессивному типу. Иммунологическими методами показано, что по меньшей мере две мутации вызывают недостаточность нуклеозидфосфорилазы [1256]. При одной из них имеется перекрестно реагирующий материал (ПРМ), при другой его нет (см. разд. 4.2.2.2). Предполагается, что это мутации в структурном гене фермента. Вполне возможно, что больные являются не истинными гомозиготами, а составными гетерозиготами с двумя различными мутациями.

Обычно у больных с недостаточностью аденозиндезаминазы сильно нарушена функция В- и Т-лимфоцитов [1294], в то же время при нарушении нуклеозидфосфорилазы функция В-клеток интактна и синтез иммуноглобулинов происходит нормально. При дефекте обоих ферментов наблюдается поразительная дисфункция Т-лимфоцитов. Это проявляется в лимфопении, неспособности лимфоцитов реагировать на митогены и ненормальных кожных реакциях на различные антигены.

Точный биохимический механизм, который приводит к иммунологическим нарушениям в этих случаях, не установлен. Высказ