Практическое руководство Г.Г. Гончаренко, А.А. Сурков, А.Н. лысенко

Министерство образования Республики Беларусь

Учреждение образования

«Гомельский государственный университет

имени Франциска Скорины»

Г.Г. Гончаренко, А.А. Сурков, А.Н. лысенко

ГЕННАЯ ИНЖЕНЕРИЯ

Практическое руководство

К выполнению лабораторных работ

Гомель

УО «ГГУ им. Ф. Скорины»

УДК 577.21:575.113.1(075.8)

ББК 28.04я73

Г 657

 

Рецензенты:

В.Б. Гедых, ведущий научный сотрудник ГНУ «Институт Леса НАН Беларуси», доктор биологических наук;

А.В. Крук, начальник учебно-методического управления УО «ГГУ им. Ф. Скорины», доцент, кандидат биологических наук

 

 

Рекомендовано к изданию научно-методическим советом учреждения образования «Гомельский государственный университет имени Франциска Скорины»

 

Гончаренко, Г.Г.

В практическое пособие включены требования по выполнению лабораторных работ дисциплины «Генная инженерия». Руководство также включает темы пяти… Адресовано студентам специализации “Зоология” специальности 1 – 31 01 01 – 02…  

ББК 28.04я73

 

© Гончаренко Г.Г., Сурков А.А.,

Лысенко А.Н. 2012

 

© УО «ГГУ им. Ф. Скорины», 2012

ВВЕДЕНИЕ

Генная инженерия - технология получения новых комбинаций генетического материала с помощью проводимых in vitro манипуляций с молекулами нуклеиновых кислот и переноса созданных конструкций генов в реципиентный организм.

Методы генной инженерии успешно применяются для решения фундаментальных проблем биологии. С возникновением данной области биологической науки у исследователей появилась возможность изучать структуру, функционирование и регуляцию индивидуальных генов прокариотических и эукариотеческих организмов, а также целенаправленно проводить изменение их геномов.

Генная инженерия дала толчок зарождению нового направления биотехнологии - молекулярной биотехнологии. Технологии рекомбинантных ДНК позволили осуществлять конструирование штаммов-суперпродуцентов ферментов, антибиотиков, витаминов и других биомолекул, использующихся в пищевой и фармацевтической промышленности, для нужд сельского хозяйства, при проведении мероприятий по охране окружающей среды. В медицине методы генной инженерии получили применение для создания новых способов диагностики и лечения различных заболеваний, в том числе наследственных. Таким образом, генная инженерия является важным звеном в подготовке современных специалистов-биотехнологов.

Цель курса - сформировать у студентов теоретическое представление об основных методах генной инженерии и дать элементарные навыки постановки генно-инженерного эксперимента в ходе лабораторных занятии.

Задачи курса:

1) познакомить студентов с молекулярными основами наследственности используемыми в генной инженерии;

2) дать представление об основных методах и аппаратуре, применяемых для постановки генно-инженерных экспериментов;

3) научить студентов анализировать современные данные об использовании методов генной инженерии для создания трансгенных растений и животных с полезными свойствами.

Эффективность самостоятельной работы студентов целесообразно проверять в ходе текущего и итогового контроля знаний в форме устного опроса, коллоквиумов, тестового компьютерного контроля по темам и разделам курса. Для общей оценки качества усвоения студентами учебного материала рекомендуется использование рейтинговой системы.

ЗАНЯТИЕ 1

 

ТЕМА: Молекулярные основы наследственности

цель занятия: ознакомиться с молекулярными основами наследственности

Теоретическая часть

 

Всю первую половину ХХ века ученые считали, что наследственная информация о развитии всех признаков и свойств организма заключена в белках. Однако экспери­менты, проведенные на микроорганизмах позволили установить, что гене­тическая информация сосредоточена в нуклеиновых кислотах.

Доказательства роли ДНК в наследственности

Только в 1944 г. О. Эвери, К. Мак-Леод и М. Мак-Карти получили убедительные доказательства того, что трансформирующим фак­тором является… Еще одним серьезным доказательством генетической роли ДНК были эксперименты А.…

Состав и строение нуклеиновых кислот

К 30-м годам ХX века П. Левен с сотрудниками установил, что азотистое основание, углевод и фосфорная кислота соединены в блоки – нуклеотиды (рис.2),… В 40-50 гг. ХХ века Э. Чаргаф разработал точные методы определения количества… На основе рентгеноструктурного анализа М. Уилкинс и Р. Франклин в 1953 г. получили данные, указывающие на то, что ДНК…

Репликация ДНК

В 1958 г М. Мезелсон и Ф. Сталь в блестящем эксперименте убедительно доказали именно полукон-сервативный характер репликации ДНК предсказанный… Дальнейшие исследования показали, что процесс полуконсервативной… ДНК-полимераза, осуществляет процесс репликации в направлении 5'-3', она способна присоединять нуклеотиды только к…

Транскрипция ДНК

РНК отличается от ДНК тем, что у нее углеводом является рибоза вместо дезоксирибозы. Кроме того, вместо нуклеотида тимина у нее урацил (рис. 7). И… В 1962 г. Э. Волкин и Л. Астрохан обнаружили, что при синтезе белка в клетках…     Транскрипция осуществляется с помощью фермента ДНК-зависимой РНК-полимеразыи всегда…

Трансляция

Транспортные РНК. Роль тРНК заключается в том, что они переносят аминокис­лоты к рибосомам и участвуют в процессе синтеза белка. Транспортные РНК,… Рибосомные РНК. Размер рибосомных рРНК составляет 120–3100 нуклеотидов. Они… Рибосомы являются клеточными органеллами, на которых протекает процесс биосинтеза белка. В период синтеза белка…

Белки, их структура и функции

Белки выполняют также огромное количество других функций. Так структурные функции осуществляют – коллаген (хрящи, сухожилия), кератин (перья,… Белки – это полимеры мономерами, которых являются аминокислоты. В состав…

Ключевые слова и понятия

1. Что такое молекулярные основы наследственности? 2. Строение ДНК и РНК. 3. Что такое гены?

Лабораторная работа

Задание 2. Для самоконтроля решить тест.В каждом вопросе выберите одно правильное утверждение:

Тест

1. Явление трансформации открыл:

а) Г. Мендель в 1900 г.

б) Ф. Гриффитс в 1928 г.

 

2. Вирулентный штамм - это штамм, от которого организм:

а) погибает.

б) остается жив.

 

3. Streptococcus pneumonia это:

а) штамм вызывающий заболевание пневманией.

б) безвредный вирус, не вызывающий заболевание.

4. Трансформирующим фактором является:

а) мышь.

б) ДНК.

5. Дезоксирибонуклеиновая кислота:

а) носитель наследственной информации.

б) инактивирующий фермент.

6. «Нуклеин»:

а) клейкое вещество.

б) нуклеиновая кислота.

7. Молекула ДНК:

а) высокомолекулярный полимер, состоящий из четырех дезоксирибонуклеотидов.

б) низкомолекулярный мономер, состоящий из двух цепочек дезоксирибонуклеотидов.

8. Азотистые основания:

а) компоненты нуклеиновой кислоты.

б) компонентыфосфорной кислоты.

9. Аденин, гуанин:

а) пуриновые основания.

б) пиримидиновые основания.

10. Цитозин, тимин:

а) пуриновые основания.

б) пиримидиновые основания.

11. Нуклеотид:

а) соединение азотистого основания, углевода и фосфорная кислота.

б) ядро.

12. Дезоксирибоза:

а) азотистое основание ДНК.

б) углеводный компонент ДНК.

13. Рибоза:

а) азотистое основание ДНК.

б) углеводный компонент ДНК.

14. Рибонуклеиновая кислота (РНК):

а) цитоплазматическая нуклеиновая кислота, которая в качестве углевода содержит рибозу.

б) двух цепочечная молекула, которая в качестве углевода содержит дезоксирибозу.

15. Правила Чаргаффа:

а) (А+Г=Т+Ц) (А=Т) (Г=Ц).

б) (А+Т=Г+Ц) (А=Ц) (Г=Т).

16. Двойная спираль:

а) две полинуклеотидные комплементарные цепочки ДНК.

б) две полинуклеотидные комплементарные цепочки РНК.

17. Принцип комплементарности:

а) А-Т и Г-Ц.

б) А-Г и Т-Ц.

18. Репликация:

а) процесс точного самовоспроизведения молекул нуклеиновых кислот.

б) разрезающие ДНК по определенным нуклеотидным последовательностям.

19. Полуконсервативный принцип:

а) материнская молекула ДНК состоит из двух «старых» цепей.

б) дочерняя молекула ДНК состоит из одной «старой» и одной «новой» цепей.

20. Точка инициации (ori):

а) место начала репликациимолекул ДНК.

б) место окончания репликациимолекул ДНК.

21. Репликационная вилка:

а) столовый прибор.

б) одноцепочечные участки ДНК, которые становятся матрицами для репликации.

22. Геликаза:

а) фермент, под влияниемкоторого цепи ДНК разъединяются (раскручиваются) в точке инициации репликации.

б) мутаген, под влияниемкоторого цепи ДНК разрываются.

23. Белки SSBP:

а) не позволяют одноцепочечным участками ДНК вновь соединиться в двойную спираль.

б) соединяют одноцепочечные участки ДНК в двойную спираль.

24. Топоизомераза (ДНК-гираза):

а) снимает возникающую суперскрученность и напряжение в нераскрученной части ДНК репликационной вилки (ДНК-гираза у прокариот).

б) маркирует ДНК (ДНК-гираза у эукариот).

25. ДНК-полимераза:

а) осуществляет процесс репликации в направлении 3'-5'.

б) осуществляет процесс репликации в направлении 5'-3'.

26. Праймаза:

а) РНК-полимераза.

б) ДНК-полимер.

27. РНК-праймер:

а) длинный (~1000 нуклеотидов) фрагмент РНК.

б) короткий (~10 нуклеотидов) фрагмент РНК.

28. Лидирующая цепь:

а) начинаетсяна материнской цепи, идущей от точки инициации в направлении 3'-5' и идет непрерывно в виде сплошной линии.

б) начинаетсяна дочерней цепи, идущей от точки инициации в направлении 5'-3' и идет прерывисто.

29. Фрагменты Оказаки:

а) отдельные короткие фрагменты (200-2000 нуклеотидов).

б) фрагменты в виде сплошной линии.

30. Запаздывающая цепь:

а) первая цепь, синтез на которой идет в направлении 3'-5'.

б) вторая цепь, синтез на которой идет в направлении 5'-3'.

31. Лигаза:

а) фермент, соединяющий в общую полинуклеотидную цепочку ДНК после репликации.

б) белок, разъединяющий в общую полинуклеотидную цепочку ДНК после репликации.

32. Урацил:

а) азотистое основание РНК.

б) азотистое основание ДНК.

33. Информационная РНК (и-РНК):

а) активный участник репликации.

б) активный участник трансляции.

34. Транскрипция:

а) транскрибирование с ДНК в нуклеотидную последовательность короткоживущих и-РНК.

б) денатурация белка.

35. РНК-полимеразы:

а) ферменты, осуществляющие транскрипцию в направлении 5'-3'.

б) ферменты, осуществляющие трансляцию в направлении 3'-5'.

36. Матричная цепь 3'-5':

а) цепь ДНК, служит для синтеза и-РНК.

б) цепь РНК, служит для синтеза ДНК.

37. Промотор:

а) участок гена инициирующий трансляцию.

б) участок гена инициирующий транскрипцию.

38. «ТАТА-бокс»:

а) участок промотора перед геном.

б) геном боксёра.

39. Интрон:

а) не содержащие ин­формацию отрезки ДНК в структурной части гена у эукариот.

б) содержащие ин­формацию отрезки ДНК в структурной части гена у эукариот.

40. Экзон:

а) не содержащие ин­формацию отрезки ДНК в структурной части гена у эукариот.

б) содержащие ин­формацию отрезки ДНК в структурной части гена у эукариот.

41. Первичный транскрипт (про-мРНК):

а) РНК содержащая интроны и экзоны.

б) РНК содержащая только интроны.

42. Сплайсинг:

а) процесс удаления из про-мРНК экзонов.

б) процесс удаления из про-мРНК интронов.

43. КЭП (метилированный гуанин):

а) присоединяется перед выходом из ядра к начальной (5') части и-РНК.

б) отсоединяется перед входом в ядро с начальной (5') части и-РНК.

44. Поли-А хвост:

а) примерно 200 остатков аденина присоединяется к 3'-концу и-РНК.

б) примерно 20 остатков аденина присоединяется к 5'-концу и-РНК.

45. Зрелая и-РНК:

а) экзоны, КЭП и поли-А хвост.

б) интроны, экзоны, КЭП и поли-А хвост.

46. Алкаптонурия:

а) приобретённое ненаследственное заболевание, при котором организм расщепляет гомогентизиновую кислоту, что приводит к серьезным нарушениям метаболизма.

б) врожденное наследственное заболевание, при котором организм не расщепляет гомогентизиновую кислоту, что приводит к серьезным нарушениям метаболизма.

47. Один ген – один белок:

а) закономерность, при которой, мутация приводит к потере метаболической активности только одного фермента (белка).

б) закономерность, при которой, мутация приводит к потере метаболической активности нескольких ферментов (белков).

48. Генетический код:

а) система записи наследственной информации в молекулах нуклеиновых кислот.

б) система записи генетических символов.

49. Триплет:

а) три рядом стоящих нуклеотида.

б) комбинация из трех последовательно расположенных ферментов в молекуле белка.

50. Кодон:

а) три рядом стоящих аминокислоты, кодирующих один нуклеотид.

б) три рядом стоящих нуклеотида, кодирующих одну аминокислоту.

51. Стоп-кодон:

а) тринуклеотид в информационной РНК, сигнализирующий об окончании синтеза полипептида и освобождении полной полипептидной цепи от рибосомы.

б) нуклеотид в информационной РНК, сигнализирующий о начале синтеза полипептида.

52. Основные свойства генетического кода:

а) обобщенность, консервативность, моногенность, универсальность.

б)триплетность, неперекрываемость, колинеарность, вырожденность, универсальность.

53. Трансляция:

а) процесс биосинтеза белка по матрице иРНК, который протекает на рибосомах.

б) процесс биосинтеза белка по матрице кДНК, который протекает в ядре.

54. Транспортная РНК (т-РНК) :

а) переносят аминокис­лоты к рибосомам и участвуют в процессе синтеза белка.

б) переносят нуклеотиды к рибосомам и участвуют в процессе синтеза ДНК

55. Акцепторный триплет ЦЦА:

а) к нему присоединяется специфическая аминокислота.

б) специфический триплет, с помощью которого тРНК «узнает» соответствующий комплементарный кодон в иРНК.

56. Антикодон:

а) к нему присоединяется специфическая аминокислота.

б) специфический триплет, с помощью которого тРНК «узнает» соответствующий комплементарный кодон в иРНК.

57. Рибосома:

а) клеточные органеллы, на которых протекает процесс биосинтеза белка.

б) неклеточные органеллы, на которых протекает процесс биосинтеза липидов.

58. Рибосомная РНК (р-РНК):

а) служит каркасом рибосом, и способствуют первоначальному связыванию иРНК с рибосомой в ходе биосинтеза белка.

б) переносят аминокис­лоты к рибосомам и участвуют в процессе синтеза белка.

59. Единица Сведберга (S) характеризует:

а) скорость седиментации при центрифугировании.

б) размер субъединиц рибосом.

60. Аминоацил-тРНК-синтетаза:

а) фермент, активирующий свободные аминокислоты и присоединение их к тРНК.

б) белок, дезактивирующий свободные аминокислоты и присоединение их к тРНК.

61. Аминоацил-тРНК (аа-тРНК):

а) образуется в ре­зультате разрыва связи аминоацилтРНК-синтетазы с определенной аминокислотой, а затем дезактивированная с помощью АТФ аминокислота присоединя­ется к аденину акцепторного триплета ЦЦА тРНК.

б) образуется в ре­зультате связи аминоацилтРНК-синтетазы с определенной аминокислотой, а затем активированная с помощью АТФ аминокислота присоединя­ется к аденину акцепторного триплета ЦЦА тРНК.

62. Инициация:

а) присо­единение малой субъединицы рибосомы к соответствующему цент­ру связывания на иРНК.

б) отсо­единение малой субъединицы рибосомы с соответствующего цент­ра связывания на иРНК.

63. Кодон инициации АУГ:

а) сигнал инициации трансляции.

б) сигнал инициации транскрипции.

64. Элонгация:

а) удлинение нуклеотидной цепи путем добавления новых нуклеотидов.

б) укорочение нуклеотидной цепи путем убавления нуклеотидов.

65. Пептидилтрансфераза ­­- это фермент, который своей карбоксильной груп­пой:

а) соединяет предшествующую аминокислоту с аминогруппой вновь пришед­шей аминокислоты.

б) отсоединяет вновь пришед­шую аминокислоту.

66. Аминоацильный центр:

а) малая субъединица рибосомы.

б) большая субъединица рибосомы.

67. Пепти­дильный центр

а) малая субъединица рибосомы.

б) большая субъединица рибосомы.

68. Терминация:

а) блокирует дальнейшую элонгацию цепи.

б) активизирует дальнейшую элонгацию цепи.

69. Пептидная связь

а) –СО–NH–.

б) –СООН–.

70. Четыре структуры белка:

а) первичная, вторичная третичная и четвертичная.

б) А, Т, Г, Ц.

71. Четвертичная структура белка:

а) несколько полипептидных цепей с третичной структурой объединенных в единый комплекс.

б) Четыре полипептидные цепей с первичной структурой объединенных в единый комплекс.

 

Литература

1. Айала Ф., Кайгер Дж. Современная генетика: Пер. с англ.: В 3 т. – М.: Мир, 1988., ил.

2. Жимулев И.Ф. Общая и молекулярная генетика: Учеб. пособие. – Новосибирск: Изд-во Новосиб. ун-та: Сиб. унив. изд-во, 2002. – 459 с., ил.

3. Картель Н.А. Биоинженерия: методы и возможности. Мн.: Ураджай, 1989.- 143 с., ил.

4. Методы молекулярной генетики и генной инженерии/ Мазин А.В. и др. – Новосибирск: Наука. 1990. – 248 с.

5. Гончаренко Г.Г. Основы генетической инженерии. Гомель: ГГУ, 2003. – 118с.

6. Уотсон Дж., Туз Дж., Курц Д. Рекомбинантные ДНК. Краткий курс: Пер. с англ.- М.: Мир, 1986.- 288 с., ил.

7. Льюин Б.Гены: – Пер. с англ. – М.: Мир, 1987. – 544 с., ил.

8. Modern genetic analysis.Griffiths et al. – Freeman and company. New York. 1999. – 675 p.

9. Principles of genetics.Snustad P., Simmons M. / Second edition – John Wiley & Sons. New York. 1999. – 876 p.

10. An introduction to genetic analysis.Griffiths et al. – Freeman and company. New York. 2000. – 730 p.