Какого увеличения частоты спонтанных мутаций, обусловленного химическими мутагенами, следует ожидать?

Химически индуцированные мутации в сравнении с радиационно-индуцированными мутациями. В разд. 5.2.1.5 мы не могли дать четкого ответа на вопрос об увеличении частоты мутаций под воздействием ионизирующей радиации. Ожидаемый порядок величины можно было определить более или менее точно только для структурных аберраций хромосом и (с некоторыми оговорками) для доминантных и Х-спепленных генных мутаций. Эта неопределенность обусловлена главным образом нашим незнанием «базового уровня», т. е. общей частоты спонтанных мутаций у людей. Тот же элемент неопределенности затруднил бы любую попытку получить оценку увеличения частоты мутаций, вызванного химическими мутагенами. Однако в отличие от ситуации в радиационной генетике здесь не хватает также и другой, довольно существенной информации. Мы очень мало знаем о том, какова в действительности величина популяций, подвергающихся воздействию известных мутагенов. Наши знания о механизмах действия многих из этих соединений фрагментарны. Мы не имеем точных представлений о чувствительности разных клеточных стадий, о мутациях, индуцируемых в половых и в соматических клетках, об индукции геномных, хромосомных и генных мутаций и о соответствующей фармакокинетике. Для громадного числа соединений, воздействию которых подвергаются люди, неизвестно, мутагенны ли они для млекопитающих. Риск несколько выше, когда мутагенность вещества доказана на других организмах, например на бактериях, бактериофагах, грибах или Drosophila. Однако, как показал случай с кофеином, даже обнаружение хромосомных разрывов в культурах лимфоцитов человека не является доказательством мутагенной активности соединения в живом организме. Для многих веществ пока недостает достаточно удовлетворительных исследований in vivo на тест-системах с использованием млекопитающих.

По образному сравнению Грюнеберга [1470], риск, обусловленный радиацией, напоминает риск, которому мы подвергаемся, переходя улицу в потоке автомобильного транспорта: можно приближенно оценить повышенную частоту и в какой-то степени принять адекватные меры предосторожности. С другой стороны, риск, обусловленный химическими мутагенами, напоминает риск, сопряженный с ночной прогулкой в джунглях. Треск в нижнем ярусе тропического леса и таинственные звуки, возможно, сигнализируют о неизвестных скрытых опасностях.

5 Мутации 273

Мониторинг человеческих популяций с целью обнаружения повышенных мутационных частот. Возникает весьма заманчивая идея: не организовать ли мониторинг больших популяций для поиска мутаций de novo? Мы сумели бы непосредственно наблюдать любое увеличение генных частот и могли бы попытаться связать его с радиацией, химическими мутагенами или другими возможными факторами.

Существуют различные возможные варианты отбора признаков, которые будут выявляться в ходе такого мониторинга. Можно, например, проводить скрининг на некоторые «сторожевые» мутации - доминантные мутации, дающие специфические фенотипы, для которых довольно хорошо известны частоты спонтанных мутаций (табл. 5.8). Однако число индивидов, которых необходимо обследовать, составляет несколько миллионов; мутации, приводящие к специфическому фенотипу, редки и их выявление вызывает трудности, связанные с диагностикой. Необходима высококвалифицированная медицинская экспертиза, чтобы исключить фенокопии. Хотя у нас есть возможность получить надежную оценку порядка величины частоты мутаций, получение достоверной оценки ее увеличения представляет большие трудности. Возможная альтернатива заключается в проведении скрининга на геномные и хромосомные мутации. Технически такая задача была бы намного проще, поскольку мутации указанных типов встречаются чаще, но этот подход не дает информации о генных мутациях.

Наиболее подходящий, но в то же время наиболее сложный в методическом плане подход - исследование популяционных выборок, в ходе которого идентифицируют генетически детерминированные варианты белков и ферментов крови и для каждого редкого варианта выясняют, получен ли он от одного из родителей (что обычно бывает) или представляет собой мутацию de novo [1577; 1578]. Мы только должны быть уверены в том, что изучаем редкие варианты, и не включать в анализ многочисленные, часто встречающиеся полиморфные варианты.

Исследования такого рода сопряжены с многими проблемами. Самые важные из них - статистические. Частоты спонтанных мутаций на уровне белков очень низки (разд. 5.1.4). Поэтому для достоверного обнаружения ощутимого увеличения частоты мутаций необходимы выборки больших размеров [1652; 1672; 1679].

Вопрос можно поставить так: насколько точно можно оценить истинное соотношение (t)

между мутационными частотами в двух популяциях или временных периодах из наблюдаемого соотношения (t)

если х_х и х₂ наблюдаемые численности мутантов de novo в двух популяциях? Можно показать, что t' с вероятностью Р = 0,95 заключено в определенных пределах, зависящих от фактического соотношения t.

где х_1,2 размер выборки, состоящей из двух объединенных выборок х₁ и х₂. На рис. 5.57 показаны доверительные интервалы для наблюдаемого соотношения t' (ордината), зависящие от совместного объема обеих выборок и фактического соотношения (абсцисса). Например, если фактическое соотношение t равно 1,3, т.е. если частота мутации во второй выборке в 1,3 раза больше частоты мутации в первой выборке, то для обнаружения увеличения требуется 500 мутантов de novo и в этом случае наблюдаемое соотношение t’ было бы с 95%-ной вероятностью заключено между ~ 1,08 и ~ 1,52. Эти цифры следует сравнить с частотами спонтанных мутаций у человека, а именно с частотами возможных «сторожевых» мутаций человека (разд. 5.1.3, табл. 5.8), хромосомных и геномных мутаций (разд. 5.1.2, табл. 5.3), чтобы получить некоторое представление об истинном объеме проблемы. Коекакими данными мы располагаем. Среди 133 478 аллелей многих индивидов, изучавшихся в Гальтоновской лаборатории (Лондон), было найдено 77 редких биохимических вариантов, и каждый из этих биохимических вариантов, как выяснилось, был получен пробандом от одного из его родителей. Ни одной мутации de novo не обнаружено. Эти данные позволяют вычислить максимальную частоту мутаций для упомянутых биохимических вариантов, которая оказалась равной 2,24 х 10^–5 на ген на поколение [1788].

274 5. Мутации

Рис. 5.57. Доверительные интервалы (Р = 0,95) для наблюдаемого соотношения между двумя мутационными частотами (t', ордината), зависящие от фактического соотношения (t, абсцисса) и размеров выборки, состоящей из двух объединенных выборок x1 и х2 (х1 2 ).

Геномные и хромосомные мутации часто происходят спонтанно. Для обнаружения значимого увеличения частоты мутаций в случае обычных доминантных генетических заболеваний необходимо на протяжении десятилетий проводить поголовный скрининг популяций больших стран. В случае мутаций, идентифицируемых на белковом уровне, большая и в высшей степени хорошо организованная программа будет успешной, если соответствующим образом увеличить число генов, проходящих скринирование [1577; 1575]. Предложено два различных подхода. В первом [1574; 1575] используют образцы пуповинной крови, отобранные из плаценты (детского места) сразу после родов. Одновременно производят отбор проб крови у обоих родителей. В этих образцах исследуют максимально возможное число систем электрофоретического полиморфизма и количественно оценивают активность некоторых ферментов. Такая программа нуждается в специальной организации для обеспечения взаимодействия с родителями и сбора крови. Вот почему данный метод может быть использован во всех ситуациях, когда относительно небольшие популяции подвергаются потенциально высокому риску и надо получить максимальное количество информации от небольшого числа индивидов. Однако при продолжительном мониторинге популяций, состоящих из миллионов людей, такие программы неосуществимы. В этом случае следует выяснить, нет ли подходящих биологических образцов, которые были собраны для других целей, но могут быть также использованы для мониторинга мутаций. Как отмечалось в разд. 4.2.2.7, новорожденные скринируются на фенилкетонурию (ФКУ) и другие наследственные болезни метаболизма. В случае ФКУ обычно применяют тест Гутри: анализируют пятна крови, высушенные на бумаге. Эти пятна можно проверять на варианты гемоглобина [1679] и на большое число других генных продуктов [1373]. Метод быстрый и дешевый, удобный не только методически, но и с точки зрения его материального обеспечения. Например, образцы нумеруются только во время проведения анализов; имена и адреса в тех немногих случаях, где был найден редкий вариант и требовалось провести исследование родителей (чтобы выяснить, не несет ли один из них этот вариант, нет ли здесь ложного отцовства и действительно ли этот вариант представляет собой мутацию de novo), можно легко восстановить по регистрационным книгам, в которых фиксируются результаты скрининга на ФКУ. Как отмечалось в разд. 5.1.4, в одном таком побочном исследовании, охватившем 25 000 новорожденных, была обнаружена одна новая мутация Нbα. Прежде чем приступать к осуществлению этой программы в рамках широкомасштабного популяционного мониторинга, необходимо организовать такое взаимодействие внутри научного сообщества, чтобы каждый вариант, который может быть мутантом de novo, прошел тщательную проверку (включая проверку ложного отцовства) в лаборатории, имеющей опыт работы в области биохимической генетики человека. Особое внимание следует уделить проблеме отцовства. В западных странах ложное отцовство повсеместно регистри-

5 Мутации 275

руется в небольшой части посемейных исследований, проводимых в рамках других программ. Мутации встречаются гораздо реже, чем ложное отцовство. Однако с увеличением числа систем генетического полиморфизма ложное отцовство может регистрироваться чаще. В конце концов человеческое общество будет располагать информацией о мутационных частотах и их изменениях с изменением условий окружающей, а также генетической среды. Статистические проблемы, связанные с регистрацией факта увеличения частоты мутаций просты, однако и здесь были предложены соответствующие методы [1561]. Важно помнить, что, даже если увеличение частоты мутаций выявлено, задача найти агент или агенты, которые вызвали это увеличение, оказывается крайне трудной.

Отношение современной общественности к тестированию на мутагенность. В настоящее время мало что делается для получения оценок риска, вызванного химическими мутагенами. Существует однако растущая осведомленность, что химические вещества, еще ждущие практического применения, например фармацевтические препараты или пестициды, должны тестироваться на мутагенность. Эта проблема выглядит сложнее в случае химических веществ, уже используемых в течение длительного времени, однако проверка по крайней мере наиболее важных из этих соединений начала проводиться. Следовательно, имеется согласие в том, что химические вещества должны проверяться на мутагенность. Путаница возникает в связи с вопросом о том, как их надо проверять. Изложенные выше принципы, хотя фактически и не оспариваются, далеки от того, чтобы быть принятыми научным сообществом. Кроме того, принцип минимальной экстраполяции требует применения тест-систем in vivo с использованием млекопитающих. Такие системы имеются для всех типов мутаций, происходящих в половых клетках и для большинства соматических мутаций, но они обычно требуют больших затрат времени и больших навыков, чем методы с использованием простых тестерных организмов вроде бактерий, плодовых мушек или культур лимфоцитов. Поэтому для лиц, делающих политику, было всегда соблазнительно прибегать к следующему аргументу. Поскольку генетики расходятся в своих рекомендациях и поскольку существует корреляция по индукции мутаций даже между самыми отдаленными в филогенетическом смысле видами, нет необходимости применять дорогие системы in vivo с использованием млекопитающих; вполне достаточны простые системы, которые и дешевле, и требуют меньше времени. Часто упускают из виду: что такая политика оставляет без ответа все важные вопросы, касающиеся фазоспецифичности, типа мутаций и большинства фармакокинетических и фармакогенетических проблем, даже если используются микросомы печени, проявляющие изменчивость метаболизма. Более того, различия, обычно обнаруживаемые даже между разными «простыми» системами, делают более чем вероятным то, что многие мутагены останутся невыявленными, даже если работать по следующей схеме:

1) проверить большое число соединений в какой-либо простой системе;

2) отобрать те из них, которые проявляют мутагенность, и проанализировать в «подходящей» системе in vivo с использованием млекопитающих.

Конечно, масштаб проблемы принуждает к компромиссам, и первый шаг, на котором производится быстрое тестирование большого числа веществ (например, на микробных тест-системах с использованием микросом печени млекопитающих), в некоторых случаях может быть неизбежным. Однако не следует упускать из виду возможности получения «ложноотрицательного» результата. Соединения, подозреваемые на мутагенность из-за химического состава или вещества, используемые большим числом индивидов репродуктивного возраста, должны проходить проверку на более адекватных системах, даже если скринирующие системы дали отрицательные результаты.

В настоящее время во многих странах в правительственных организациях, среди ученых, в химических и фармацевтических компаниях ведутся дискуссии относительно выбора стратегии проверки на мутагенность.

276 5. Мутации

Медицинское и социальное значение мутаций различных типов. Для получения полной оценки влияния мутаций на человека необходим анализ типов болезней, обусловленных разными видами мутаций. Все аутосомные трисомии, кроме трисомии по 21-й хромосоме, детальны в раннем детстве; фактически большинство из них абортируется в первом триместре беременности. Наибольшее медицинское значение имеет поэтому синдром Дауна, встречающийся с частотой 1-2/1000. Эти больные страдают глубокой умственной отсталостью и требуют ухода дома или в специальных учреждениях. К гораздо менее тяжким медицинским и социальным последствиям приводят спонтанные выкидыши в результате возникновения хромосомных аномалий или летальных генов. Намного чаще встречаются анеуплоидии по Х-хромосоме. Их общее значение для общества определяется главным образом наличием пациентов с кариотипом XXY (синдромом Клайнфельтера), встречающихся с частотой 1/1000 новорожденных мальчиков. Средний интеллект таких мужчин несколько ниже среднего интеллекта контрольной популяции. Они характеризуются несколько повышенной социопатией и, как правило, бесплодием (раздел 2.2.3.2). Эта трисомия доставляет мало хлопот медицине, ее основное влияние сказывается в личностной и социальной сферах, что труднее оценить количественно. Женские плоды ХО обычно абортируются. Если они выживают после рождения, личностные и медицинские проблемы связаны с уменьшенным ростом и бесплодием. Трисомия XXX не имеет явных клинических последствий, но иногда ассоциируется с умственной отсталостью.

Хромосомные мутации, например делеции и транслокации, обычно, если они несбалансированы, приводят к ранней гибели плода. Немногие субъекты с такими мутациями, выживающие после рождения, имеют серьезные пороки развития и требуют постоянного медицинского ухода, но большинство из них гибнет в начале своей жизни.

Общее влияние точковых мутаций оценить труднее. Существует множество аутосомно-доминантных и Х-сцепленных болезней, поддерживаемых в популяции явно в результате мутационного равновесия (разд. 5.1.3). Однако общая частота всех этих болезней составляет около 1%. Многие из них, как, например, хорея Гентингтона, передаются по наследству; соответствующих новых мутаций обнаружено очень немного или совсем не найдено. При других формах, таких как ахондроплазия, 80% всех случаев составляют мутации de novo. Увеличение частоты мутаций привело бы к существенному увеличению числа больных заболеваниями этой группы, в которой в настоящее время большинство больных представлено носителями новых мутаций. Определенная группа доминантных патологий, таких как семейная гиперхолестеринемия и, по-видимому, семейная гипертриглицеридемия, а также комбинированная гиперлипидемия [1109], довольно обычны. Маловероятно, что эти заболевания поддерживаются мутационным равновесием, ведущее значение в поддержании относительно высоких их частот, по-видимому, имеют факторы отбора. Поэтому мутации de novo оказывают слабое влияние на их частоту.

Новые мутации в случае аутосомно-рецессивных болезней обычно проявляются лишь в гомозиготном состоянии. Врачи их сумеют обнаружить только в потомстве от брака двух гетерозигот, т.е. влияние этой болезни на популяцию будет отсрочено на много поколений.

Группа мультифакториальных заболеваний включает многие врожденные дефекты, часто встречающиеся болезни среднего возраста, распространенные психозы (шизофрению и аффективные расстройства) и многие случаи умственной отсталости. Общее медицинское и социальное значение этих заболеваний намного выше, чем наследственных болезней в строгом смысле слова. Оценка влияния мутации зависит от генетической модели, отражающей наследственную обусловленность этих заболеваний. Если лежащий в их основе генетический механизм базируется на полиморфной генной изменчивости, примеры которой дают системы HLA и АВО (разд. 3.7), мутации будут малоэффективны, потому

5. Мутации 277

что основной фактор, влияющий на полиморфные системы, - это отбор, а не мутационный процесс (разд. 6.2.1). Если эти патологии обусловлены действием нескольких редких мутантных генов или немногих главных генов, мутации имеют значительный эффект. При почти полном отсутствии точных знаний относительно природы большинства генетических систем, лежащих в основе распространенных заболеваний, мы не можем предсказать эффект повышения частоты мутаций.

Возможно, это приведет к широкому распространению заболеваний, которые медицинские генетики обычно не считают наследственными. Необходимы обстоятельные исследования, чтобы выяснить конкретный вклад генетических факторов в эти заболевания.