рефераты конспекты курсовые дипломные лекции шпоры

Реферат Курсовая Конспект

Экспрессия генетического материала в трансгенных растениях

Экспрессия генетического материала в трансгенных растениях - раздел Биотехнологии, Лекция Генетическая Инженерия.   ...

Лекция

Генетическая инженерия.

 

Генетическую инженерию можно трактовать как искусство использовать знание основ и методов молекулярной генетики и молекулярной биологии для конструирования организмов с заданными наследственными свойствами.

Генная инженерия методами in vivo или in vitro решает задачи введения в геном реципиентной клетки одного или нескольких (обычно чужеродных) генов либо создания в геноме новых типов регуляторных связей. В таких случаях видовая принадлежность реципиентных организмов не меняется, но появляются несвойственные им признаки.

Своими успехами генетическая инженерия растений обязана в первую очередь достижениям клеточной инженерии в разработке методов регенерации целых растений из единичных дифференцированных клеток или протопластов. Второй слагающей успеха явилось использование природной системы трансформации растений Ti-плазмидами Agrobacterium tumefaciens и создания на их базе векторов, способных интегрироваться в растительные хромосомы. Это дало возможность вводить в клетки растений чужеродные гены и получать из единственной клетки сформированные растения. Такие организмы, в которых чужеродные гены обнаруживаются во всех его клетках, включая половые, называются трансгенными. Они обладают свойством передавать приобретённые или новые признаки своему потомству.

1. Введение генов в растительные клетки. Векторы.

Ввести чужеродную ДНК в растения можно различными способами.

Для двудольных растений существует естественный вектор для горизонтального переноса генов: плазмиды агробактерий. Что касается однодольных, то, хотя в последние годы достигнуты определенные успехи в их трансформации агробактериальными векторами, все же подобный путь трансформации встречает существенные затруднения.

Для трансформации устойчивых ("рекальцитрантных") к агробактериям растений разработаны приемы прямого физического переноса ДНК в клетку, многие из которых взяты из практики работы с клетками бактерий или животных. Эти методы достаточно разнообразны, они включают: бомбардировку микрочастицами или баллистический метод; электропорацию; обработку полиэтиленгликолем; перенос ДНК в составе липосом и др.

Наиболее продуктивным и чаще всего используемым является метод бомбардировки микрочастицами. При достаточной скорости эти частицы могут непосредственно проникать в ядро, что сильно повышает эффективность трансформации. Этим же методом можно, впрочем, трансформировать и другие ДНК-содержащие клеточные органеллы - хлоропласты и митохондрии.

После проведения тем или иным способом трансформации растительной ткани ее помещают in vitro на специальную среду с фитогормонами, способствующую размножению клеток. Среда обычно содержит селективный агент, в отношении которого трансгенные, но не контрольные клетки приобретают устойчивость. Регенерация чаще всего проходит через стадию каллуса, после чего при правильном подборе сред начинается органогенез (побегообразование). Сформированные побеги переносят на среду укоренения, часто также содержащую селективный агент для более строгого отбора трансгенных особей.

Экспрессия генетического материала в трансгенных растениях

При изучении экспрессии чужеродных генов в растительных клетках исследователи столкнулись с рядом новых явлений. Выяснилось, что трансформированные идентичной конструкцией ДНК трансгенные клоны, полученные параллельно в одном и том же опыте, значительно различаются по уровню экспрессии введенного гена. Показано, что уровень экспрессии зависит от многих факторов и в значительной мере от того в какую область ядерного хроматина попал введенный ген.

Экспрессия трансгена, как правило высока при его попадании в область активного хроматина. Кроме того, оказалось, что при встраивании в ядерный геном конструкция ДНК нередко претерпевает существенные изменения (перестройки, дупликации, инверсии и т.д.), что также приводит в основном к снижению экспрессии.

Было установлено также, что обычно применяемые процедуры трансформации вовсе не безразличны и для хозяйского генома.

Во-первых, встраивание трансгена может нарушить первичную структуру какого-либо хозяйского гена и тем самым вызвать его инактивацию. Это событие, по-видимому, не так редко, особенно с учетом того, что трансгены чаще встраиваются в транскрибируемые области хроматина (эухроматин). В последующих поколениях такой инактивированный ген может перейти в гомозиготное состояние, выражаясь в непредусмотренной и обычно нежелательной фенотипической мутации.

Во-вторых, при агробактериальном или физическом переносе генов в растительный геном в последнем нередко отмечаются разного рода перестройки, вплоть до транслокации фрагментов хромосом. Все это также может менять нормальное функционирование генома растения.

Еще одна важная проблема, которая открылась благодаря генетической инженерии растений - это проблема замолкания генов. Было обнаружено, что у достаточно заметной доли трансгенных растений интродуцированный ген через какое-то время теряет свою активность, хотя физически сохраняется в геноме. Таким образом, было установлено, что растение обладает способностью активно противостоять экспрессии чужеродной ДНК.

Проблема замолкания генов имеет большое практическое значение, так как у генетически трансформированных сельскохозяйственных культур трансгены должны функционировать стабильно. За последние годы удалось выяснить механизмы и некоторые условия, способствующие замолканию генов. Одним из основных факторов является число идентичных копий гена, встроенных в геном: чем больше таких копий и чем они протяженнее, тем больше вероятность замолкания генов. Откуда следуют практические рекомендации генным инженерам: трансгенные культуры должны содержать не более одного встроенного гена на гаплоидный геном; сигнальные части трансгена (промоторы, терминаторы и др.) не должны иметь длинных гомологии (более 100-300 п.о. ДНК) с участками хозяйского генома; фрагменты векторной плазмидной или вирусной ДНК должны быть по возможности полностью удалены из конструкции перед трансформацией.

Введение ДНК в клетки растений с помощью Ti- и Ri-плазмид

Аgrobacterium tumefaciens вызывает образование опухолей стебля двудольных растений - так называемых корончатых галлов. Бактерии прикрепляются к клетками растения в местах повреждений. Как только бактерии прикрепились к поверхности клеток растения, они начинают образовывать целлюлозные фибриллы. Фибриллы формируют сеть, покрывающую поверхность растительных клеток. Фибриллы служат более прочному закреплению бактерий на поверхности хозяина. За целлюлозные фибриллы могут зацепиться свободно плавающие клетки бактерий. Фиксируя их у поверхности растения, фибриллы увеличивают множественность заражения. В результате размножения образуются скопления бактерий на поверхности растения.

Клеточная стенка растения повреждается вследствие выделения бактериями пектолитических ферментов, что обеспечивает плотный контакт бактерий с плазмалеммой растительной клетки. Этот контакт необходим для передачи ДНК от бактерий в растительную клетку. Передача ДНК происходит без нарушения целостности мембраны растительной клетки, но требует определенного её состояния - компетентности.

Способность А. tumefaciens индуцировать у растений образование опухолей типа "корончатого галла" коррелирует с наличием у них Ті-плазмиды. Опухолевая трансформация проявляется в гипертрофии возникающей после проникновения агробактерий в пораненные участки (сайты) растений (рис. 47). Трансформация является результатом стабильного ковалентного включения (инсерции или интеграции) сегмента Т-ДНК большой плазмиды бактерий в ядерную ДНК растительной клетки.

Другой вид агробактерий - А. rhizogenes, - вызывает заболевание, именуемое "бородатый корень", при котором в зоне повреждения корня образуется масса новых корешков.

В отличие от большинства тканей взятых из нормальных растений, трансформированные ткани в культуре в асептических (стерильных) условиях способны неограниченно расти в отсутствие экзогенно добавленных ауксинов и цитокининов. Кроме того, трансформированные ткани часто синтезируют одну или более групп соединений, названных опинами, которые обычно не обнаруживаются в нетрансформированных растительных тканях.

Наиболее подробно изучены опухоли — корончатые галлы, индуцируемые А. tumefaciens. Они представляют собой истинно злокачественные опухоли, которые могут расти в культуральной среде в отсутствие стимуляторов роста — фитогормонов, необходимых для роста нормальных тканей.

В природных условиях корончатые галлы образуются в месте соединения корня со стеблем (у корневой шейки), откуда и произошло их название корончатый галл. Однако корончатые галлы могут развиваться и на подземных частях растения, например на корнях плодовых деревьев, и на надземных, например на стебле винограда.

В лаборатории эти заболевания можно вызвать у здоровых растений экспериментально, путем инфицирования их бактериями. Растения перед инокуляцией должны быть поранены, при этом опухоли возникают в поврежденных сайтах растения, обычно на стебле или листьях растения. Кроме целых растений в качестве тест-объектов используются экспланты, например ломтики моркови и кусочки других органов растений.

Аgrobacterium имеет очень широкий круг растений-хозяев и может инфицировать практически все двудольные растения. Долгое время считалось, что однодольные растения не чувствительны к агробактериальной инфекции. В настоящее время показано, что при соблюдении определенных условий агробактерий могут инфицировать однодольные растения.

Размер Тi–плазмид 140 – 250 000 полинуклеотидов. В процессе инфекции фрагмент этих плазмид размером около 25 000 полинуклеотидов, называемый Т-ДНК, переносится в растительные клетки и ковалентно связывается с ядерной ДНК. Трансформированные Тi–плазмидами клетки становятся опухолевыми и образуют корончатые галлы. Ткани корончатых галлов содержат более высокие уровни ауксина и цитокининов. Кроме неконтролируемого роста трансформированных растительных клеток, отмечено появление необычных аминокислот, – октопина, нопалина и других опинов. Октопин состоит из аргинина и пировиноградной кислоты, а нопалин представляет собой соединение аргинина и α-кетоглутаровой кислоты. Эти аминокислоты могут использоваться бактериями A. tumefaciens в качестве источника углерода, азота и энергии. В зависимости от типа индуцируемого в опухоли опина штаммы агробактерий и находящиеся в них Ті-плазмиды получили соответствующее обозначение — октопиновые или нопалиновые.

 

Подробная информация о структуре плазмид Аgrobacterium получена путем их рестрикционного или физического картирования. В результате исследований обнаружено четыре основных области гомологии между октопиновой и нопалиновой плазмидами. Две консервативные (области А и D) вовлечены в онкогенность, еще одна (В) соответствует области контроля репликации плазмиды, в то время как последняя (С) кодирует функции конъюгативного переноса (рис.).

Таким образом, кроме Т-ДНК в плазмидах имеются область, кодирующая функцию конъюгации (Тга), область репликации (Оri V) и область вирулентности (Vir). Последовательности Тi-плазмиды, фланкирующие Т-ДНК (пограничные или концевые области), играют важную роль в интеграции в растительный геном и содержат несовершенные прямые повторы по 24—25 п. н. Делеция левой границы Т-ДНК не влияет на опухолеобразование, но удаление правой пограничной области приводит практически к полной утрате вирулентности. Показано, что делеция правого повтора или его части приводит к потере способности Т-ДНК включаться в растительную ДНК.

Учитывая важную роль концов Т-области в переносе Т-ДНК, можно предположить, что любой сегмент ДНК, встроенный между этими концами, может быть перенесен в растения как часть Т-ДНК. Плазмиды модифицируют таким образом, чтобы удалить все онкогенные последовательности, так как они не принимают участие ни в переносе, ни в интеграции в геном клетки-хозяина. На место этих генов можно встроить чужеродную ДНК, а плазмида теряет свои онкогенные свойства.

Разработаны два метода для введения Ti -плазмидных последовательностей, содержащих нужный ген, в растение.

Первый метод — метод «промежуточных векторов» (коинтегративных векторов) — основан на использовании плазмиды кишечной палочки рВR 322 (рис.).

Т-ДНК вырезают из Тi-плазмиды с помощью рестриктаз и встраивают в плазмиду рВR322 для клонирования в Е. соli. Бактерии, содержащие плазмиду с Т-ДНК, размножают, после чего эту плазмиду выделяют. Затем в клонированную Т-ДНК с использованием рестриктаз встраивают нужный ген. Эту рекомбинантную молекулу, содержащую Т-ДНК со встроенным в нее геном, снова размножают в большом количестве, то есть клонируют в кишечной палочке. Затем с помощью конъюгации вводят в клетки агробактерии, несущие полную Тi-плазмиду.

Между Т-сегментами нативной Тi-плазмиды и промежуточного вектора происходит гомологичная рекомбинация. В результате этого Т-ДНК со встроенным геном включается в нативную Тi-плазмиду, замещая нормальную ДНК. Получаются клетки Аgrobacterium, несущие Тi-плазмиды со встроенными в Т-сегмент нужными генами. Далее их перенос в клетки растения осуществляется обычным способом, характерным для агробактерии.

Второй метод основан на создании системы бинарных (двойных) векторов.

Последние исследования показали, что для заражения и трансформации не нужна целая Тi-плазмида, а достаточны только пограничные области Т-ДНК и один участок Тi-плазмиды, ответственный за вирулентность. Причем эти два участка ДНК не обязательно должны находиться в одной и той же плазмиде. Если клетки агробактерий содержат Тi-плазмиду с сегментом Vir и другую плазмиду с Т-ДНК, эти бактерии могут трансформировать клетки растений. При этом Т-ДНК с любыми встроенными в нее генами интегрирует с геномом растения, для этого не нужна гомологичная рекомбинация в бактериальных клетках. Для осуществления экспрессии чужеродных генов, нужен специфический промотор из Т-ДНК, например, промотор нопалинсинтетазы.

Эффективность трансформации с помощью модифицированной Т-ДНК агробактерий превосходит на сегодняшний день все другие способы переноса генов в растение.

Для введения сконструированных Тi-плазмид в растительную клетку может быть использовано несколько методов. Наиболее простой из них природный способ — это инокуляция сконструированных штаммов в поврежденные (пораненные) области растения.

Другой метод состоит в трансформации протопластов путем кокультивирования их с агробактериями Протопласты представляют собой голые клетки, окружённые цитоплазматической мембраной. Отсутствие клеточной стенки делает возможным поглощение протопластами органелл, микроорганизмов и чужеродного генетического материала. Протопласты выделяют чаще всего из мезофильных клеток молодых листьев или из суспензионной клеточной культуры. Препараты отдельных клеток получают механическим путём. Фрагменты листьев измельчают в стеклянном гомогенизаторе, разрушая ткань до отдельных клеток. Затем обрабатывают пектиназами для удаления межклеточных связей, а затем целлюлазами для удаления самой клеточной стенки. После этого их можно поместить на плотные среды, где через 5-10 дней происходит регенерация клеточной стенки и начинается деление клеток. Методика кокультивации может рассматриваться как индукция опухолей в искусственных условиях: вирулентные агробактерий временно совместно культивируются с протопластами. Если агробактерий добавляются к свежевыделенным или однодневным протопластам, не наблюдается ни присоединения бактерий, ни трансформации. Существенным условием для трансформации является наличие вновь образуемых клеточных стенок у 3-дневных протопластов. Это подтверждается применением ингибиторов образования клеточной стенки, которые ингибируют и присоединение бактерий. После периода кокультивации (более суток), в течение которого наступает агрегация протопластов с бактериями, свободные бактерии удаляются повторным отмыванием. Далее растительные клетки культивируются на среде с добавлением гормонов, а через 3—4 недели небольшие колонии высеваются на безгормональную среду. На этой среде выживают только колонии трансформированных клеток.

Так были получены трансформированные растения-регенеранты табака и петунии. Этот метод дает возможность существенно расширить круг хозяев агробактерий, включая виды семейства злаковых.

Выделение генов

Существуют несколько способов решения: Химический синтез гена. Возможен при наличии подробной информации о нуклеотидной последовательности…  

Маркеры.

Регулируемые извне индуцибельные промоторы, контролирующие соответствующие гены, могут способствовать одновременному прохождению растениями основных… В случае использования неонкогенной Т-ДНК необходимы маркеры трансформирования… Регуляторные сайты идентифицируют также с помощью присоединяемых к ним генов-репортеров. Так называют гены, чьи…

Достижения генной инженерии растений

После прохождения всех необходимых тестов на токсичность, аллергенность, мутагенность и т.д. первые трансгенные продукты появились в продаже в США в… В США генетически модифицированные растения составляют сейчас около 50%… Первая волна трансгенных растений, допущенных для практического применения, содержала дополнительные гены устойчивости…

Улучшение качества запасных белков

Ген, кодирующий запасной белок кукурузы - зеин, после интеграции его в Т-ДНК был перенесен в геном подсолнечника, однако присутствие зеинового белка… Более реальной задачей для генетической инженерии считается улучшение… В другом эксперименте удалось после скрещивания трансгенных растений, в одном из которых был встроен ген…

Жиры

Получены трансгенных растения рапса с измененным составом растительного масла, включающего вместе с обычными 16- и 18-членными жирными кислотами также и до 45% 12-членной жирной кислоты - лаурата. Это вещество широко используется для производства стиральных порошков, шампуней, косметики.

Из других проектов, связанных с изменением состава жирных кислот, можно упомянуть работы, ставящие целью повышение или снижение содержания ненасыщенных жирных кислот в растительном масле. Интересными представляются эксперименты с петрозелиновой кислотой — изомером олеиновой кислоты, где двойная связь находится за шестым углеродным членом. Эта жирная кислота входит в состав масла кориандра и определяет его более высокую температуру плавления (33°С), в то время как при наличии олеиновой кислоты температура плавления составляет только 12°С. Предполагается, что после переноса генов, определяющих синтез петрозелиновой кислоты, в растения - продуценты растительного масла удастся производить диетический маргарин, содержащий ненасыщенную жирную кислоту.

Дальнейшее изучение специфики биохимического синтеза жирных кислот, по-видимому, приведет к возможности управлять этим синтезом с целью получения жирных кислот различной длины и различной степени насыщения, что позволит значительно изменить производство детергентов, косметики, кондитерских изделий, затвердителей, смазочных материалов, лекарств, полимеров, дизельного топлива и многого другого, что связано с использованием углеводородного сырья.

Полисахариды

Создание гербицидоустойчивых растений

Традиционные методы селекции создания сортов, устойчивых к гербицидам, очень, длительны и малорезультативны. Наиболее широко применяемый за рубежом… К числу наиболее распространенных гербицидов, используемых при обработке…

Создание растений, устойчивых к патогенам и вредителям

Одновременная передача нескольких локусов трудна даже методами генной инженерии, не говоря о классических методах селекции. Более простым является… В фитовирусологии широко известен феномен индуцированной перекрестной… Все большее внимание привлекают биологические средства борьбы с вредителями, обеспечивающие строгую избирательность…

Повышение устойчивости растений к стрессовым условиям

Пока можно отметить лишь косвенный подход для получения морозоустойчивых растений, основанный на генноинженерных манипуляциях с Pseudomonas…

Повышение эффективности биологической азотфиксации

Более реально использование генноинженерных методов для решения следующих задач: повышение способности ризобии колонизировать бобовые растения,… Первостепенной задачей генетической инженерии для повышения эффективности… Повышение эффективности процесса азотфиксации возможно применением генноинженерных приемов, основанных на увеличении…

Повышение эффективности фотосинтеза

Получение растений с новыми свойствами

Такой подход использован для получения трансгенных растений томатов с улучшенным качеством плодов. Вектор включал к-ДНК гена РG, контролирующего… Такой же подход можно применить для регулирования сроков созревания томатов, а…

Проблемы биобезопасности трансгенных растений

В большинстве случаев маркерные гены устойчивости к антибиотикам сейчас заменяют на гены устойчивости к гербицидам. Правда, применение… 2. Что касается возможной токсичности или аллергенности трансгенных растений,… 3. Проблема возможного ущерба для окружающей среды имеет несколько аспектов. Во-первых, существует опасение, что…

Критерии оценки риска ТР

Основные принципы, которыми руководствуются при оценке степени экологического риска ТР, заключаются в выяснение степени его сходства с аналогичным… 2. ТР должно быть генетически стабильным

– Конец работы –

Используемые теги: экспрессия, генетического, материала, трансгенных, растениях0.076

Если Вам нужно дополнительный материал на эту тему, или Вы не нашли то, что искали, рекомендуем воспользоваться поиском по нашей базе работ: Экспрессия генетического материала в трансгенных растениях

Что будем делать с полученным материалом:

Если этот материал оказался полезным для Вас, Вы можете сохранить его на свою страничку в социальных сетях:

Еще рефераты, курсовые, дипломные работы на эту тему:

Анализ газетного материала "Получили урок от чемпиона". Оценка композиционного построения материала
Композиция - одна из универсальных, основополагающих категорий, связывающих языковую форму с содержанием, а не чисто формальное явление. Пример необычной композиции - роман М. Ю. Лермонтова «Герой нашего времени».… От выбора композиции зависит, какое оно будет и как его поймут. Требования к композиции текстов массовой коммуникации…

Использование аутентичных материалов для формирования произноси-тельных навыков и обучения аудированию (на материале песен, стихов, рифмовок.)
В частности, практическая цель обучения трансформировалась следующим образом: обучение ино-странному языку - обучение иноязычной речи - обучение… Однако, основным противоречием современного этапа можно считать тот факт, что… Безусловно, сама проблема далеко не нова в то же время как межкультурный подход, в основе которого лежит концепт…

Значение растений в природе и жизни человека. Космическая роль зеленых растений
Ткань закономерно повторяющиеся комплексы клеток сходные по происхождению строению и приспособленные к выполнению одной или нескольких функций... Система образовательных тканей меристем... Верхушечные апикальные...

Значение растений в природе и жизни человека. Космическая роль зеленых растений
Ткань закономерно повторяющиеся комплексы клеток сходные по происхождению строению и приспособленные к выполнению одной или нескольких функций... Система образовательных тканей меристем... Верхушечные апикальные...

КРАТКИЙ КУРС СОПРОТИВЛЕНИЯ МАТЕРИАЛОВ 1.1. Задачи и методы сопротивления материалов
КРАТКИЙ КУРС СОПРОТИВЛЕНИЯ МАТЕРИАЛОВ... Часть Глава ВВЕДЕНИЕ...

Сырьё, материалы, способы изготовления упаковочных материалов и тары из металла для мясных консервов
Как видно из перечисленных функций, упаковка играет многоплановую роль, которая становится все более значимой для мирового рынка. Росту значения упаковки способствуют самые разные факторы, в том числе: 1)… Например, германская фирма «Бишоф и Кляйн» разработала специальную бумагу с покрытием для медицинских инструментов…

Керамические материалы. Определение. Виды керамических материалов
На сайте allrefs.net читайте: Керамические материалы. Определение. Виды керамических материалов.

ЛЕКЦИИ ПО МАТЕРИАЛОВЕДЕНЬЮ Тема: Общие сведения о материалах их значение. Классификация строительных материалов
Тема Общие сведения о материалах их значение Классификация строительных... Современно строительство требует эффективных строительных...

Основные положения хромосомной теории наследственности. Сцепление генов и кроссинговер. Генетические и цитологические доказательства кроссинговера. Генетические карты и принципы их построения.
Хромосомы ядерные структуры довольно плотной консистенции интенсивно окрашивающиеся основными красителями Хр теор наслед теория согласно... носителями наследственности являются гены находящиеся в хромосомах... каждый ген имеет в хромосоме определенное место локус гена...

Электротехнические материалы. ОСНОВНЫЕ СВОЙСТВА НЕЛИНЕЙНЫХ ДИЭЛЕКТРИКОВ, ПОЛУПРОВОДНИКОВ, ПРОВОДНИКОВ И МАГНИТНЫХ МАТЕРИАЛОВ
САНКТ ПЕТЕРБУРГСКИЙ...

0.042
Хотите получать на электронную почту самые свежие новости?
Education Insider Sample
Подпишитесь на Нашу рассылку
Наша политика приватности обеспечивает 100% безопасность и анонимность Ваших E-Mail
Реклама
Соответствующий теме материал
  • Похожее
  • По категориям
  • По работам